Summary
Biomaterialer doteret med ben morfogenetiske proteiner 2 (BMP2) har været brugt som en ny terapeutisk strategi for at helbrede ikke-union knoglebrud. For at overvinde bivirkninger som følge af en ukontrollabel frigivelsen af faktoren, vi foreslår en ny strategi til site-direkte immobilisere den faktor, således at skabe materialer med forbedret osteogenic kapaciteter.
Abstract
Forskellige terapeutiske strategier til behandling af ikke-healing lange knogledefekter har været intensivt undersøgt. I øjeblikket anvendes behandlinger findes flere begrænsninger, der har ført til brugen af biomaterialer i kombination med osteogenic vækst faktorer, såsom ben morfogenetiske proteiner (BMP). Almindeligt anvendte absorption eller indkapsling metoder kræver supra-fysiologiske mængder af BMP2, typisk resulterer i en såkaldt indledende burst release effekt, som provokerer flere alvorlige bivirkninger. En mulig strategi at overvinde disse problemer ville være at kovalent par protein til skafottet. Desuden skal kobling udføres i en lokationsspecifik måde for at sikre en reproducerbar produkt resultat. Derfor, vi skabt en BMP2 variant, hvor en kunstig aminosyre (propargyl-L-lysin) blev indført i den ældre del af BMP2 proteinet af codon skik ekspansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk var koblet til functionalized perler gennem kobber katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition (CuAAC). Den biologiske aktivitet i den koblede BMP2-K3Plk blev bevist i vitro og osteogenic aktiviteten af de BMP2-K3Plk-functionalized perler blev bevist i celle-baserede assays. Functionalized perler i kontakt med C2C12 celler var i stand til at fremkalde alkalisk fosfatase (ALP) udtryk i lokalt begrænset nærhed af perle. Derfor, af denne teknik, functionalized stilladser kan produceres der kan udløse Celledifferentiering mod en osteogenic afstamning. Derudover er lavere BMP2 doser tilstrækkelig på grund af den kontrollerede orientering af site-directed koblede BMP2. Med denne metode, er BMP-filer altid udsat for deres receptorer på cellens overflade i den passende orientering, hvilket ikke er tilfældet hvis faktorer, der er koblet via ikke-site-directed kobling teknikker. Produkt resultatet er meget styrbar, og dermed resulterer i materialer med ensartede egenskaber, forbedre deres anvendelighed for reparation af kritiske størrelse knogle defekter.
Introduction
Det ultimative mål for knogle tissue engineering og knogle regenerering er at overvinde de ulemper og begrænsninger, der opstår under fælles behandlinger af ikke-union frakturer. Auto - eller allo-transplantationscentre er overvejende bruges som nuværende terapi strategier, selvom de begge har flere ulemper. Den ideelle knogletransplantation bør fremkalde osteogenesis osteoinduction samt osteoconduction, hvilket fører til osteointegration af graften i knoglen. I dag, betragtes kun auto-transplantation som den "gyldne standard", da det giver alle egenskaber, en ideel knogletransplantation. Desværre, det præsenterer også vigtige negative aspekter, såsom lange kirurgi gange, og en anden traume websted, der normalt indebærer flere komplikationer (fx, kroniske smerter, hæmatom formationer, infektioner, kosmetiske defekter, osv.). Allogen grafts, har på den anden side suboptimal karakteristika for alle generelle aspekter1. Alternative bone graft teknologier er blevet forbedret i de seneste år, med formålet at producere stilladser, der er osteoinduktive, osteoconductive, biokompatible, og bioresorbable. Da mange biomaterialer ikke viser alle disse osteogenic karakteristika, er forskellige vækstfaktorer, primært BMP2 og BMP7, medtaget for at forbedre den særlige stillads2osteogenic potentiale.
Som et væsentligt kriterium, bør sådanne vækstfaktor leveringssystemer giver en kontrolleret dosis frigivelse over tid for at lette de afgørende begivenheder som celle rekruttering og udlæg, celle indvækst og angiogenese. Dog immobiliseret BMP samt andre osteogenic vækstfaktorer har været almindeligt ikke-kovalent3. Fastklemning og adsorption teknikker kræver brug af supra-fysiologiske mængder af protein på grund af en indledende store udgivelse, som fører til alvorlige ulemper in vivo typisk påvirker det omgivende væv ved at inducere knogle overvækst, Osteolyse, hævelse og inflammation-4. Opbevaring af vækstfaktorer på webstedet levering i længere perioder kan således opnås ved kovalente immobilisering metoder. Kemisk modificerede BMP2 (succinylated5, acetyleret6 eller biotinylated7), manipuleret heterodimers8, eller BMP2 afledte oligopeptides9 er blevet designet og bruges til at overvinde begrænsningerne i forbindelse med absorption. Bio-aktivitet af disse konstruktioner er imidlertid ikke forudsigelig, da ordningen potentielt hæmmer bindingen af immobiliserede ligand på cellulære receptorer. Som tidligere vist er det vigtigt, at alle fire receptor kæder involveret i dannelsen af aktiverede ligand-receptor komplekser interagere med de immobiliserede BMP2 fuldt aktivere alle downstream signaling cascades10.
For at overvinde problemer af en inhomogene produkt resultatet med begrænsninger med hensyn til bioactivity, stabilitet og biotilgængelighed af immobiliserede faktor, vi har designet en BMP variant kan kovalent binding stilladser på en site-directed måde. Denne variant, kaldes BMP2-K3Plk, består af en kunstig aminosyre, som blev indført af genetiske codon ekspansion11. Denne variant har været succesfuldt forbundet med stilladser ved hjælp af en kovalent kobling strategi samtidig opretholde dens biologiske aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af BMP2 Variant BMP2-K3Plk
- Kloning af BMP2-K3Plk ved site-directed mutagenese ved hjælp af PCR 12
- Forstærke menneskelige modne BMP2 (hmBMP2) fra en p25N-hmBMP2 vektor (Se Tabel af materialer) med en fremad primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') og et omvendt primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') at indføre en rav stop codon ( TAG) på placeringen af den første lysin BMP2´s modne del. Udføre PCR reaktionen bruger 33,5 µL af H2O, 10 µL af PCR-mastermix, 1,5 µL af 10 µM dNTP stamopløsning, 1,5 µL af fremad primer (10 pmol/µL), 1,5 µL af reverse primer (10 pmol/µL), 1 µL af p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , og 1 µL af DNA polymerase (Se Tabel af materialer) i en termisk cycler (denaturering ved 95 ° C i 5 min, 30 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 1 min., udglødning ved 60 ° C i 1 min., brudforlængelse ved 72 ° C i 1 min og en sidste udvidelse ved 72 ° C i 10 min).
- Rense PCR produkt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit efter fabrikantens anbefalinger (Se Tabel af materialer).
- Fordøje PCR produktet med begrænsning enzymet NdeI ved 37 ° C i 45 min ved hjælp af 16 µL af H2O, 3 µL af fordøjelsen buffer, 10 µL af DNA (20 ng/µL), og 1 µL af begrænsning enzym. Varme-inaktiverer enzymet ved 65 ° C til 5 min. fordøje PCR produktet med begrænsning enzymet BamHI ved 37 ° C i 1 time ved hjælp af 16 µL af H2O, 3 µL af fordøjelsen buffer, 10 µL af DNA (20 ng/µL), og 1 µL af begrænsning enzym. Varme-inaktivere enzym ved 80 ° C i 5 min.
- Fordøje pET11a-pyrtRNA vektor med NdeI ved 37 ° C i 2 timer og 45 min ved hjælp af 16 µL af H2O, 3 µL af fordøjelsen buffer, 10 µL af DNA (20 ng / µL), og 1 µL af begrænsning enzym. Varme-inaktivere ved 65 ° C til 5 min. fordøje pET11a-pyrtRNA vektor med BamHI ved 37 ° C i 1 time ved hjælp af 16 µL af H2O, 3 µL af fordøjelsen buffer, 10 µL af DNA (20 ng/µL), og 1 µL af begrænsning enzym. Varme-inaktivere ved 80 ° C i 5 min.
- Adskille fordøjet vektoren fra ufordøjet vektor og fordøjelsen resterne ved agarosegelelektroforese gel elektroforese (0,8% agarosegelelektroforese, 60 min. ved 100 V). Ligate den nedbrudte BMP2-K3TAG Indsæt med fordøjet pET11a-pyrtRNA rygrad ved stuetemperatur (RT) for 2 h bruger 100 ng pET11a-pyrtRNA rygrad og 34,5 ng af BMP2-K3TAG Indsæt (1:3 molære forhold). Reaktionsblandingen indeholder DNA rygraden og Indsæt, 2 µL af ligase buffer, 1 µL DNA ligase, og H2O til en samlet maengde paa 20 µL.
- Udføre en co transformation af pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk og pSRF-duet-pyrtRNAsynth i BL21(DE3) bakterier:
- Tilføje 50 ng af hver plasmid til bakterier, Placer blandingen på is i 30 min, varme chok på 42 ° C til 50 s, sted i isbad i 5 min, tilføje 500 µL af Lysogeny bouillon (LB) medium i blandingen og ryst på 300 rpm til 60 min.
- Sprede 100 µL af den bakterielle blandingen på forhånd varmede kanamycin (50 µg/mL) / ampicillin (100 µg/mL) plader, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Proteinekspression og -oprensning af BMP2-K3Plk 13 , 14
- Overfør en enkelt koloni overnatning i 50 mL af LB medium med 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillin ved 37 ° C.
- Fortynd overnight kulturer 1:20 i 800 mL af fantastisk bouillon (TB) medium suppleret med 50 µg/mL af kanamycin og 100 µg/mL ampicillin, og vokse ved 37 ° C, indtil en OD600 på 0,7 er nået. Tilføje propargyl-L-lysin til en slutkoncentration på 10 mM. Indsamle en 100 µL prøve fra kultur før isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induktion.
- Fremkalde genekspression ved tilsætning af IPTG til en endelig koncentration på 1 mM. Vokse kultur ved 37 ° C i 16 h i en orbitalryster på 180 rpm. Indsamle en 100 µL prøve fra kulturen.
- Der centrifugeres hele kulturen på 9000 x g i 30 min. Fjern supernatanten, og resuspenderes bakteriel i 30 mL af TBSE buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA)) med 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (frisk tilføjet).
Forsigtig: Håndtag 2-mercaptoethanol under stinkskab. Undgå kontakt med hud og øjne. Undgå indånding af dampe eller tåge. Udfør alle resuspension trin med buffere indeholdende 2-mercaptoethanol under stinkskab. - Vejer en tom centrifuge bægerglas og overføre den resuspenderede pellet i indholdsløs bægerglasset. Der centrifugeres ved 6,360 x g i 20 min. Fjern supernatanten og vejer bægerglasset med pellet. Trækkes fra vægten af det tomme bæger til at beregne vægten af toerstoffet.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Fryse pellet ved-20 ° C på kort sigt eller ved-80 ° C på lang sigt. Ved genoptagelse af protokollen, tø pellet på RT. - Resuspenderes i STE buffer (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 375 mM saccharose, 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (frisk tilføjet)). Bruge 200 mL af STE buffer for hver 10 g pellet.
- Der sonikeres suspension på is (10 min med 40 s puls, 20 s bremse og 30% amplitude). Der centrifugeres ved 6,360 x g i 20 min. Fjern supernatanten og vejer pelleten. Gentag trinene ultralydbehandling og centrifugering 4 gange.
- Resuspenderes i 100 mL af TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Der centrifugeres ved 6,360 x g i 20 min. Fjern supernatanten og vejer pellet.
- Resuspenderes i nukleasen buffer (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) med frisk tilføjet 80 U/mL nukleasen (f.eks.Benzonase) ved hjælp af 10 mL/g pellet. Inkuber suspension overnatning på RT på en omrøring plade (30 rpm).
- Tilføje Triton buffer (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenyl-polyethylen glycol) til suspension. Mængden af Triton buffer til at tilføje svarer til en 0,5 volumen del af suspensionen. Der inkuberes i 10 min. ved RT (ingen omrøring). Der centrifugeres ved 6,360 x g i 20 min. Fjern supernatanten og vejer pelleten.
- Resuspenderes i TE buffer (100 mM Tris, 20 mM EDTA) ved hjælp af 8 mL/g pellet. Der centrifugeres ved 6,360 x g i 20 min. Fjern supernatanten og vejer pelleten.
- Resuspenderes ved at tilføje 4 mL/g af 25 mM Karens pH 5,0 og 5 mL/g af 6 M GuCl med 1 mM dithiothreitol (DTT) (frisk tilføjet). Inkuber suspension natten over ved 4 ° C på en omrøring plade (30 rpm).
- Der centrifugeres ved 75.500 x g i 20 min. Supernatanten indeholder nu udfoldet monomere BMP2 protein. Indsamle supernatanten og koncentrat dette ekstrakt til 20 OD/mL ved hjælp af en 3 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) membran i en koncentreret celle (Se Tabel af materialer).
- Tilføje de koncentrerede monomerer i enkelt dråber til genopretning buffer (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM kæbe, 5 mM EDTA, 1 mM glutathion disulfid (GSSG), 2 mM glutathion (GSH)) under omrøring (30 rpm). Der inkuberes ved RT i 120 h i mørke.
Bemærk: under denne inkubationsperiode, hvorved man genfolder occours. Løsningen fra dette trin og fremefter indeholder den foldede dimerisk BMP2-K3Plk. - Justere pH af løsningen på 3.0 ved hjælp af koncentreret HCl. Dialyze løsning mod 1 mM HCl. koncentrat til dialyzed løsning ved hjælp af en 10 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) membran i en koncentrere celle.
- Reagensglasset løsningen ved at tilføje buffer en (20 mM Karens, 30% isopropanol). Tilføj en diskenhed buffer A svarende til 30% volumen af løsningen. Der centrifugeres løsning ved 4700 x g i 15 min.
- Blandingen henstår kolonnen for ionbytning på en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system15 med 150 mL buffer A. belastning protein løsning på kolonnen afbalancerede. Elueres fraktioner ved hjælp af en lineær gradient buffer B (20 mM Karens, 30% isopropanol, 2 M NaCl) ved hjælp af 100 mL buffer B. indsamle 2 mL fraktioner.
Bemærk: Koncentrere protein før læsning til kolonnen ifølge den samlede kolonne volumen. Den endelige protein volumen skal være < 5% af den samlede kolonne. - Analysere 20 µL af hver fraktion af SDS polyacrylamid gel (12%) elektroforese (SDS-PAGE) 16 og Coomassie strålende blå farvning17 (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Coomassie strålende blå farves SDS-PAGE gel viser fraktioner der indeholder dimerer (26 kDa) og fraktioner der indeholder monomerer (13 kDa). - Pool dimer-holdige fraktioner. Dialyze pulje af dimer indeholdende fraktioner natten over ved 4 ° C mod 1 mM HCl (5 liter volumen). Koncentrere sig slutproduktet ved hjælp af en 10 kDa koncentrere centrifugal filterenhed (Se Tabel af materialer). Analysere det endelige produkt af SDS polyacrylamid (12%) gelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie strålende blå farvning.
Bemærk: Band på Coomassie strålende blå farves SDS-PAGE gel bør vise kun ét band på 26 kDa. Dette er den endelige BMP2-K3Plk produkt.
2. optimering af kobber (I)-katalyseret alkyn-indeholder Cycloaddition (CuAAC) betingelser
- Effekten af natrium Ascorbat (NaAsc) og kobber (II) sulfat (CuSO 4 ) på vildtype BMP2 (BMP2-WT)
- Inkuber 20 µM BMP2-WT med forskellige nøgletal for NaAsc til CuSO4. Bruge 0,5 mM NaAsc og 0,5 mM CuSO4 (begyndende koncentration) i en 50 µL volumen. Fortsæt med følgende koefficienter i NaAsc til CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), at holde CuSO4 koncentration konstant på 0,5 mM og justere koncentrationen af NaAsc i overensstemmelse hermed. Udføre reaktionen i H2O på en roterende mixer (20 rpm) natten over på RT.
- Forbered reduceret prøver ved at tilføje loading bufferen indeholder 5% 2-mercaptoethanol og inkuberes prøve ved 95 ° C for 6 min. Analyze reduceret og ikke-reducerede prøver af SDS polyacrylamid gel (12%) elektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie strålende blå farvning. Coomasie farves SDS-PAGE geler Vis bands i rækken af 13 kDa (reduceret betingelser) til 26 kDa og højere molekylvægt (ikke-reduceret betingelser).
-
Effekten af Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) på den CuAAC reaktion
- Inkuber 20 µM BMP2-K3Plk med forskellige nøgletal for THPTA til CuSO4. Brug 5 mM NaAsc, og 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (holde NaAsc og 3-Azido-7-hydroxycoumarin konstant). Bruge 50 µM THPTA og 0,5 mM CuSO4 som udgangspunkt koncentrationer. Bruge forskellige nøgletal for THPTA til CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). udføre reaktion i H2O (50 µL samlede volumen) i 24 timer ved RT på en roterende mixer (20 rpm).
- Efter kobling bliver 3-Azido-7-hydroxycoumarin et fluorescerende farvestof. Forberede prøverne i reducerede og ikke-reduceret betingelser og analysere dem ved SDS-PAGE. Visualisere geler under excitation kanal med de specifikke bølgelængde for 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. kovalente kobling teknik, BMP2-K3Plk at indeholder Functionalized Agarosen perler
- Inkuber 20 µM i BMP2-K3Plk eller BMP2-WT (brugt som negativ kontrol) med 20 µL af indeholder-aktiveret Agarosen perler i en samlet maengde paa 500 µL i reaktion buffer (0,1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M urinstof, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM natrium Ascorbat) i 2 h i RT på en rotati NG mixer (20 rpm). Reaktionen standses ved at tilføje 5 mM EDTA (endelig koncentration).
- Der inkuberes ved RT i 15 min på en roterende mixer (20 rpm). Der centrifugeres prøver på 20.000 x g i 1 min på RT. indsamle analysere.
- Vask pellet indeholdende perler tre gange med 1.000 µL af HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), tre gange med 1.000 µL af 4 M MgCl2, og to gange med 1.000 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Ved hver vask skridt, centrifugeres ved 20.000 x g i 1 min på RT og indsamle supernatanter. Gemme koblede perler i 1.000 µL af PBS ved 4 ° C.
Forsigtig: Forstyr ikke perle pellet mens du fjerner supernatanten.
4. validering af tilstedeværelse og biologisk aktivitet af immobiliserede BMP2-K3Plk ved hjælp af Texas rød mærket BMP Receptor jeg en Ectodomain (BMPR-IA EF )
- Inkuber 50 µL af BMP2-K3Plk functionalized perlerne med 1 µM Texas rød mærket BMPR-IAEF med 150 µL af HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) på RT i 1 time på en roterende mixer (20 rpm).
- Der centrifugeres perler på 20.000 x g i 1 min på RT. udsmid supernatanten. Vask perler med 1000 µL af HBS500 buffer. Gentag trinnet vask en yderligere 3 gange. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 1 min på RT efter hver vask trin.
- Resuspend perlerne i 500 µL af PBS og afpipetteres 50 µL på et glas dækning dias. Sæt filteret mikroskop mellem 561 eller 594 nm. Opdage Texas Red – BMPR-IAEF-BMP2-K3Plk functionalized perler med fluorescerende mikroskopi og tage billeder.
5. måling af alkalisk fosfatase (ALP) udtryk at bevise, at In Vitro Bioactivity produceret BMP2-K3Plk før og efter den kobling reaktion.
-
Alkalisk fosfatase (ALP) assay
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 10% føtal kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære på 5% CO2.
- Seed C2C12 celler med en tæthed på 3 × 104 celler/brønd i en 96-brønd mikrotiterplade. Lad celler vedhæfte natten over. Fjerne medium og inkuberes C2C12 celler i overværelse af 0,5-200 nM BMP2-WT eller BMP2-K3Plk i 100 µL/brønd af DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære på 5% CO2 i 72 timer.
- Fjerne medium og vaske cellerne med 100 µL af PBS pr. brønd. Lyse celler på RT for 1 h med 100 µL/brønd af lysisbuffer (1% NP-40, 0,1 M Glycin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) på en rystende plade (220 rpm).
- Tilføj 100 µL/brønd af ALP buffer (0,1 M Glycin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) med 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (frisk tilføjet) til cellen lysate.
- Måle absorption ved 405 nm i en multiplate læser efter tilsætning ALP buffer, og hvert 5 min, indtil udviklingen af farven er fuldført. Generere dosis/respons-kurver og EC50-værdier ved hjælp af en logistisk model, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
-
Alkalisk fosfatase (ALP) farvning
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 10% føtal kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære på 5% CO2.
- Seed C2C12 celler med en tæthed på 3 × 104 celler/brønd i en 96-brønd mikrotiterplade. Lad celler vedhæfte natten over. Fjern mediet og tilsæt 20 µL/brønd af BMP2-K3Plk kombineret perler. BMP2-K3Plk kombineret perler er i 1000 µL af en PBS suspension.
- Der fremstilles en opløsning af 0,4% lav smeltepunkt Agarosen i DMEM. Smelter i mikrobølgeovn (600 W i 3 min.) og lad det køle ned i et vandbad ved 37 ° C indtil brug.
- Tilføj 20 µL af 0,4% lav smeltepunkt Agarosen i hver brønd (dækker perler og celler). Der centrifugeres ved 2000 x g i 5 min. ved 20 ° C. Tilsættes 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin) og inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære på 5% CO2 i 72 timer.
- Fjern mediet, være omhyggelig med ikke at løsrive den størknede 0,4% agarosegelelektroforese. Tilføj 100 µL/brønd af 1-trins NBT/BCIP (Nitro-blå tetrazolium chlorid, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate Pedersen-toluidin salt) substratopløsningen.
- Analysere alkalisk fosfatase farvning brug af lysmikroskopi umiddelbart efter de lilla pletter bliver synlige. Bruge lysfelt mikroskopi og tage billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikel vil beskrive vi en metode til at kovalent par en ny BMP2 variant, BMP2-K3Plk, til kommercielt tilgængelige indeholder functionalized Agarosen perler (figur 1). Bioactivity af de producerede BMP2-K3Plk variant blev valideret af induktion af alkalisk fosfatase (ALP) Gen-ekspression i C2C12 celler. In vitro- test viser lignende ALP udtryk niveauer induceret af vildtype BMP2 (BMP2-WT) og BMP2-K3Plk (figur 2).
Redox reaktioner mellem kobber (II) sulfat (CuSO4) og natrium Ascorbat (NaAsc) Generer reaktive ilt arter, der kan påvirke de strukturelle integritet og dermed påvirke bioactivity af BMP2-K3Plk. For at kontrollere den strukturelle integritet af proteinet, udførte vi en natten inkubation med CuSO4 og NaAsc, viser BMP2-WT nedbrydning i en koncentration-afhængige måde (visualiseret ved SDS-PAGE under reducerede forhold (figur 3A1 )) og dannelse af multimerer eller aggregater synlige på ca 40 kDa (under ikke-reducerede forhold) (figur 3A2). At undgå protein nedbrydning, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-methyl) Amin (THPTA) blev brugt som en beskyttende agent (figur 3B). Brugen af THPTA forhindrer BMP2 fragmentering, mens dannelsen af højere molekylvægt strukturer ikke kunne forhindres ved tilsætning af THPTA. Yderligere forbedringer af reaktionen behandlet sammensætningen af reaktion buffer, reaktion temperatur og reaktionstid (data ikke vist). Protokollen beskrevet her detaljer de endelige resultater med hensyn til reaktion buffer sammensætning, temperatur og reaktionstid.
For at bekræfte, at BMP2-K3Plk bevarer bioactivity efter kobling, vi brugte fluorescently mærket receptor ectodomain protein af typen jeg receptor (BMPR-IAEF) til at vise, at de immobiliserede protein er stadig i stand til at binde sig til denne receptor. Perler belagt med BMP2-K3Plk via CuAAC kemi givet fluorescens når inkuberes med farvestof-mærket BMPR-IAEF (figur 4). I kontrast, ikke-belagte perler eller perler, der blev inkuberet med BMP2-WT viste ingen fluorescens niveauer signal over baggrunden (data ikke vist)14.
Efter at have bekræftet receptor binding kapaciteter af immobiliserede ligand i vitro, testet vi også om biologiske reaktioner kan være udløst af functionalized perlerne i en celle-baserede analyse. ALP medieret farvning skete kun i de celler, der var i direkte kontakt med BMP2-K3Plk-functionalized-perler (figur 5). Dette bekræfter, at proteinet er faktisk kovalent knyttet til perlerne og ikke blot absorberet, da en mere spredning-out farvning på større afstande til perlerne ville ellers have blevet observeret.
Figur 1: skildring af BMP2-K3Plk. (A) Skildring af BMP2-K3Plk varianten med lokalisering af indførte aminosyre substitution. (B) kobling ordning: BMP2-K3Plk CuAAC reaktion med indeholder functionalized perler. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Tabisz mfl. (2017): site-Directed immobilisering af BMP-2: to tilgange til produktion af Innovative osteoinduktive stilladser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bioactivity af BMP2-varianterne. Sammenligning af bioactivities (ALP assay) af BMP2-K3Plk og vildtype BMP2 (BMP2-WT). X-aksen repræsenterer koncentrationen af BMP2-WT eller BMP2-K3Plk anvendes i analysen. EC50-dataene repræsenterer middelværdier og standardafvigelser af 4 individuelle eksperimenter (N = 4). Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Tabisz mfl. (2017): site-Directed immobilisering af BMP-2: to tilgange til produktion af Innovative osteoinduktive stilladser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekten af reduktionsmiddel på integriteten af BMP2. (A) BMP2-WT blev udsat for forskellige molære forhold af natrium Ascorbat (NaAsc) til kobber (II) sulfat (CuSO4). Prøverne blev analyseret af SDS-PAGE og Coomassie strålende blå farvning reduceret (Figur A1) og ikke-reduceret betingelser (Figur A2). I de reducerede betingelser (A1) repræsenterer de røde pile kløvet BMP2-WT. I de ikke-reduceret betingelser (A2) angiver de røde pile multimeriske BMP2-WT. De bands, der repræsenterer kløvet BMP2 arter er angivet med en blå pil. Legende: NCRasmussen - reduceret BMP2-WT ubehandlet; NC - BMP2-WT ubehandlet; 1:1 til 20:1 - stigende molære forhold af natrium Ascorbat CuSO4. (B) BMP2-K3Plk var koblet til 3-Azido-7-hydroxycoumarin ved hjælp af CuAAC reaktionsbetingelser suppleret med THPTA. Efter kobling bliver 3-Azido-7-hydroxycoumarin et fluorescerende farvestof. Legende: NC - BMP2-WT reagerede med 3-Azido-7-hydroxycoumarin; 7:1 til 20:1 øge molære forhold for THPTA til CuSO4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bioactivity af immobiliserede BMP2-K3Plk in vitro-. Repræsentativt billede af samspillet mellem immobiliseret BMP2-K3Plk med Texas-rød-mærket BMPR-IAEF. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Tabisz mfl. (2017): site-Directed immobilisering af BMP-2: to tilgange til produktion af Innovative osteoinduktive stilladser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bioactivity af immobiliserede BMP2-K3Plk i en celle-baserede analyse. (A) repræsentativt billede af alkalisk fosfatase (ALP) farvning på behandling med perler koblet til BMP2-K3Plk functionalized perler. (B) alkalisk fosfatase (ALP) farvning på behandling med opløselige 25 nM BMP2-K3Plk. Reprinted (tilpasset) med tilladelse fra Tabisz mfl. (2017): site-Directed immobilisering af BMP-2: to tilgange til produktion af Innovative osteoinduktive stilladser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generere tagged protein varianter af genetiske codon udvidelse tillader indførelse af forskellige ikke-naturlige aminosyre analoger hovedsagelig på enhver stilling af den primære protein sekvens. I tilfælde af BMP-filer som BMP2, fælles tags som en 6-histidin, (hans) tag kan kun være indført N-terminalt, da protein´s C-terminale ende er begravet inden for tertiær protein struktur, og der således ikke er tilgængelige udefra. På andre positioner, kan størrelsen af den indførte tag meget sandsynligt medføre strukturelle ændringer, der derfor udslette BMP´s bioactivity. Yderligere, at indføre en mutation i BMP2 rækkefølge kan påvirke den refolding virkning, og kan også ændre andre protein parametre såsom det isoelektriske punkt af modificerede proteiner. Således, hvert enkelt trin i en etableret protein produktion protokol skal være afpasset efter de ændrede protein variant´s egenskaber. Produktion af BMP2-K3Plk kræves faktisk en ændring af den fastlagte metode til udtryk for vildtype BMP2. Forskellige kultur gange eller propargyl-L-lysin (Plk) koncentrationer blev testet (data ikke vist) for at nå det højeste udtryk udbytte. Hvorved man genfolder, kræver adskillelse og rensning trin heldigvis ikke yderligere tilpasninger. Vi har allerede rapporteret, at i tilfælde af andre BMP2 varianter produceret i vores laboratorium, blev nogle protein karakteristika ændres betydeligt, som krævede ændring af flere trin i BMP produktion metode18. Den producerede BMP2-K3Plk viste biologiske aktivitet sammenlignes med vildtype protein. En forskel optræder ved højt BMP2 koncentrationer, sandsynligvis som følge af en lavere Opløselighed af BMP2-K3Plk variant i medium sammenlignet med vildtype BMP2.
Trods de kendte fordele ved kobber-katalyseret indeholder-alkyn cycloaddition (CuAAC)19, bør CuAAC reaktioner være nøje tilpasset til bestemte programmer. Vi viste, hvordan BMP2 kan være fragmenteret eller oprette aggregater eller multimerer på grund af de stærke reducerende reaktionsbetingelser. Alle reaktion parametre måtte således blive analyseret i detaljer for at finde forhold, der forlader proteinet upåvirket.
Vores tilgang til kovalent par BMP2 variant til indeholder-functionalized Agarosen perler af klik kemi kunne realiseres med høj effektivitet, hvilket resulterer i functionalized perler udløser osteogenic differentiering i vitro. Når vildtype BMP2 protein blev brugt i reaktionen med perlerne i stedet, kunne vi iagttage eneste svage farvning af ALP udtryk, der angiver, at koblingen faktisk opstod meget specifikt via propargyl-L-lyzin rester af BMP2-K3Plk.
Dette positionelle kobling specificitet afspejler en stor forbedring i forhold til immobilisering procedurer, der involverer klassisk NHS/EDC kemi. I sådanne tilfælde opstår tilfældige kobling, primært involverer de primære amine grupper i lysin restkoncentrationer. Den koblede protein har en variabel osteogenic aktivitet, på grund af mangfoldigheden af mulige forbindelser til skafottet, fører til forskellige orienteringer protein retning cellereceptorer.
Brug af websted-direkte immobiliseret BMP2 kan overvinde de nævnte ulemper relateret til de høje doser af opløselige BMP2, som er nødvendig for at fremkalde knogledannelse. Derudover resultaterne viser tydeligt, at visse cellulære svar, såsom osteogenic differentiering af C2C12 celler, udelukkende indledes af immobiliserede BMP2, trods nylige undersøgelser hævder at signal transduktion kræver endocytose af den ligand/ligand-receptor kompleks20,21. Vores resultater er i overensstemmelse med andre undersøgelser viser, at BMP2, som er kombineret kovalent (men ikke site-directed) til ikke-endocytosable overflader, er stadig i stand til at fremkalde osteoblastdannelse differentiering22.
I betragtning af at vi har brugt supra-fysiologiske koncentrationer af BMP2 for kobling reaktion, kan mængden af de immobiliserede BMP2 reduceres yderligere samtidig stadig bevare de osteogenic egenskaber af perlerne. Før optimering foranstaltninger, men skal den BMP2-K3Plk-functionalized stillads testes i dyreforsøg at bevise sin osteogenic potentielle in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. M. Rubini (Konstanz, Tyskland), for at give plasmidet pyrrolysyl-tRNA-kodning og for at give pRSFduet-pyrtRNAsynth-kodning den tilsvarende aminoacyl-tRNA syntetase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E.
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G.
- Costa, G. L., Weiner, M. P.
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R.
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
