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Bioengineering

साइट-अस्थि Morphogenetic प्रोटीन 2 के निर्देश के स्थिरीकरण के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान से ठोस सतहों

Published: March 29, 2018 doi: 10.3791/56616
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1,2, 1,2
1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, 2Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, 3Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, 4Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

Summary

अस्थि Morphogenetic प्रोटीन 2 (BMP2) के साथ मैगनीज भौतिक गैर संघ हड्डी भंग चंगा करने के लिए एक नई चिकित्सीय रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया गया है । साइड कारक के एक बेकाबू रिलीज से उत्पंन प्रभाव को दूर करने के लिए, हम साइट के लिए एक नई रणनीति का प्रस्ताव-सीधे कारक मैटीरियल, इस प्रकार बेहतर osteogenic क्षमताओं के साथ सामग्री बनाने ।

Abstract

गैर चिकित्सा लंबी अस्थि दोषों के उपचार के लिए अलग चिकित्सीय रणनीतियों की गहन जांच की गई है । वर्तमान में इस्तेमाल किया उपचार कई सीमाएं है कि osteogenic वृद्धि कारकों, जैसे अस्थि morphogenetic प्रोटीन (BMPs) के साथ संयोजन में करने के लिए उपयोग के लिए नेतृत्व किया है मौजूद । आमतौर पर इस्तेमाल किया अवशोषण या encapsulation तरीकों BMP2 के ऊपर अर्थ का उपसर्ग शारीरिक मात्रा की आवश्यकता, आम तौर पर एक तथाकथित प्रारंभिक फट रिलीज प्रभाव है कि कई गंभीर प्रतिकूल दुष्प्रभाव भड़काती में जिसके परिणामस्वरूप । इन समस्याओं को दूर करने के लिए एक संभव रणनीति covalently जोड़ी को प्रोटीन पाड़ करने के लिए किया जाएगा । इसके अलावा, युग्मन एक साइट विशेष तरीके से किया जाना चाहिए ताकि एक reproducible उत्पाद परिणाम की गारंटी । इसलिए, हमने एक BMP2 वैरिएंट बनाया, जिसमें एक कृत्रिम अमीनो अम्ल (propargyl-L-lysine) को BMP2 प्रोटीन के परिपक्व भाग में codon उपयोग विस्तार (BMP2-K3Plk) द्वारा पेश किया गया । BMP2-K3Plk तांबे catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) के माध्यम से कार्यात्मक मोती के लिए युग्मित किया गया था । युग्मित BMP2-K3Plk की जैविक गतिविधि इन विट्रो में सिद्ध हुई और BMP2-K3Plk-कार्यात्मक मोतियों की osteogenic गतिविधि कोशिका आधारित परख में सिद्ध हुई । C2C12 कोशिकाओं के साथ संपर्क में कार्यात्मक मोती, मनका के स्थानीय रूप से प्रतिबंधित निकटता में alkaline फॉस्फेट (ALP) अभिव्यक्ति प्रेरित करने में सक्षम थे । इस प्रकार, इस तकनीक द्वारा, कार्यात्मक पाड़ों का उत्पादन किया जा सकता है कि एक osteogenic वंश की ओर कोशिका भेदभाव को ट्रिगर कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, कम BMP2 खुराक साइट के नियंत्रित उन्मुखीकरण के कारण पर्याप्त हैं-युग्मित BMP2 निर्देशित. इस विधि के साथ, BMPs हमेशा उपयुक्त अभिविंयास में सेल की सतह पर उनके रिसेप्टर्स के संपर्क में हैं, जो मामला नहीं है अगर कारक गैर के माध्यम से युग्मित कर रहे है साइट-युग्मन तकनीक का निर्देशन किया । उत्पाद परिणाम अत्यधिक नियंत्रणीय है और, इस प्रकार, सजातीय गुणों के साथ सामग्री में परिणाम, महत्वपूर्ण आकार अस्थि दोषों की मरंमत के लिए अपनी प्रयोज्यता में सुधार ।

Introduction

अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग और अस्थि पुनर्जनन के अंतिम लक्ष्य गैर संघ भंग के आम उपचार के दौरान होने वाले नुकसान और सीमाओं को दूर करने के लिए है । ऑटो या एलो-ट्रांसप्लांटेशन मुख्य रूप से वर्तमान चिकित्सा रणनीतियों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, भले ही वे दोनों कई कमियां है । आदर्श हड्डी भ्रष्टाचार osteoinduction के रूप में के रूप में अच्छी तरह से osteoconduction, हड्डी में भ्रष्टाचार के osteointegration के लिए अग्रणी द्वारा आस्टियोजेनेसिस प्रेरित करना चाहिए । आजकल, केवल ऑटो प्रत्यारोपण "सोने के मानक के रूप में माना जाता है" के बाद से यह एक आदर्श हड्डी भ्रष्टाचार के सभी विशेषताओं प्रदान करता है । दुर्भाग्य से, यह भी इस तरह के लंबे समय सर्जरी के रूप में महत्वपूर्ण नकारात्मक पहलुओं, प्रस्तुत करता है, और एक दूसरा आघात साइट है कि आम तौर पर अधिक जटिलताओं (जैसे, पुराने दर्द, रक्तगुल्म संरचनाओं, संक्रमण, कॉस्मेटिक दोष, आदि) जरूरत पर जोर देता । Allogenic भ्रष्टाचार, दूसरी ओर सभी सामांय पहलुओं के लिए उपइष्टतम विशेषताएं है1। वैकल्पिक अस्थि भ्रष्टाचार प्रौद्योगिकियों पिछले कुछ वर्षों में सुधार किया गया है, उद्देश्य पाड़ों कि osteoinductive, osteoconductive, संगत कर रहे है उत्पादन के साथ, और bioresorbable । के बाद से कई सामग्री इन osteogenic विशेषताओं के सभी नहीं दिखा है, विभिंन विकास कारकों, मुख्य रूप से BMP2 और BMP7, आदेश में विशेष पाड़2की osteogenic क्षमता में सुधार करने के लिए शामिल किया गया है ।

एक आवश्यक कसौटी के रूप में, इस तरह के विकास कारक वितरण प्रणाली समय के साथ एक नियंत्रित खुराक रिहाई प्रदान करना चाहिए ताकि सेल भर्ती और लगाव, सेल के विकास, और angiogenesis जैसे आवश्यक घटनाओं की सुविधा के लिए । हालांकि, BMPs के साथ-साथ अन्य osteogenic ग्रोथ फैक्टर्स को सामान्यतः मैटीरियल नॉन-covalently3किया गया है । फंसाने और सोखना तकनीक एक प्रारंभिक फट जारी है, जो vivo में गंभीर नुकसान की ओर जाता है के कारण प्रोटीन के ऊपर अर्थ का उपसर्ग शारीरिक मात्रा के उपयोग की आवश्यकता होती है, आम तौर पर हड्डी के विकास उत्प्रेरण द्वारा आसपास के ऊतकों को प्रभावित, osteolysis, सूजन, और सूजन4. इस प्रकार, समय की लंबी अवधि के लिए वितरण स्थल पर विकास कारकों की अवधारण आबंध स्थिरीकरण तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है । रासायनिक संशोधित BMP2 (succinylated5, acetylated6 या biotinylated7), इंजीनियर heterodimers8, या BMP2 व्युत्पंन oligopeptides9 डिजाइन किया गया है और से संबंधित सीमाओं को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया अवशोषण. हालांकि, इन के निर्माण की जैव गतिविधि पूर्वानुमान के बाद से व्यवस्था संभावित सेलुलर रिसेप्टर्स के लिए मैटीरियल ligand के बंधन को रोकता नहीं है । जैसा कि पहले दिखाया गया है, यह आवश्यक है कि सभी चार रिसेप्टर चेन सक्रिय ligand रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स के गठन में शामिल मैटीरियल BMP2 के साथ बातचीत के क्रम में पूरी तरह से सभी बहाव संकेतन कैस्केडिंग10को सक्रिय करने के लिए ।

जैव सक्रियता, स्थिरता के संदर्भ में सीमाओं के साथ एक सजातीय उत्पाद परिणाम की समस्याओं को दूर करने के लिए, और स्थिर कारक के गैर-उपलब्धता, हम एक बीएमपी covalently एक साइट निर्देशित तरीके से बाध्यकारी मचान में सक्षम संस्करण बनाया है । इस संस्करण, BMP2-K3Plk, एक कृत्रिम एमिनो एसिड जो आनुवंशिक codon विस्तार द्वारा शुरू की गई थी शामिल है11। इस संस्करण सफलतापूर्वक पाड़ एक आबंध युग्मन रणनीति का उपयोग करते हुए अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए जोड़ा गया है ।

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Protocol

1. BMP2 वैरिएंट का उत्पादन BMP2-K3Plk

  1. BMP2 की क्लोनिंग-साइट द्वारा K3Plk-निर्देशित mutagenesis का उपयोग करते हुए पीसीआर 12
    1. बढ़ाना मानव परिपक्व BMP2 (hmBMP2) से एक p25N-hmBMP2 सदिश ( सामग्री की तालिकादेखें) एक आगे प्राइमर के साथ (5 ' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3 ') और एक रिवर्स प्राइमर (5 ' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3 ') एक एंबर रोकने codon शुरू ( टैग) BMP2 ´ एस परिपक्व भाग के पहले lysine की स्थिति में । पीसीआर रिएक्शन का उपयोग ३३.५ µ एल ऑफ एच2O, 10 µ l के पीसीआर अभिक्रिया मिश्रण का प्रयोग करते हुए, 1.5 µ l के 10 µ m dNTP शेयर हल, 1.5 µ l के फॉरवर्ड प्राइमरी (10 pmol/µ l), 1.5 µ l के रिवर्स प्राइमर (10 pmol/µ l), 1 µ l के p25N-hmBMP2 (10 एनजी/µ l) , और डीएनए पोलीमरेज़ के 1 µ l ( सामग्री की तालिकादेखें) एक थर्मल साइकिल चालक में (विकार पर 95 ° c 5 मिनट के लिए, 1 मिनट के लिए 95 ° c पर विकार के 30 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव, और 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार 10 मिनट के लिए) ।
    2. निर्माता सिफारिशों के बाद एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद को शुद्ध ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम NdeI के साथ पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट 45 मिनट के लिए 16 µ l का उपयोग कर H2O, पाचन बफर के 3 µ l, 10 µ एल के डीएनए (20 एनजी/µ एल), और 1 µ एल के प्रतिबंध एंजाइम. हीट-5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम को निष्क्रिय । के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध एंजाइम BamHI के साथ पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट 1 h के 16 µ l का उपयोग कर h2O, पाचन बफर के 3 µ l, 10 µ l के डीएनए (20 एनजी/µ एल), और 1 µ एल के प्रतिबंध एंजाइम. 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर हीट-निष्क्रिय एंजाइम ।
    4. डाइजेस्ट pET11a-pyrtRNA वेक्टर NdeI के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 और 45 मिनट के लिए का उपयोग 16 µ एल के एच2O, 3 µ l of पाचन बफर, 10 µ एल के डीएनए (20 एनजी/µ एल), और 1 µ एल के प्रतिबंध एंजाइम । 5 मिनट के लिए 65 ° c पर हीट-निष्क्रिय । pET11a-pyrtRNA वेक्टर BamHI के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 16 µ एल का उपयोग कर के एच2O, पाचन बफर के 3 µ l, 10 µ एल के डीएनए (20 एनजी/µ एल), और 1 µ एल के प्रतिबंध एंजाइम । 5 मिनट के लिए 80 ° c पर हीट-निष्क्रिय ।
    5. agarose जेल ट्रो (0.8% agarose, 100 V पर 60 मिनट) द्वारा पचा वेक्टर और पाचन के अवशेष से पचा वेक्टर अलग । Ligate पच BMP2-K3TAG के साथ डालने के कमरे के तापमान पर पच pET11a-pyrtRNA रीढ़ (RT) के लिए 2 h का उपयोग कर 100 pET11a के एनजी-pyrtRNA रीढ़ और ३४.५ एनजी के BMP2-K3TAG insert (1:3 दाढ़ अनुपात) । रिएक्शन मिक्सचर में डीएनए की रीढ़ और डालें, ligase बफर के 2 µ एल, डीएनए ligase के 1 µ एल, और एच2ओ की कुल मात्रा को 20 µ एल.
    6. pSRF (pyrtRNAsynth) बैक्टीरिया में pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk और BL21-युगल-DE3 का सह-रूपांतरण निष्पादित करें:
      1. जोड़ें 50 जीवाणुओं के लिए प्रत्येक प्लाज्मिड के एनजी, 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण जगह, 50 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सदमे, बर्फ पर 5 मिनट के लिए जगह, मिश्रण में Lysogeny शोरबा (पौंड) मध्यम के 500 µ एल जोड़ने के लिए, और हिला 60 मिनट के लिए 300 rpm में ।
      2. पूर्व गर्म कनमीसिन पर बैक्टीरियल मिश्रण के 100 µ एल फैलाओ (50 µ जी/एमएल)/ampicillin (100 µ जी/एमएल) प्लेटें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
  2. BMP2-K3Plk की अभिव्यक्ति और शुद्धि 13 , 14
    1. 50 µ g/एमएल ऑफ कनमीसिन और 100 µ जी/एम्पीसिलीन के 37 डिग्री सेल्सियस पर के साथ पौंड मध्यम के 50 मिलीलीटर में रातोंरात एक एकल कॉलोनी का प्रचार ।
    2. भयानक शोरबा (टीबी) के 50 µ g/एमएल कनमीसिन और 100 µ जी/एम्पीसिलीन के एमएल के साथ पूरक के 800 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृतियों 1:20 पतला, और 37 ° c पर बढ़ने जब तक एक आयुध डिपो 0.7 की600 तक पहुंच गया है । 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए propargyl-L-lysine जोड़ें । isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) प्रेरण से पहले संस्कृति से एक 100 µ एल नमूना ले लीजिए ।
    3. 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG के अलावा द्वारा जीन अभिव्यक्ति प्रेरित । 180 rpm में एक कक्षीय शेखर में 16 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हो जाना । संस्कृति से एक 100 µ एल नमूना लीजिए ।
    4. 30 मिनट के लिए 9000 x जी में पूरी संस्कृति के केंद्रापसारक । supernatant त्यागें, और TBSE बफर (10 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)) के साथ 1:1000 (वी/वी) 2-mercaptoethanol (हौसले से जोड़ा) के 30 मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली reसस्पेंड ।
      चेतावनी: 2 संभाल-धुएं हूड के तहत mercaptoethanol । त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचें । वाष्प या धुंध की साँस लेना से बचें । धुएं हूड के तहत 2-mercaptoethanol युक्त बफ़र्स के साथ सभी निलंबन चरणों का पालन करें ।
    5. एक खाली केंद्रापसारक चोंच वजन और खाली चोंच में reसस्पैंड गोली हस्तांतरण । के लिए ६,३६० x g पर केंद्रापसारक 20 मिनट के लिए supernatant त्यागें और गोली के साथ चोंच वजन । गोली के वजन की गणना करने के लिए खाली चोंच के वजन घटाना ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । लंबी अवधि में अल्पावधि में या कम-80 डिग्री सेल्सियस में-20 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज । प्रोटोकॉल शुरू करने पर, आरटी पर गोली गल ।
    6. (10 मिमी Tris पीएच 8.0; 150 मिमी NaCl; 1 मिमी EDTA, 375 mm सुक्रोज; 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (हौसले से जोड़ा)) । गोली के हर 10 ग्राम के लिए एसटी बफर के 200 मिलीलीटर का प्रयोग करें ।
    7. Sonicate बर्फ पर निलंबन (40 एस पल्स, 20 एस ब्रेक, और 30% आयाम के साथ 10 मिनट) । 20 मिनट के लिए ६,३६० x g पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें और गोली तौलना । sonication और केंद्रापसारक चरण 4 बार दोहराएँ ।
    8. टीबीएस बफर (10 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl) के 100 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड । 20 मिनट के लिए ६,३६० x g पर केंद्रापसारक supernatant और गोली तौलना छोड़ें ।
    9. nuclease बफर में गोली reसस्पेंड (100 मिमी Tris, 1 mm EDTA, 3 mm MgCl2) हौसले से जोड़ा के साथ 80 U/एमएल nuclease (उदा, Benzonase) गोली का 10 मिलीलीटर/ एक सरगर्मी प्लेट (30 rpm) पर आरटी पर रात भर निलंबन की मशीन ।
    10. ट्राइटन बफर (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) फिनाइल-पॉलीथीन ग्लाइकोल) को निलंबन से जोड़ें । वॉल्यूम को जोड़ने के लिए ट्राइटन बफ़र के एक 0.5 वॉल्यूम भाग निलंबन के संगत है । आरटी पर 10 मिनट के लिए मशीन (कोई सरगर्मी) । 20 मिनट के लिए ६,३६० x g पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें और गोली तौलना ।
    11. (100 मिमी Tris, 20 मिमी EDTA) गोली के 8 मिलीलीटर का उपयोग करते हुए बफर में गोली reसस्पेंड । 20 मिनट के लिए ६,३६० x g पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें और गोली तौलना ।
    12. 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) (हौसले से जोड़ा) के साथ 6 एम GuCl के जी/25 मिमी NaAc पीएच 5.0 और 5 मिलीलीटर के g 4 मिलीलीटर जोड़कर गोली reसस्पेंड । एक सरगर्मी थाली (30 rpm) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निलंबन की मशीन ।
    13. 20 मिनट के लिए ७५,५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant अब monomeric BMP2 प्रोटीन का खुलासा होता है । supernatant लीजिए और ध्यान केंद्रित सेल में एक 3 केडीए आणविक भार कट ऑफ (MWCO) झिल्ली का उपयोग कर 20 आयुध डिपो/एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें) में इस निकालने के लिए
    14. Renaturation बफर के लिए एक बूंदों में केंद्रित मोनोमर जोड़ें (2 एम LiCl, 50 मिमी Tris, 25 मिमी लोग, 5 मिमी EDTA, 1 मिमी glutathione डाइसल्फ़ाइड (GSSG), 2 मिमी glutathione (GSH)) जबकि सरगर्मी (30 rpm) । आर टी पर अंधेरे में 120 एच के लिए मशीन ।
      नोट: इस मशीन अवधि के दौरान, occours का खुलासा । इस चरण के बाद से समाधान जोड़ dimeric BMP2-K3Plk शामिल हैं ।
    15. 3.0 के लिए समाधान का पीएच समायोजित करें का उपयोग कर केंद्रित एचसीएल । 1 mM hcl के खिलाफ सॉल्यूशन Dialyze । ध्यान केंद्रित सेल में एक 10 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) झिल्ली का उपयोग कर dialyzed समाधान को फोकस करें ।
    16. Equilibrate बफ़र A (20 mM NaAc, 30% isopropanol) जोड़कर समाधान करें । समाधान का एक 30% वॉल्यूम के लिए संगत बफ़र का कोई खंड जोड़ें । 15 मिनट के लिए 4700 x g पर समाधान केंद्रापसारक ।
    17. Equilibrate एक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) सिस्टम पर आयन एक्सचेंज के लिए कॉलम एक बफर के 150 मिलीलीटर के साथ15 equilibrated कॉलम पर प्रोटीन समाधान लोड । बफर बी की एक रैखिक ढाल का उपयोग Elute अंश (20 मिमी NaAc, 30% isopropanol, 2 एम NaCl) बफर बी के 100 मिलीलीटर का उपयोग कर 2 मिलीलीटर भागों लीजिए ।
      नोट: कुल कॉलम की मात्रा के अनुसार कॉलम को लोड करने से पहले प्रोटीन को ध्यान में रखें । अंतिम प्रोटीन वॉल्यूम कुल स्तंभ वॉल्यूम का < 5% होना चाहिए ।
    18. विश्लेषण एसडीएस Polyacrylamide जेल द्वारा प्रत्येक अंश के 20 µ एल (12%) ट्रो (एसडीएस-PAGE) 16 और Coomassie शानदार नीले दाग17 ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: Coomassie प्रतिभाशाली नीले दाग एसडीएस-पृष्ठ जेल dimers (26 केडीए) और मोनोमर (13 केडीए) युक्त अंशों से युक्त भिन्न दिखाता है.
    19. पूल डिमर-भागों युक्त । Dialyze 1 मिमी एचसीएल (5 लीटर मात्रा) के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अंश युक्त डिमर का पूल । एक का उपयोग करके अंतिम उत्पाद ध्यान केंद्रित 10 केडीए केंद्रापसारक फ़िल्टर इकाई ध्यान केंद्रित ( सामग्री की तालिकादेखें) । एसडीएस Polyacrylamide (12%) जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) और Coomassie शानदार नीले दाग से अंतिम उत्पाद का विश्लेषण ।
      नोट: Coomassie शानदार नीले दाग एसडीएस पृष्ठ जेल पर बैंड 26 केडीए में केवल एक बैंड दिखाना चाहिए । यह अंतिम BMP2-K3Plk उत्पाद है ।

2. तांबे का अनुकूलन (I)-Catalyzed Alkyne-Azide Cycloaddition (CuAAC) conditions

  1. सोडियम ascorbate (NaAsc) और कॉपर (II) सल्फेट (CuSO 4 ) जंगली प्रकार BMP2 (BMP2-WT) पर प्रभाव
    1. NaAsc के विभिंन अनुपात के साथ 20 µ मीटर BMP2-WT के लिए CuSO4। एक 50 µ एल मात्रा में 0.5 mm NaAsc और 0.5 mm CuSO4 (एकाग्रता शुरू) का प्रयोग करें । CuSO के लिए NaAsc के निंनलिखित अनुपात के साथ आगे बढ़ें4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20:1), CuSO 4 एकाग्रता लगातार 0.5 mM में रखते हुए और तदनुसार NaAsc की एकाग्रता का समायोजन । आरटी में रात भर एक घूर्णन मिक्सर (20 rpm) पर एच2ओ में प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।
    2. 6 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 5% 2-mercaptoethanol और मशीन नमूना युक्त लोडिंग बफर जोड़कर कम नमूनों को तैयार करें । एसडीएस Polyacrylamide जेल (12%) ट्रो (एसडीएस-PAGE) और Coomassie शानदार नीले दाग के द्वारा कम और गैर-कम नमूनों का विश्लेषण । Coomasie सना एसडीएस-पेज जैल 13 केडीए (कम conditons) 26 केडीए और उच्च आणविक भार (गैर-घटे शर्तों) के दायरे में बैंड दिखाएंगे ।
  2. CuAAC प्रतिक्रिया पर Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) अमीन (THPTA) का प्रभाव
    1. THPTA के विभिंन अनुपात के साथ 20 µ मीटर BMP2-K3Plk के लिए CuSO4। 5 मिमी NaAsc, और 200 µ एम 3-Azido-7-hydroxycoumarin (रखें NaAsc और 3-Azido-7-hydroxycoumarin स्थिरांक) का उपयोग करें । सांद्रता शुरू के रूप में 50 µ m THPTA और 0.5 mM of CuSO4 का प्रयोग करें । CuSO के लिए THPTA के विभिंन अनुपात का प्रयोग करें4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). एक घूर्णन मिक्सर (20 rpm) पर आरटी में 24 घंटे के लिए एच2O (50 µ l कुल मात्रा) में प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।
    2. युग्मन पर, 3-Azido-7-hydroxycoumarin एक फ्लोरोसेंट डाई हो जाता है । कम और गैर कम शर्तों में नमूनों को तैयार करने और एसडीएस-पृष्ठ द्वारा उन्हें का विश्लेषण. 3-Azido-7-hydroxycoumarin के लिए विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजना चैनल के तहत जैल कल्पना (λabs = 404 एनएम; λem = 477 एनएम) ।

3. आबंध युग्मन तकनीक BMP2-K3Plk को Azide कार्यात्मक Agarose मोतियों की

  1. BMP2 के 20 µ मीटर-K3Plk या BMP2-WT (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया) µ के 20 azide एल के साथ-सक्रिय agarose मोतियों की कुल मात्रा में 500 µ एल प्रतिक्रिया बफर में (0.1 M HEPES पीएच 7.0, 3.9 एम यूरिया, 50 µ एम CuSO4, 250 µ एम THPTA, 5 मिमी सोडियम ascorbate) के लिए 2 ज पर आरटी पर एक rotati एनजी मिक्सर (20 rpm) । 5 मिमी EDTA (अंतिम एकाग्रता) जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो ।
  2. एक घूर्णन मिक्सर (20 rpm) पर 15 मिनट के लिए आर टी पर मशीन । आरटी में 1 मिनट के लिए 20,000 x g पर नमूने केंद्रापसारक supernatants इकट्ठा ।
  3. एचबीएस500 बफर के 1,000 µ एल के साथ तीन बार मोतियों से युक्त गोली धो लें (50 मिमी HEPES, 500 मिमी NaCl), 4 एम µ2के 1,000 MgCl एल के साथ तीन बार, और दो बार के साथ 1,000 µ एल की फास्फेट बफर खारा (पंजाब). हर धुलाई कदम पर, आरटी में 1 मिनट के लिए 20,000 x जी पर केंद्रापसारक और supernatants इकट्ठा । 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब के 1,000 µ एल में मोती युग्मित स्टोर ।
    चेतावनी: supernatant को दूर करते हुए मनका गोली परेशान मत करो ।

4. उपस्थिति और मैटीरियल BMP2 की जैविक गतिविधि मांय-K3Plk का उपयोग कर टेक्सास लाल लेबल बीएमपी रिसेप्टर मैं एक Ectodomain (BMPR-IA चुनाव आयोग )

  1. BMP2 के 50 µ एल की मशीन-K3Plk के साथ कार्यात्मक मोतियों की 1 µ एम टेक्सास लाल लेबल BMPR-IAईसी के साथ 150 µ एल के एचबीएस500 बफर (50 मिमी HEPES, 500 मिमी NaCl) एक घूर्णन मिक्सर (20 rpm) पर 1 घंटे के लिए आरटी में ।
  2. आरटी पर 1 मिनट के लिए 20,000 x जी में मोती केंद्रापसारक supernatant त्यागें । एचबीएस के 1000 µ l के साथ मोतियों को धोकर500 बफर । एक अतिरिक्त 3 बार धुलाई कदम दोहराएं । प्रत्येक धुलाई कदम के बाद आरटी में 1 मिनट के लिए 20,000 x g पर केंद्रापसारक ।
  3. एक ग्लास कवर स्लाइड पर पंजाब के 500 µ एल और पिपेट 50 µ एल में मोतियों को फिर से सस्पेंड । 561 या 594 एनएम के बीच माइक्रोस्कोप फिल्टर सेट करें । पता लगाने के टेक्सास लाल-BMPR-IAचुनाव आयोग-BMP2-K3Plk कार्यात्मक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग और तस्वीरें ले मोती ।

5. मापने alkaline फॉस्फेट (ALP) अभिव्यक्ति साबित करने के लिए इन विट्रो में उत्पादित BMP2-K3Plk के पहले और बाद युग्मन प्रतिक्रिया ।

  1. क्षारीय फॉस्फेट (ALP) परख
    1. संस्कृति promyoblastic C2C12 कोशिकाओं (ATCC CRL-172) में Dulbecco के संशोधित ईगल की मध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 100 U/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 µ g/एमएल streptomycin 37 ° c पर एक humidified वातावरण में 5% CO2।
    2. 3 × 104 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज C2C12 कोशिकाओं को एक 96-अच्छी तरह से microplate में/ कक्षों को रातोंरात अनुलग्न करने दें । BMP2 के 0.5-200 एनएम की उपस्थिति में मध्यम और गर्मी C2C12 कोशिकाओं को निकालें-WT या BMP2-K3Plk में 100 µ एल/DMEM (2% FCS, 100 U/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 µ g/एमएल streptomycin) 37 ° c पर एक humidified वातावरण में 5% CO2 के लिए 72 एच ।
    3. अच्छी तरह से प्रति पंजाब के 100 µ एल के साथ मध्यम और धो कोशिकाओं निकालें । 1 एच के लिए आरटी पर लाइसे कोशिकाओं के साथ 100 µ एल/lysis बफर (1% NP-40, 0.1 M glycine, पीएच 9.6, 1 mm MgCl2, 1 mm ZnCl2) एक हिलती हुई प्लेट (220 rpm) पर ।
    4. ALP बफर (0.1 M glycine, pH 9.6, 1 mm MgCl2, 1 mm ZnCl2) के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल पी-nitrophenylphosphate (हौसले से जोड़ा) के साथ सेल lysate के 100 µ l/
    5. ALP बफर जोड़ने के बाद एक multiplate रीडर में 405 एनएम में अवशोषण उपाय, और हर 5 मिनट जब तक रंग का विकास पूरा हो गया है । एक रसद मॉडल का उपयोग कर खुराक प्रतिक्रिया घटता है और EC50 मूल्यों उत्पन्न, y = एक2 + (एक1-एक2)/(1 + (x/x0)p) ।
  2. क्षार फॉस्फेट (ALP) दाग
    1. संस्कृति promyoblastic C2C12 कोशिकाओं (ATCC CRL-172) में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 100 U/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 µ g/एमएल streptomycin 37 ° c पर एक humidified वातावरण में 5% CO2।
    2. 3 × 104 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज C2C12 कोशिकाओं को एक 96-अच्छी तरह से microplate में/ कक्षों को रातोंरात अनुलग्न करने दें । मध्यम निकालें और BMP2-K3Plk युग्मित मोतियों की अच्छी तरह से 20 µ l/ BMP2-K3Plk युग्मित मोतियों एक पंजाबियों के 1000 µ एल में हैं ।
    3. DMEM में 0.4% कम पिघल-बिंदु agarose का समाधान तैयार करें । माइक्रोवेव में पिघल (3 मिनट के लिए 600 डब्ल्यू) और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में शांत हो जाओ जब तक उपयोग करें ।
    4. एक अच्छी तरह से (मोतियों और कोशिकाओं को कवर) में 0.4% कम पिघलने बिंदु agarose के 20 µ एल जोड़ें । 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 2000 x g पर केंद्रापसारक । जोड़ें 80 µ l DMEM (2% FCS, 100 U/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 µ g/एमएल streptomycin) और एक humidified वातावरण में 37 ° c पर मशीन 5% CO2 के लिए 72 एच ।
    5. मध्यम हटाएं, जम 0.4% agarose अलग करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा । 1-Step NBT/BCIP (नाइट्रो-नीला tetrazolium क्लोराइड, 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3'-indolyphosphate p-toluidine नमक) सब्सट्रेट समाधान के 100 µ l/
    6. विश्लेषण alkaline फॉस्फेट प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के तुरंत बाद बैंगनी दाग स्पष्ट हो जाता है धुंधला । उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें और तस्वीरें ले लो ।

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Representative Results

इस अनुच्छेद में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए covalently जोड़ी एक नया BMP2 संस्करण, BMP2-K3Plk, वाणिज्यिक उपलब्ध azide कार्यात्मक agarose मोतियों (चित्रा 1) के लिए । उत्पादित BMP2-K3Plk संस्करण की प्रतिक्रिया क्षारीय फॉस्फेट (ALP) C2C12 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण द्वारा मान्य किया गया था. इन विट्रो टेस्ट जंगली प्रकार BMP2 (BMP2-WT) और BMP2-K3Plk (चित्रा 2) द्वारा प्रेरित समान ALP अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है ।

तांबे के बीच redox प्रतिक्रियाओं (द्वितीय) सल्फेट (CuSO4) और सोडियम ascorbate (NaAsc) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों कि संरचनात्मक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं उत्पन्न और इस प्रकार BMP2-K3Plk की गैर-सक्रियता को प्रभावित. प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता को सत्यापित करने के लिए, हम4 और NaAsc CuSO के साथ एक रात की मशीन प्रदर्शन, एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से BMP2-WT गिरावट दिखा (एसडीएस द्वारा दृश्य-कम शर्तों के तहत पृष्ठ (3 चित्र1 )) और लगभग 40 केडीए (गैर-घटे शर्तों के तहत) (चित्र 3ए2) में दिखाई multimers या समुच्चय का गठन । प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-मिथाइल) अमीना (THPTA) का उपयोग सुरक्षात्मक एजेंट (चित्र ३ बी) के रूप में किया गया. THPTA का उपयोग BMP2 विखंडन को रोकता है, जबकि उच्च आणविक भार संरचनाओं के गठन को THPTA के अतिरिक्त द्वारा रोका नहीं जा सका है. प्रतिक्रिया के आगे सुधार बफर की संरचना को संबोधित किया, प्रतिक्रिया तापमान, और प्रतिक्रिया समय (डेटा नहीं दिखाया गया है) । प्रोटोकॉल यहां वर्णन अंतिम प्रतिक्रिया बफर संरचना, तापमान, और प्रतिक्रिया समय के बारे में उपलब्धियां विवरण ।

पुष्टि करने के लिए कि BMP2-K3Plk युग्मन के बाद, हम प्रकार मैं रिसेप्टर (BMPR-IAचुनाव आयोग) के रिसेप्टर ectodomain प्रोटीन का इस्तेमाल किया है कि मैटीरियल प्रोटीन अभी भी इस रिसेप्टर को बांध करने में सक्षम है फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करता है । CuAAC रसायन विज्ञान के माध्यम से BMP2-K3Plk के साथ लेपित मोती प्रतिदीप्ति जब डाई-लेबल BMPR-आइएचुनाव आयोग (चित्रा 4) के साथ मशीन झुकेंगे । इसके विपरीत, गैर लेपित मोती या मोतियों कि BMP2 के साथ मशीन थे-WT पृष्ठभूमि के स्तर के ऊपर कोई प्रतिदीप्ति संकेत दिखाया (डेटा नहीं दिखाया गया है)14।

इन विट्रो मेंमैटीरियल ligand की रिसेप्टर बाइंडिंग क्षमताओं की पुष्टि करने के बाद, हम भी जैविक प्रतिक्रियाओं एक सेल में कार्यात्मक मोतियों से ट्रिगर किया जा सकता है कि परीक्षण आधारित परख । ALP मध्यस्थ धुंधला उन कोशिकाओं में ही हुई जो BMP2-K3Plk-कार्यात्मक मोती (चित्रा 5) के साथ सीधे संपर्क में थे. यह पुष्टि करता है कि प्रोटीन वास्तव में covalently मोतियों से जुड़ा हुआ है और सिर्फ अवशोषित नहीं, के बाद से एक अधिक प्रसार बाहर मोती के लिए बड़ी दूरी पर धुंधला अंयथा देखा गया होगा ।

Figure 1
चित्र 1: BMP2 का चित्रण-K3Plk. (A) पेश अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के स्थानीयकरण के साथ BMP2-K3Plk संस्करण का चित्रण । (ख) युग्मन योजना: azide कार्यात्मक मोतियों के साथ BMP2-K3Plk CuAAC प्रतिक्रिया. Tabisz एट अलसे अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) । (2017): साइट-बीएमपी-2 के निर्देश के स्थिरीकरण: अभिनव Osteoinductive पाड़ों के उत्पादन के लिए दो दृष्टिकोण. Biomacromolecules । 18 (3), 695-708. (कॉपीराइट 2017 अमेरिकन केमिकल सोसायटी) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: BMP2-वेरिएंट की गैर-गतिविधि । BMP2-K3Plk और wildtype BMP2 (BMP2-WT) की (ALP परख) की तुलना । x-अक्ष BMP2 की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है-WT या BMP2-K3Plk परख में इस्तेमाल किया । EC50 डेटा 4 व्यक्तिगत प्रयोगों के अर्थ मूल्यों और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं (N = 4). Tabisz एट अलसे अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) । (2017): साइट-बीएमपी-2 के निर्देश के स्थिरीकरण: अभिनव Osteoinductive पाड़ों के उत्पादन के लिए दो दृष्टिकोण. Biomacromolecules । 18 (3), 695-708. (कॉपीराइट 2017 अमेरिकन केमिकल सोसायटी) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: BMP2 की अखंडता पर कम करने एजेंट का प्रभाव. (क) BMP2-WT से कॉपर (२) सल्फेट (NaAsc४) को सोडियम ascorbate (CuSO) के विभिन्न दाढ़ अनुपातों से अवगत कराया गया. नमूनों एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया गया-पृष्ठ और Coomassie शानदार नीले दाग के तहत कम (चित्रा A1) और गैर कम शर्तों (चित्रा A2). सीमित शर्तों (A1) में, लाल तीर सट BMP2-WT का प्रतिनिधित्व करते हैं । गैर-सीमित शर्तों (A2) में, लाल तीर multimeric BMP2-WT इंगित करते हैं । सट BMP2 प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने वाले बैंड को नीले तीर से दर्शाया गया है । लीजेंड: नेकांआर कम BMP2-WT अनुपचारित; नेकां-BMP2-WT अनुपचारित; 20:1 करने के लिए 1:1-सोडियम ascorbate के दाढ़ अनुपात में वृद्धि करने के लिए CuSO4. (ख) BMP2-K3Plk 3-Azido-7-hydroxycoumarin CuAAC प्रतिक्रिया शर्तों के साथ पूरक का उपयोग करने के लिए युग्मित किया गया था THPTA. 3 युग्मन पर-Azido-7-hydroxycoumarin एक फ्लोरोसेंट डाई हो जाता है । लीजेंड: नेकां-BMP2-WT 3-Azido-7-hydroxycoumarin के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की; 7:1 से 20:1 के दाढ़ अनुपात में वृद्धि THPTA से CuSO4. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मैटीरियल की BMP2-K3Plk इन विट्रो में । टेक्सास के साथ मैटीरियल BMP2-K3Plk की बातचीत का प्रतिनिधि चित्र-लाल बला BMPR-IAचुनाव आयोग। Tabisz एट अलसे अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित (अनुकूलित) । (2017): साइट-बीएमपी-2 के निर्देश के स्थिरीकरण: अभिनव Osteoinductive पाड़ों के उत्पादन के लिए दो दृष्टिकोण. Biomacromolecules । 18 (3), 695-708. (कॉपीराइट 2017 अमेरिकन केमिकल सोसायटी) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: कोशिका-आधारित परख में मैटीरियल BMP2-K3Plk की अधिकता । (एक) alkaline फॉस्फेट के प्रतिनिधि चित्र (ALP) BMP2-K3Plk कार्यात्मक मोतियों के साथ मिलकर मोतियों के साथ इलाज पर दाग । (ख) क्षारीय फॉस्फेट (ALP) घुलनशील 25 एनएम BMP2 के साथ उपचार पर दाग-K3Plk. reprinted (अनुकूलित) Tabisz एट अलसे अनुमति के साथ । (2017): साइट-बीएमपी-2 के निर्देश के स्थिरीकरण: अभिनव Osteoinductive पाड़ों के उत्पादन के लिए दो दृष्टिकोण. Biomacromolecules । 18 (3), 695-708. (कॉपीराइट 2017 अमेरिकन केमिकल सोसायटी) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

आनुवंशिक codon विस्तार द्वारा टैग प्रोटीन वेरिएंट उत्पादन प्राथमिक प्रोटीन अनुक्रम के किसी भी स्थिति में मुख्य रूप से विभिन्न गैर प्राकृतिक एमिनो एसिड अनुरूप के परिचय की अनुमति देता है. BMP2 जैसे BMPs के मामले में, एक 6-Histidine (उसकी) टैग के रूप में आम टैग केवल एन-टर्मिनली शुरू किया जा सकता है, के बाद से प्रोटीन ´ एस सी-टर्मिनल अंत तृतीयक प्रोटीन संरचना के भीतर दफन है, और इस प्रकार बाहर से सुलभ नहीं है । अंय पदों पर, शुरू की टैग का आकार बहुत संभावना संरचनात्मक परिवर्तन है कि फलस्वरूप काटना बीएमपी ´ एस गतिविधि के कारण हो सकता है । इसके अलावा, BMP2 अनुक्रम में एक उत्परिवर्तन शुरू करने का खुलासा प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकते हैं, और यह भी संशोधित प्रोटीन के isoelectric बिंदु के रूप में अंय प्रोटीन मानकों को बदल सकते हैं । इस प्रकार, एक स्थापित प्रोटीन उत्पादन प्रोटोकॉल में हर कदम को बदल प्रोटीन संस्करण ´ एस विशेषताओं के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । BMP2 के उत्पादन-K3Plk वास्तव में जंगली प्रकार BMP2 की अभिव्यक्ति के लिए स्थापित विधि के एक संशोधन की आवश्यकता है । विभिन्न संस्कृति टाइम्स या propargyl-L-lysine (Plk) सांद्रता का परीक्षण किया गया (डेटा नहीं दिखाया गया) क्रम में उच्चतम अभिव्यक्ति उपज तक पहुँचने के लिए. गुना, जुदाई और शुद्धि चरणों सौभाग्य से आगे रूपांतरों की आवश्यकता नहीं थी । हम पहले से ही सूचित किया है कि अंय BMP2 हमारे प्रयोगशाला में उत्पादित वेरिएंट के मामले में, कुछ प्रोटीन विशेषताओं काफी बदल दिया गया है, जो BMP उत्पादन विधि18के कई चरणों के संशोधन की आवश्यकता है । उत्पादित BMP2-K3Plk जैविक गतिविधि है कि जंगली प्रकार के प्रोटीन की तुलना में दिखाया । एक अंतर उच्च BMP2 सांद्रता पर होता है, शायद मध्यम में BMP2-K3Plk संस्करण के एक कम घुलनशीलता के एक परिणाम के रूप में जंगली प्रकार BMP2 की तुलना में ।

तांबे के ज्ञात लाभ के बावजूद-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC)19, CuAAC प्रतिक्रियाओं ध्यान से विशेष अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । हमें पता चला कि कैसे BMP2 खंडित किया जा सकता है या समुच्चय या मजबूत कम करने की प्रतिक्रिया की स्थिति के कारण multimers बना । इस प्रकार, सभी प्रतिक्रिया मानकों को विस्तार से विश्लेषण किया जाना था ताकि शर्तों कि प्रोटीन अप्रभावित छोड़ खोजने के लिए ।

covalently जोड़ा BMP2 संस्करण के लिए हमारे दृष्टिकोण azide पर क्लिक करें रसायन विज्ञान द्वारा कार्यात्मक agarose मोतियों के लिए उच्च दक्षता कार्यात्मक में osteogenic भेदभाव को ट्रिगर करने के परिणामस्वरूप क्षमता के साथ महसूस किया जा सकता है इन विट्रो। जब जंगली प्रकार BMP2 प्रोटीन के बजाय मोतियों के साथ प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया गया था, हम केवल कमजोर ALP अभिव्यक्ति के धुंधला का पालन कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि युग्मन वास्तव में propargyl-L-BMP2 के lysin अवशेषों के माध्यम से अत्यधिक विशेष रूप से हुई-K3Plk ।

यह स्थिति युग्मन विशिष्टता एक महान सुधार को दर्शाता है एक शास्त्रीय एन सी एस के साथ शामिल प्रक्रियाओं की तुलना/EDC रसायन विज्ञान । ऐसे मामलों में, यादृच्छिक युग्मन होता है, मुख्य रूप से प्राथमिक अमीन lysine अवशेषों में मौजूद समूहों को शामिल । युग्मित प्रोटीन एक चर osteogenic गतिविधि है, पाड़ के लिए संभव कनेक्शन की बहुलता के कारण, कोशिका रिसेप्टर्स की ओर प्रोटीन के विभिन्न झुकाव के लिए अग्रणी.

साइट-डायरेक्ट मैटीरियल BMP2 के उपयोग से घुलनशील BMP2 की उच्च खुराक से संबंधित उल्लेखित कमियां दूर हो सकती हैं, जो अस्थि गठन को प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, परिणाम स्पष्ट रूप से पता चलता है कि कुछ सेलुलर प्रतिक्रियाओं, जैसे C2C12 कोशिकाओं के osteogenic भेदभाव, पूरी तरह से मैटीरियल BMP2 द्वारा शुरू कर रहे हैं, हाल ही में दावा है कि संकेत transduction के endocytosis की आवश्यकता के बावजूद अध्ययन ligand/ligand-रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स20,21. हमारे निष्कर्षों को अंय कि BMP2, जो covalently युग्मित है (लेकिन नहीं साइट-निर्देशित) गैर endocytosable सतहों, अभी भी osteoblast भेदभाव22प्रेरित करने में सक्षम है का प्रदर्शन अध्ययनों के साथ समझौते में हैं ।

विचार है कि हम ऊपर अर्थ का उपसर्ग का इस्तेमाल किया है, युग्मन प्रतिक्रिया के लिए BMP2 के शारीरिक सांद्रता, मैटीरियल BMP2 की मात्रा में आगे कम हो सकता है, जबकि अभी भी मोतियों की osteogenic गुणों के संरक्षण । इस तरह के अनुकूलन कदम से पहले, तथापि, BMP2-K3Plk-कार्यात्मक सुपाड़ा को vivo मेंअपनी osteogenic क्षमता साबित करने के लिए पशु प्रयोगों में परीक्षण की जरूरत है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखकों ने डॉ॰ एम Rubini (Konstanz, जर्मनी) को प्लाज्मिड एंकोडिंग pyrrolysyl-tRNA प्रदान करने के लिए और pRSFduet-pyrtRNAsynth एन्कोडिंग प्रदान करने के लिए इसी aminoacyl-tRNA synthetase का धन्यवाद किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1-Step NBT/BCIP Thermo Fisher 34042 Add solution to cells
3-Azido-7-hydroxycoumarin BaseClick BCFA-047-1 Chemical used for click reaction
Agarose low melting point Biozym 840101 Agarose for ALP assay 
Azide agarose beads Jena Bioscience CLK-1038-2 Beads used for reaction
BamHI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific FD0054 Restriction enzyme
BMP receptor IA (BMPR-IAEC) -- -- Produced in our lab
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye Thermo Fisher Scientific 20279 Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE
Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) Alfa Aesar A13986 Chemical used for click reaction
DNA Polymerase and reaction buffer  Kapabiosystems KK2102 KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX Gibco 61965-026 Cell culture media
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich GmbH E5134-1kg Chemical used to stop click reaction
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Carl Roth GmbH 2316.5 Bacteria induction (1mM final concentration) 
NdeI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific ER0581 Restriction enzyme
NHS-activated Texas Red Life technologies T6134 Coupled to receptor
P- Nitrophenyl Phosphate Sigma Aldrich GmbH N4645-1G Alkaline Phosphatase
p25N-hmBMP2  -- -- Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel
pET11a-pyrtRNA -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk) -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Gel Purification
Qiagen PCR purification Kit Qiagen 28104 PCR Purification 
Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich GmbH A7631-100G Chemical used for click reaction
T4 DNA Ligase ThermoScientific EL0011 Ligation 
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) BaseClick BCMI-006-100 Chemical used for click reaction
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma Aldrich GmbH X100-1L Triton X 100 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml  Merck KGaA UFSC40001 Concentrating unit
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck KGaA UFC901024 Concentrating centrifugal unit
ÄKTA avant FPLC ÄKTA -- FPLC machine
Avanti J-26XP Beckman Coulter  393124 Centrifuge for bacterial culture
Bacterial Shaking Incubator Infors HT Shaking incubator for bacterial culture
FluorChem Q system proteinsimple -- Imaging and analysis system for SDS-PAGE
Fluorescent miscroscope Keyence BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M) Merck KGaA 116882 Ion Exchange Chromatography column material
Greiner CELLSTAR® 96 well plates Sigma M5811-40EA 96 well plates for cell culture (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R ThermoScientific -- Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor ThermoScientific 75003624 Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining
Microcentrifuge - 5417R Eppendorf -- Centrifuge
OriginPro 9.1 G  OriginLab -- software for stastic analysis of ALP assay data
Polysine Slides ThermoScientific 10143265 microscope slides
Rotor JA-10 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JLA 8.1 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JA 25.50 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Tecan infinite M200 multiplate reader Tecan Deutschland GmbH -- Multiplate reader for ALP assay
Thermocycler - Labcycler Gradient SensoQuest GmbH -- PCR
TxRed - microscope filter Keyence Filter for fluorescent microscope 
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa Merck KGaA PLBC04310 used with amicon concentrating cell 400ml
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa Merck KGaA PLGC04310 used with amicon concentrating cell 400ml

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References

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जैव अभियांत्रिकी निर्गम 133 अस्थि पुनर्जनन अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (BMP) विकास कारक Osteogenic विभेद साइट-निर्देशित स्थिरीकरण क्लिक करें-रसायन विज्ञान ।
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Siverino, C., Tabisz, B., Lühmann, T., Meinel, L., Müller, T., Walles, H., Nickel, J. Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry. J. Vis. Exp. (133), e56616, doi:10.3791/56616 (2018).

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