Syftet med denna studie var att utvärdera i vitro lipidsänkande läkemedelseffekter i modulerande morfologi av kolesterol partiklar. Jämförelsen av lipidsänkande läkemedel visade variationer i deras effekt i modulerande de morfologiska egenskaperna av kolesterol partiklar.
Behandling av dyslipidemi patienter med lipidsänkande läkemedel leder till en betydande minskning av low-density lipoprotein (LDL) nivå och en låg till måttlig nivå av ökning av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol i plasma. Dock är en möjlig roll av dessa läkemedel att förändra morfologi och kolesterol partiklarnas bristfällig. Här beskriver vi i vitro utvärdering av lipidsänkande läkemedelseffekter i modulerande morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar med metoden plack array i kombination med imaging flödescytometri. Bild analyser av kolesterol partiklarna indikerade att lovastatin, simvastatin, ezetimib och atorvastatin inducerar bildandet av både klotformig och linjära strand-formade partiklar, medan niacin, fibrater, fluvastatin och rosuvastatin framkalla den bildandet av endast klotformig-formade partiklar. Nästa, renat mycket low-density lipoprotein (VLDL) och LDL-partiklar som inkuberas med dessa läkemedel visade förändringar i morfologi och bild textur av kolesterol partiklar subpopulations. Dessutom visade screening av 50 serumprover förekomst av en högre nivå av linjära formade HDL kolesterol partiklar hos försökspersoner med dyslipidemi (genomsnitt 18,3%) jämfört med åldersmatchade normala (i genomsnitt 11,1%) proverna. Vi observerade också betydande variationer i lipidsänkande läkemedelseffekter på att minska linjära formade LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i serumprov. Dessa fynd tyder på att lipidsänkande läkemedel, utöver sin cell-medierad hypolidemiska effekter, direkt kan modulera morfologi av kolesterol partiklar av en icke-enzymatiska verkningsmekanism. Resultaten av dessa resultat har potential att informera diagnos av åderförkalkning och förutsäga optimal lipidsänkande terapi.
Ett flertal kliniska studier har visat positiva effekter av lipidsänkande läkemedel minska plasmanivåerna av low-density lipoprotein (LDL) kolesterol och en låg till måttlig nivå ökning av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol, som förhindrar både primära och sekundära incidenser av åderförkalkning-relaterade kardiovaskulära händelser1,2,3,4,5. Statiner, en grupp av HMG-CoA reduktas enzym-hämmare, blockera endogen kolesterolsyntes i levern som i sin tur leda till lägre cirkulerande nivåer av LDL-kolesterol i blodet6,7. Likaså medieras den lipidsänkande effekt av niacin av dess direkta och noncompetitive hämning av hepatocyte diglyceridolja acyltransferase-2, en nyckel leverenzym som är inblandade i triglycerid syntes8. Jämförelsevis, minskar ezetimib plasmanivå av LDL genom att begränsa absorptionen av exogent kolesterol genom bindning till Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) protein ligger i epitelceller i tunntarmen9. Fenofibrat, en annan lipidsänkande läkemedel, minskar avsevärt plasmakoncentrationerna av triglycerider och även måttligt minskar LDL-kolesterol genom de peroxisome proliferator-aktiverade receptorer väg10. Omega-3 fettsyra uppges dessutom ha anti-aterosklerotisk effekt på grund av dess förmåga att sänka plasmanivåerna av LDL11.
De lipidsänkande läkemedel, utöver sin primära effekt på att sänka LDL-kolesterol, har ett antal fördelaktiga pleiotropiska effekter inklusive att öka HDL, förbättra endothelial funktioner, minska inflammation och hämma trombocyter aggregeringar12,13,14. Den underliggande mekanismen av dessa läkemedel öka HDL kolesterol partiklar och ändra deras strukturella egenskaper är dock inte helt klarlagda. Eftersom dessa läkemedel är allmänt föreskrivna för att behandla åderförkalkning kardiovaskulära sjukdomar (hjärtklaffarna), är det viktigt att ytterligare undersöka deras möjliga roller för att bestämma morfologiska egenskaper och distribution av lipid partiklarna. Den mänskliga plasma lipidome består av cirka 600 olika lipider och 22 olika molekylära typer av kolesterol som finns i olika storlekar, former, tätheter och kompositioner15,16,17 . Analytiska metoder såsom ultra-centrifugering, NMR och gradient gelelektrofores används för att karakterisera LDL och HDL partiklar och deras och18,19. Tillämpning av dessa metoder är dock begränsat till studier syftar till att fastställa effekten av läkemedel i modulerande morfologi och montering av lipid partiklarna. Flöde cytometer baserat plack matrisen är en funktionell biokemiska test utvecklat för upptäckt och visualisering av serum härrör lipid och amyloid plack partiklar20. Fördelarna med in vitro- imaging metod som beskrivs i denna studie aktivera identifiering av lipid-modulerande läkemedelseffekter att förändra morfologi och partiklarnas kolesterol i buffert-och serumprover.
I allmänhet, bestäms distribution och funktionella egenskaper av VLDL, LDL och HDL kolesterol partiklar i blodcirkulationen främst av metabola, genetisk, epidemiologisk, mobilnät och plasma faktorer22,23. I den aktuella studien, att undersöka effekterna av lipidmodifierande droger i bufferten avslöjade att starkt lipofila läkemedel såsom ezetimib, lovastatin, simvastatin och atorvastatin inducerade en högre nivå komplexitet på morfologin av kolesterol partiklar jämfört med den lägre nivå effekten som observerats med mycket hydrofila rosuvastatin och fluvastatin droger. Dessa resultat är bra överens med vår tidigare studie som beskriver en icke-enzymatiska mekanism baserat effekt av statiner i modulerande LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i buffert och serum prover21. Således visade resultaten från föreliggande studie en icke-enzymatiska verkningsmekanismen för ezetimib, niacin, fibrat, och omega-3 fettsyra droger som kan spela en direkt roll i modulerande kolesterol partiklar bildas. Det är möjligt att interaktioner mellan läkemedel och kolesterol aggregat leder till montering av stor storlek kolesterol partiklar som är 2-60 µm2, uppvisar klotformig och linjära strand morfologier.
Förutom föreslå de resultat som erhålls med hjälp av renat lipoprotein partiklar interaktioner mellan kolesterol aggregat och plasma faktorer inklusive VLDL, LDL och HDL proteiner som kan förändra kompositioner och morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar. Drogen behandlingsresultaten med renat lipoprotein partiklar anges en högre nivå drogen effekt på bildandet av VLDL-partiklar jämfört med deras effekten som observerats på LDL kolesterol partiklar bildas. Lovastatin, simvastatin och ezetimib droger användes som pro-droger och deras doser i analyserna kan vara högre än de fysiologiska koncentrationerna.
Intressant, formade screening av serumprover visade variationer av drogen effekt på att förändra profilerna av VLDL, LDL och HDL kolesterol partiklar bildas, särskilt deras effekt på formationerna av linjära LDL och HDL partiklar. Dessa läkemedel inducerad minskning på linjära formade LDL och HDL kolesterol partiklar bildas i både dyslipidemi och åldersmatchade normala serumprov. De drog effekter som observerats på att minska linjära formade partiklar bildandet var högre i simvastatin, ezetimib, lovastatin och niacin. Identifiering av kolesterol partiklar med klotformig och linjära strand morfologier i de normala och dyslipidemi serumprov antyder att partiklar med liknande morfologier kan bilda i vivo förhållanden. Tidigare studier har identifierat förekomst av skivan och nål-liknande kolesterolkristaller i de aterosklerotiska plack av mänskliga och ApoE– /- och Receptorn– / – möss-modeller24,25,26 ,27,28.
HDL partiklar cirkulerar i blodet finns som en heterogen blandning och nivån av små och stora HDL partiklar tillsammans med funktionell aktivitet är viktiga faktorer för att utöva sin cardio-skyddande effekt via omvänd kolesterol transport väg29,30. Nyligen genomförda studier har belyst vikten av att identifiera HDL kolesterol partikel och för att belysa deras roll i flera biologiska funktioner såsom kolesterol efflux, anti-inflammatoriska, anti-trombotisk och antioxidativ31 . Dessutom har ett antal studier rapporterade effekten av lipidsänkande terapi för att öka en låg till måttlig nivå av HDL i plasma1,5,21. Således ger resultaten från denna studie nya insikter på morfologiska egenskaper av kolesterol partiklar. Särskilt, upptäckt av en högre nivå av linjära formade HDL kolesterol partiklar i serumprover av dyslipidemi ämnen föreslår att de kan vara den pålitliga biomarkören för både diagnos och utvärdera effekterna av lipidmodifierande droger patienter. Ytterligare krävs undersökning dock med stora kliniska prover för att bättre förstå kolesterol partiklar med olika morfologier och deras koppling till CVD.
I plack array analys för att undersöka drogen effekten på montering av kolesterol partiklar, vi använt 2 µg av fluorescens märkt kolesterol aggregat och 5 µgof varje drog eftersom: (1) droger kompetitivt binda till både fluorescens märkt kolesterol och endogena lipider närvarande i serumprover; (2) från varje prov förvärvade vi 5.000 till 10.000 kolesterol partiklar som är monterade i stora storlekar och former allt från ~ 2-60 µ2; (3) vi observerade ett brett varianter av narkotika svar bland serumprover inkuberas med droger (doser 300 ng 5 µg) och ~ 1-5% av dem inkuberas med höga doser visade inga påvisbara förändringar i profilen för kolesterol partiklar bildas. och (4) samspelet mellan kolesterol aggregat och lipidsänkande läkemedel medieras av en icke-enzymatisk process. Koncentrationerna av de reagens som används i analysen kan därför vara högre än deras fysiologiska nivåer.
Sammanfattningsvis har vi framgångsrikt visat fördelarna med en in vitro- imaging metod som beskrivs i denna studie för att fastställa effekten av ett brett spektrum av lipidsänkande läkemedel på modulerande morfologi och sammansättning av kolesterol partiklar. Metoden att visualisera och kvantifiera morfologi av lipid partiklar genom att anställa en konstellation av bild analys algoritmer kan hjälpa båda diagnos av åderförkalkning och att utvärdera resultaten av lipidsänkande behandling till patienter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av en Plaxgen forskning bidrag till SM (PLX-1008). Vi tackar Palo Alto medicinsk forskning stiftelsen Research Institute för att samla serumprover från åderförkalkning försökspersoner under IRB godkännande.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |