Summary
骨形態形成タンパク質 2 (BMP2) をドープした生体材料は非組合骨折を癒すために新しい治療戦略として使用されています。因子の手に負えないリリースから生じる副作用を克服するためにサイトに新しい戦略を提案する-従って骨機能の向上と材料を作成する要因を直接固定します。
Abstract
ヒーリング以外の長い骨欠損の治療のための別の治療戦略を集中的に検討しました。骨形成タンパク質 (Bmp) などの骨の成長因子との組み合わせで生体材料の利用につながっているいくつかの制限の現在の処置は現在使用。一般的な吸収またはカプセル化方法には、通常いくつかの深刻な副作用を誘発するいわゆる初期バースト リリース効果に終って BMP2 のスープラ生理量が必要。これらの問題を克服するための可能な戦略は、共有結合タンパク質を足場にカップルことでしょう。さらに、再現性のある製品の結果を保証するために、サイト固有の方法で結合を実行必要があります。したがって、我々 はコドン利用拡大 (BMP2 K3Plk) によって BMP2 タンパク質の成熟した部分に人工アミノ酸 (プロパルギル L-リジン) は導入された BMP2 バリアントを作成しました。BMP2 K3Plk 銅触媒アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を通して官能ビーズに結合されていました。体外結合 BMP2 K3Plk の生物学的活性が証明され、BMP2 K3Plk 修飾ビーズ貪食は、セルベースのアッセイで証明されました。C2C12 細胞と接触して機能性ビーズがビーズ ローカル制限近接でアルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) 発現を促すことができます。本手法での機能性足場を作り出すことがこのように、骨系統への分化をトリガーすることができます。さらに、BMP2 の低用量で結合 BMP2 のサイト向けの配向を制御のために十分です。この方法では、Bmp は要因がサイト指示されたカップリング技術を介して結合されている場合、そうではない適切な向きで細胞表面上の受容体に常に公開されます。製品の結果が非常に制御可能なしたがって、重要なサイズの修理のための適用性を向上、均質な特性を持つ素材の結果骨の欠陥。
Introduction
骨の組織工学・骨再生の究極の目標は、短所と非組合骨折の一般的な治療法の中に発生する制限を克服することです。自動または同種移植は、いくつかの欠点をもっていても現在の治療戦略として主に使用されます。理想的な骨移植が骨延長術における骨、骨移植片の osteointegration につながると同様、新鮮を誘発します。今日では、のみ自動移植は、理想的な骨移植のすべての特徴を提供するので、「ゴールド スタンダード」と見なされます。残念ながら、それはまた、長い手術時間や通常 (例えば、慢性的な痛み、血腫形成、感染症、化粧品の欠陥、等) の多くの合併症を伴う第 2 外傷サイトなど、重要な負の側面を提示します。同種移植は、一方、すべての一般的な側面1の準の特徴であります。代替骨移植技術は、骨、骨伝導、生体親和性と生体吸収性足場を生産する目的で、ここ数年で改善されています。以来、多くの生体材料はすべてのこれらの骨の特性を示さない、BMP2 と BMP7 は、主にさまざまな成長要因は特定足場2の骨の可能性を改善するためにされています。
必須条件としてこのような成長因子の配信システムは、細胞の動員と添付ファイル、セル成長および血管新生のような重要なイベントを促進するために時間をかけて量を制御リリースを提供する必要があります。ただし、bmp 形式だけでなく、他の骨の成長因子がされている一般的固定非共有結合3。わなに掛ける事と吸着技術の深刻な欠点生体内で骨増殖を誘導することによって周囲の組織に影響を与える一般的につながる初期バースト リリースによる蛋白質の超生理量の使用が必要炎症や腫れ、融解4。したがって、時間の長い期間のための配信サイトで成長因子の保持を共有結合固定化方法で実現できます。BMP2 を化学的に変更 (サクシニル化5、アセチル化6またはビオチン化7) 設計する8、または BMP2 派生オリゴペプチド9を設計されているし、限界を克服するために関連するには吸収。ただし、配置可能性がある細胞の受容体に固定化リガンドの結合を阻害するので、これらの構成体の生物活性は予測できません。前に示したとして活性リガンド-受容体複合体の形成に関与するすべての 4 受容体鎖が完全にすべての下流のシグナル伝達カスケード10をアクティブにするために固定化 BMP2 と対話が不可欠です。
生物活性、安定性、および固定化因子の生体利用率の点で限界の不均質製品結果の問題を克服するためには、共有サイト指示された方法で足場をバインドできる BMP バリアントを設計されています。このバリアントは、BMP2-K3Plk と呼ばれるには、遺伝子コドン拡張11によって導入された人工アミノ酸が装備されています。このバリアントは、その生物学的活性を維持しながら共有結合の結合戦略を使用して足場に正常にリンクされています。
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Protocol
1. BMP2 のバリアントの BMP2 K3Plk の生産
- クローニングの BMP2-K3Plk PCR を使用してサイト指示された突然変異誘発によって12
- 人間の成熟した BMP2 を増幅 (hmBMP2) p25N hmBMP2 ベクトルから (材料の表を参照してください) 前方のプライマー (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) で逆プライマー (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 導入、黄色停止コドン (タグ) BMP2´s 成熟した部分の最初のリジンの位置にあります。前方のプライマー (10 pmol/μ L)、逆プライマー (10 pmol/μ L)、p25N hmBMP2 (10 ng/μ L) の 1 μ L の 1.5 μ L の 1.5 μ、10 μ M dNTP 原液 1.5 μ 33.5 μ L H2O、10 μ L の PCR 反応混合物の PCR の反作用を実行します。、、1 μ L の DNA ポリメラーゼ (材料表参照) サーマルサイクラー (変性 95 ° C、5 分で 1 分、1 分、72 ° c 1 分、伸長、72 ° C 10 分で最後の拡張のための 60 ° C で熱処理の 95 ° C で変性の 30 サイクル) で。
- 製造元の推奨事項に従う、市販のキットを使用して PCR の製品の浄化 (材料の表を参照してください)。
- H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 45 分の 37 ° C で制限の酵素 NdeI と PCR の製品を消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分ダイジェスト 37 ° C H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 1 時間で制限の酵素病原と PCR の製品のために 65 ° C で酵素を熱不活性 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-5 分で 80 ° C で酵素を不活性化します。
- H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA の使用時間は 2 時間 45 分の 37 ° C で NdeI と pET11a pyrtRNA のベクトルを消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-不活性化 65 ° c 5 分ダイジェスト 1 h H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 37 ° C で病原と pET11a pyrtRNA のベクトルの (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分で 80 ° C で熱不活化します。
- 未消化のベクトルから消化のベクトルを分離し、(0.8% アガロース、100 V で 60 分間) の電気泳動のゲルの agarose によって消化の残党。100 を使用して 2 時間 (RT) 室温で消化 pET11a pyrtRNA バックボーンを持つ消化 BMP2 K3TAG 挿入を縛る pET11a pyrtRNA バックボーンと 34.5 の ng BMP2 K3TAG 挿入 (モル比 1:3) の ng。反応混合物は、DNA のバックボーンと挿入、リガーゼ バッファー 2 μ、1 μ L の DNA リガーゼと H2O 20 μ L の総ボリュームに含まれます。
- BL21(DE3) 細菌 pSRF デュエット pyrtRNAsynth ・ pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 共同変換を実行します。
- 50 を追加、微生物のそれぞれのプラスミッドの ng は氷の 30 分間、50 の 42 ° C で熱ショックに混合物を配置 s、5 分間氷の上置いて、混合物で 500 μ L のホストゲノム スープ (LB) 培地を追加、60 分 300 rpm で振る。
- 予め温めておいたカナマイシン (50 μ g/mL) に細菌の混合物の 100 μ L を広める/アンピシリン (100 μ g/mL) プレートと 37 ° C で一晩インキュベート
- BMP2 K3Plk の発現と精製13,14
- カナマイシンの 50 μ g/mL と 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の LB 培地 50 mL で一晩単一コロニーを伝達します。
- 素晴らしいスープ (TB) 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリン、100 μ g/mL と 800 mL に一晩文化 1:20 を希釈し、0.7 の OD600に到達するまで、37 ° C で成長します。10 mM の最終的な集中にプロパルギル L-リジンを追加します。イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (誘導) 前に文化から 100 μ L のサンプルを収集します。
- 最終濃度 1 mM の IPTG の添加により遺伝子の発現を誘導します。180 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C で文化を育てます。文化から 100 μ L のサンプルを収集します。
- 遠心分離機の 9000 x g で 30 分間破棄で全体の文化の上澄みと 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加) と TBSE バッファー (トリス、150 mM の NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 10 mM) の 30 mL の細菌のペレットを再懸濁します。
注意: ハンドル 2-メルカプトエタノール ヒューム フードの下で。皮膚および眼との接触を避けます。蒸気やミストの吸入を避けます。ヒューム フードの下 2-メルカプトエタノールを含むバッファーをすべての再懸濁の手順を実行します。 - 空遠心ビーカーの重さし、空のビーカーにペレットを再懸濁を転送します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットとビーカーの重量を量る。ペレットの重量を計算する空のビーカーの重さを引きます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。短期的に-20 ° c または長期的には-80 ° C でペレットを凍結します。プロトコルを再開する時に解凍室温ペレット - STE バッファー (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM 塩化ナトリウム; 1 mM EDTA、375 mM ショ糖 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加)) にペレットを再懸濁します。ペレットのすべての 10 g を 200 mL の STE バッファーを使用します。
- 氷 (10 分 40 秒パルス、20 s ブレーキ 30% 振幅) の懸濁液を超音波照射します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。超音波処理、遠心分離手順を 4 回繰り返します。
- TBS バッファー (10 mM トリス、150 mM の NaCl) 100 mL にペレットを再懸濁します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
- 新しく追加された 80 U/mL のヌクレアーゼ (例えばBenzonase) とヌクレアーゼ バッファー (100 mM トリス、1 mM EDTA、3 mM MgCl2) にペレットを再懸濁します 10 mL/g のペレットを使用しています。一晩攪拌板 (30 rpm) で RT の懸濁液を孵化させなさい。
- トリトンのバッファーを追加 (60 ミリメートルの EDTA、1.5 M の NaCl、6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) フェニル - ポリエチレング リコール) 懸濁液を。追加するトリトン バッファーのボリュームは、懸濁液の 0.5 のボリューム部分に対応しています。RT (攪拌なし) で 10 分間インキュベートします。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
- TE バッファー (100 mM トリス、20 ミリメートルの EDTA) でペレットを再懸濁します 8 mL/g のペレットを使用しています。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
- 25 mM NaAc pH 5.0 の 4 mL/g と 1 mM ジチオトレイトール (DTT) (たて追加) と 6 M GuCl の 5 mL/g を追加することでペレットを再懸濁します。4 ° C で攪拌板 (30 rpm) で一晩懸濁液を孵化させなさい。
- 20 分間 75,500 × g で遠心分離機します。上清には、単量体 BMP2 胞が含まれています。上澄みと集中、集中 3 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた 20 OD/mL にこの抽出細胞 (材料の表を参照) を収集します。
- (30 rpm) を攪拌しながら、濃縮モノマーを単一液滴の下のバッファー (2 M LiCl、トリス、50 mM 25 mM チャップス、5 ミリメートルの EDTA、1 mM のグルタチオンの二硫化物 (GSSG) 2 mM グルタチオン (GSH)) に追加します。暗闇の中で 120 h 室温で孵化させなさい。
注: この潜伏期間中に、ぜんぶを巻き戻し。この手順以降からソリューションには、折り畳まれた二量体の BMP2 K3Plk が含まれています。 - 集光セル 10 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた透析解決集中された塩酸 Dialyze 1 mM 塩酸集中に対してソリューションを使用して 3.0 に溶液の pH を調整します。
- バッファー (20 mM NaAc、30% イソプロパノール) を追加することによってソリューションを平衡します。ソリューションの 30% のボリュームに対応するバッファー A のボリュームを追加します。15 分間 4700 × g で遠心分離機します。
- タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム15 150 mL のバッファー A. 負荷平衡する列にタンパク質溶液をイオン交換コラムを平衡させ。バッファー B (20 mM NaAc、30% イソプロパノール、2 M の NaCl) の線形グラデーションを使用して分数を溶出バッファー * 収集 2 mL 分画の 100 mL を使用しています。
注: は、合計列ボリュームに従って列にロードする前にタンパク質を集中します。最終的なタンパク質の量をする必要があります < 合計列ボリュームの 5%。 - SDS ポリアクリルアミドのゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) 16と Coomassie ブリリアント ブルー染色17 (材料の表を参照) によって各画分の 20 μ L を分析します。
注: Coomassie ブリリアント ブルー染色 SDS ページのゲル番組分数ダイマー (26 kDa) とモノマー (13 kDa) を含有する画分を含みます。 - 二量体を含む画分をプールします。一晩で 1 mM 塩酸 (5 リットルの容量) に対して 4 ° C 分数を含むダイマーのプールを dialyze します。遠心ろ過ユニットを集中 10 kDa を使用して最終製品を集中 (材料の表を参照してください)。(12%) SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と Coomassie ブリリアント ブルー染色により最終製品を分析します。
注: Coomassie ブリリアント ブルーのバンド染色 SDS ページのゲル 26 kDa で 1 つだけのバンドが表示されます。最終 BMP2 K3Plk 製品です。
2. 銅 (I) の最適化-アルキン-アジ化環化付加反応 (CuAAC) 条件を触媒
- 及ぼすアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) および銅の (II) 硫酸塩 (CuSO 4 )野生型 BMP2 の (BMP2 WT)
- 20 μ M をインキュベート CuSO4NaAsc の縦横比の異なる BMP2 WT。50 μ L のボリュームで 0.5 mM NaAsc と 0.5 mM CuSO4 (開始濃度) を使用します。CuSO4NaAsc の次の比率を続行: (1:1)、(1.7:1)、(10:1)、(20:1)、0.5 mm CuSO4濃度を一定に保つことと NaAsc の濃度を適宜調整すること。一晩室温 H2O 回転ミキサー (20 rpm) 上の反応を実行します。
- 5 %2-メルカプトエタノールを含む読み込みバッファーを追加することによって縮小サンプルを準備し、6 分分析が減少し、SDS ポリアクリルアミドによる試料の非減少ゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) および Coomassie ブリリアント ブルー染色の 95 ° C でサンプルをインキュベートします。SDS ページのゲルを染色 Coomasie 26 kDa と高分子量 (非還元条件) 13 kDa (減らされた条件) の範囲にバンドを示します。
-
効果 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 反応アミン (THPTA)
- 20 μ M をインキュベート CuSO4THPTA の縦横比の異なる BMP2 K3Plk。5 mM NaAsc、および 200 μ M 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin (NaAsc と 3 アジドフェニル-7 hydroxycoumarin を一定に保つ) を使用します。濃度を開始として 50 μ M THPTA と CuSO4の 0.5 mM を使用します。CuSO4THPTA の異なる比率を使用: (7:1);(10:1);(12:1);(15:1);(20:1). 回転ミキサー (20 rpm) に常温 24 h の H2O の反応 (容量 50 μ L) を実行します。
- カップリング、時に 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin 蛍光色素になります。削減と非還元条件下でサンプルを準備し、SDS ページによってそれらを分析します。3 アジドフェニル 7 hydroxycoumarin の特定の波長で励起チャンネルの下でゲルを視覚化 (λabs = 404 nm; λem = 477 nm)。
3. 共有カップリング法アジに BMP2 K3Plk 修飾アガロース ビーズ
- 20 μ L の反応バッファー (0.1 M HEPES pH 7.0、3.9 M 尿素 50 μ M CuSO4, 250 μ M THPTA、5 mM アスコルビン酸ナトリウム) で 500 μ L の総ボリュームでアジ化アクティブ アガロース ビーズと BMP2 K3Plk または BMP2 WT (ネガティブ コントロールとして使用) の 20 μ M をインキュベート、rotati の RT で 2 hng ミキサー (20 rpm)。5 mM EDTA (最終濃度) の追加によって反作用を停止します。
- 回転ミキサー (20 rpm) で 15 分間室温でインキュベートします。遠心分離機のルート収集で 1 分の 20,000 × g でサンプル培養上清。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1,000 μ L で 4 M MgCl2、1,000 μ L で、2 回 3 回 3 回 HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 1,000 μ L でビーズを含むペレットを洗浄します。すべての洗濯の段階で RT で 1 分の 20,000 × g で遠心分離し、培養上清を収集します。4 ° C で 1,000 μ L の PBS で結合ビーズを格納します。
注意: は、上清を除去しながらビーズ ペレットを不可します。
4. 存在と固定化 BMP2 K3Plk を使用してテキサス赤の生物学的活性を検証するというラベルの付いた BMP 受容体私の外部ドメイン (BMPR IA EC )
- インキュベート 50 μ L BMP2 K3Plk 修飾ビーズのテキサス赤の 1 μ m というラベルの付いた BMPR IAEC HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 150 μ L で RT で、回転ミキサー (20 rpm) で 1 時間。
- 破棄した上清で 1 分の 20,000 × g でビーズを遠心します。HBS500バッファーの 1000 μ L でビーズを洗浄します。追加の洗浄のステップを 3 回繰り返します。20,000 × g で遠心するそれぞれの後 RT で 1 分間洗浄のステップ。
- 500 μ L の PBS のビードを再停止しなさい、カバー スライド ガラス上の 50 μ L をピペットします。561 または 594 nm 間顕微鏡のフィルターを設定します。テキサス赤-BMPR-IAECを検出-BMP2-K3Plk 修飾ビーズ蛍光顕微鏡と画像を使用します。
5. アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) の測定前に BMP2 K3Plk を生産とのカップリング反応の後の体外活性を証明する表現。
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アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) アッセイ
- Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.
- 3 × 104細胞/ウェルの 96 ウェル マイクロ プレートへの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、0.5-200 の存在下で C2C12 細胞をインキュベート 100 μ L/ウェル DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) の 37 ° c 5% CO2 72 h で加湿雰囲気で BMP2 WT の BMP2 K3Plk nM。
- 培地を取り除き、pbs 100 μ L/ウェルの細胞を洗浄します。換散バッファーの 100 μ L/ウェルで 1 h の RT で細胞を溶解 (1 NP 40%、0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) の水平振動板 (220 rpm)。
- 細胞ライセートに 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (たて追加) を 100 μ L/ウェル ALP バッファー (0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2) を追加します。
- 405 で吸収を測定色の開発が完了するまで ALP バッファー、および 5 分ごとの追加後マルチ プレート リーダーで nm。用量応答曲線とロジスティック モデルを用いた EC50 値生成 y = A2 + (1-2)/(1 + (x/0x)p)。
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アルカリホスファターゼ (ALP) の汚損
- Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.
- まあ 96 ウェル マイクロ プレートで/3 × 104セルの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、BMP2 K3Plk 結合ビーズの 20 μ L/ウェルを追加します。BMP2 K3Plk 結合ビーズは、PBS の懸濁液の 1000 μ L。
- DMEM で 0.4% 低融点アガロース溶液を準備します。電子レンジ (600 W 3 分間) で溶かすし、冷まします 37 ° c の水浴中に使用されるまで。
- 各ウェル (カバー ビーズと細胞) に 0.4% 低融点アガロースの 20 μ L を追加します。2000 x g で 20 ° C で 5 分間遠心80 μ l 添加 DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) し, 72 時間の 5% CO2で加湿雰囲気で 37 ° C で。
- 凝固の 0.4% の agarose が外れないように注意しながら、中を削除します。ステップ 1 NBT の 100 μ L/ウェルを追加/BCIP (ニトロ ブルー テトラゾリウム塩、5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-トルイジン塩) 基板の解決。
- アルカリホスファターゼ染色直後に明らかになる紫染色顕微鏡を使用して分析します。明視野顕微鏡を使用し、写真を撮る。
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Representative Results
この記事では官能基化市販アジ アガロース ビーズ (図 1) に共有 BMP2 変種は、BMP2-K3Plk 手法について述べる。作り出された BMP2 K3Plk バリアントの生理活性は、C2C12 細胞におけるアルカリホスファターゼ (ALP) 遺伝子発現の誘導によって検証されました。生体外でテストは野生型 BMP2 による同様の ALP 発現レベルを示しています (BMP2 WT) と BMP2 K3Plk (図 2)。
銅の (II) 硫酸塩 (CuSO4) とアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) の酸化還元反応では、構造の整合性に影響を与える可能性があります、したがって BMP2 K3Plk の生理活性に影響を与える活性酸素種を生成します。CuSO4と NaAsc、(減らされた条件 (図 3 a1 SDS-PAGE による可視化、濃度依存的に BMP2 WT 劣化を示す一晩インキュベートを行い、蛋白質の構造の整合性を確認するには)) 多量または集計 (非還元条件) 下で約 40 kDa で目に見えるの形成と (図 3 a2)。タンパク質分解をトリスを避けるために (3-hydroxypropyltriazolyl-メチル) アミン (THPTA) は、(図 3 b) の保護剤として使用されました。THPTA の使用より高い分子量構造の形成 THPTA の添加によるられなかった中 BMP2 の断片化を防ぎます。更なる反応の反応バッファー、反応温度および反応時間 (データは示されていない) の組成に対処。プロトコルは、反応バッファー組成、温度、反応時間などの最終成果の詳細を紹介します。
種類の蛍光に分類された受容体の外部ドメイン蛋白質を用いて BMP2 K3Plk が結合した活性を保持することを確認、私受容体 (BMPR IAEC) 固定された蛋白質がまだこの受容体に結合することができることを実証します。得られた蛍光色素標識 BMPR IA とEC (図 4), CuAAC 化学を介して BMP2 K3Plk をビーズしました。コントラスト、非コーティングのビーズや蛍光を示した BMP2 WT で培養ビーズ バック グラウンド上の信号レベル (データは示されていない)14。
体外固定化リガンドの受容体結合機能を確認した後、我々 はまた細胞ベースのアッセイで官能ビーズによって引き起こされる生体反応かどうかをテストしました。ALP は、BMP2 K3Plk 修飾ビーズ (図 5) との直接接触は、それらの細胞にのみ発生した染色を介する。これは、蛋白質がビーズに確かに共有リンクとないちょうど吸収ビーズに大きな距離でより広がった染色だろうそれ以外の場合が観察されているので確認します。
図 1: BMP2 の描写-K3Plk (A) 。導入されたアミノ酸置換の局在と BMP2 K3Plk バリアントの描写です。(B)結合方式: アジと BMP2 K3Plk CuAAC 反応修飾ビーズ。転載を許可 Tabiszらから (適応)。(2017): BMP 2 の固定化をサイト指示された: 革新的な骨足場の生産のための 2 つのアプローチ。生体高分子。18 (3) 695-708。(著作権 2017年アメリカ化学会)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BMP2 亜種の生体活性します。BMP2 K3Plk と野生型 BMP2 の (alp) 活性の比較 (BMP2 WT)。BMP2 K3Plk 試金で使用または x 軸は BMP2 WT の濃度を表します。EC50 データは、平均値と個々 の実験 4 (N = 4) の標準偏差を表します。転載を許可 Tabiszらから (適応)。(2017): BMP 2 の固定化をサイト指示された: 革新的な骨足場の生産のための 2 つのアプローチ。生体高分子。18 (3) 695-708。(著作権 2017年アメリカ化学会)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BMP2 の整合性に及ぼす還元剤。(A) BMP2 WT がアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) に銅の (II) 硫酸塩 (CuSO4) のモル比が異なるにさらされていた。SDS ページと縮小 (図 A1) および非還元条件 (図 A2) Coomassie ブリリアント ブルー染色により行なった。減らされた条件 (A1) では、赤の矢印は、劈開 BMP2 WT を表しています。非還元条件 (A2) では、赤矢印はポリコームタンパク BMP2 WT を示しています。劈開 BMP2 の種を表すバンドは、青い矢印によって示されます。凡例: NCR - 低減 BMP2 WT 放置。ノースカロライナ州 - BMP2 WT 放置。CuSO4アスコルビン酸ナトリウムのモル比を 20:1 - 増加する 1:1。(B) BMP2 K3Plk 結合された 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin THPTA を添加した CuAAC 反応条件を使用します。結合時に 3 アジドフェニル-7 hydroxycoumarin 蛍光色素になります。凡例: ノースカロライナ州 - BMP2 WT 反応 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin;7:1 〜 20:1 CuSO4THPTA のモル比を増加します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: BMP2 K3Plk 体外固定の生体活性します。テキサス赤札 BMPR IAECと固定化 BMP2 K3Plk の相互作用の代表的な画像。転載を許可 Tabiszらから (適応)。(2017): BMP 2 の固定化をサイト指示された: 革新的な骨足場の生産のための 2 つのアプローチ。生体高分子。18 (3) 695-708。(著作権 2017年アメリカ化学会)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 細胞に基づく試金の固定化 BMP2 K3Plk の活性。(A) BMP2 K3Plk 修飾ビーズに結合したビーズと染色アルカリ性ホスファターゼ (ALP) の代表的な画像。(B)アルカリ性ホスファターゼ (ALP) 水溶性 25 と染色 nM BMP2-K3Plk。 (適応) Tabiszらの許可を得て転載。(2017): BMP 2 の固定化をサイト指示された: 革新的な骨足場の生産のための 2 つのアプローチ。生体高分子。18 (3) 695-708。(著作権 2017年アメリカ化学会)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
遺伝子コドンの展開によってタグの蛋白質の変形が主主蛋白質シーケンスの任意の位置でさまざまな非天然アミノ酸類似の導入。BMP2 のような Bmp の場合一般的なタグのような (彼の) 6 ヒスチジンの札はできるだけ protein´s C ターミナル端タンパク質立体構造の中に埋もれた、こうして外からアクセスできないので N 末期に導入されました。他のポジションで導入されたタグのサイズは非常に高いその結果 BMP´s 活性を消し去る構造変化を引き起こす可能性があります。さらに、突然変異を導入することに BMP2 シーケンス リフォールディングの有効性に影響を与えることができるそして修飾タンパク質の等電点など他の蛋白質のパラメーターを変更することも。従って、確立された蛋白質の生産のプロトコルのすべての 1 つのステップは、変えられた蛋白質 variant´s の特性に合わせて適応する必要があります。BMP2 K3Plk の生産は確かに野生型 BMP2 の式に確立された方法の変更を必要です。異文化時代やプロパルギル-L-リジン (Plk) 濃度がテスト (データは示されていない) 式収量に達するために。リフォールディング、分離・精製の手順幸いなことに必要としないさらに adaptions。我々 は既に、BMP2 亜種が私たちの研究室で生産された他、場合いくつかのタンパク質の特性が大幅に変更、BMP 生産法18のいくつかの手順の変更が必要を報告しています。作り出された BMP2 K3Plk は、野生型蛋白質のそれに匹敵する生物学的活性を示した。高 BMP2 の濃度は、おそらく野生型 BMP2 のそれに比べて中 BMP2 K3Plk バリアントの溶解度が低い結果に違いが発生します。
銅触媒のアジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC)19の既知の利点にもかかわらず CuAAC 反応は特定のアプリケーションに慎重に適応する必要があります。BMP2 の断片化することができますまたは集計または強力な還元反応条件により多量の作成方法を紹介しています。したがって、反応のすべてのパラメーターは、タンパク質を変化しない残す条件を見つけるために詳細に分析するあった。
クリックケミストリーによってアジ化修飾アガロース ビーズにカップル BMP2 バリアントの共有へのアプローチは、骨分化誘導体外のトリガー機能性ビーズで高効率で実現できます。ビーズとの反応で野生型 BMP2 の蛋白質を使用する代わりに、ALP 発現の染色、BMP2 K3Plk プロパルギル L ライシン残渣によって高い結合が確かに発生したことを示す唯一の弱い様子が確認できた。
この位置の結合の特異性は、古典的な NHS/EDC 化学を含む固定プロシージャと比較して大きな改善を反映しています。このような場合、ランダムなカップリングに発生します、リジン残基に存在の第一次アミン グループを主に含みます。結合タンパク質は、変数貪食細胞受容体に向けて蛋白質のさまざまな方向につながる足場への可能な接続の多様性のためです。
サイト直接固定化 BMP2 の使用は骨形成を誘導するために必要な水溶性 BMP2 の高用量に関連記載の欠点を克服可能性があります。さらに、結果が明らかに特定の細胞応答 C2C12 細胞の骨分化誘導は完全固定化 BMP2 によって開始された、ようにもかかわらず信号を主張する最近の研究伝達が必要ですのエンドサイトーシス、リガンド ・ リガンド-受容体複合20,21。我々 の調査結果は、共有結合 (がないサイト監督) 非 endocytosable の表面に、BMP2 がまだ22骨芽細胞分化を誘導することができることを示す他の研究と一致しています。
カップリング反応の BMP2 のスープラ生理的濃度を使用している我々 を考えると、固定化 BMP2 の量も更に制限されますまだビードの骨の特性を保持しつつ。しかし、このような最適化のステップの前に、BMP2 K3Plk 官能基化足場は、その骨の潜在的なin vivoを証明するために動物実験でテストする必要があります。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者は、プラスミド ピロリジル tRNA のエンコーディングを提供して pRSFduet pyrtRNAsynth 対応するアミノアシル tRNA 合成酵素のエンコーディングを提供するため博士 M. Rubini (コンスタンツ、ドイツ) をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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