Summary

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Abstract

Desenvolvimento do cérebro humano procede através de uma série de precisamente processos orquestradas, com fases anteriores distinguidos pela proliferação, migração e consequência do axônio; e estágios posteriores, caracterizados pela formação de consequência e sinapse axônio/dendrito. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, muitas vezes um ou mais destes processos são rompidas, levando a anormalidades na formação do cérebro e função. Com o advento da tecnologia de células-tronco (hiPSC) humanas pluripotentes induzidas, os pesquisadores têm agora uma fonte abundante de células humanas que podem ser diferenciados em praticamente qualquer tipo de célula, incluindo os neurônios. Estas células podem ser usadas para estudar o desenvolvimento normal do cérebro e patogênese da doença. Um número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar doença Neuropsiquiátrica uso terminalmente diferenciadas neurônios ou uso de sistemas de cultura 3D denominado organoids. Enquanto estes métodos provaram ser inestimáveis em estudar a patogênese de doenças humanas, existem alguns inconvenientes. Diferenciação de hiPSCs em neurônios e geração de organoids são longos e onerosos processos que podem afetar o número de experimentos e variáveis que podem ser avaliadas. Além disso, enquanto organoids e neurônios pós mitóticos permitem o estudo dos processos relacionados a doença, incluindo consequência dendrito e sinaptogênese, eles impedem o estudo de processos anteriores, como a proliferação e migração. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, como o autismo, abundantes provas genéticas e post-mortem indicam defeitos em processos de desenvolvimento precoce. As células precursoras neurais (NPCs), uma população altamente proliferativa da célula, podem ser um modelo adequado em que perguntas sobre processos ontogenéticos e iniciação de doença. Agora estendemos metodologias aprendidas estudando desenvolvimento em camundongo e rato de culturas corticais para NPCs humanas. O uso de NPCs nos permite investigar doença relacionada com fenótipos e definir como diferentes variáveis (por exemplo, fatores de crescimento, drogas) impacto do desenvolvimento processos incluindo proliferação, migração e diferenciação em poucos dias. Em última análise, este conjunto de ferramentas pode ser usado de forma reprodutível e elevado-throughput para identificar mecanismos de doenças específicas e fenótipos em transtornos do desenvolvimento neurológico.

Introduction

A utilização de organismos mais simples e modelos de rato tem elucidados os mecanismos do desenvolvimento cerebral básica, bem como a patogênese da doença. Apesar destes avanços, a etiologia de muitos distúrbios neuropsiquiátricos continua elusiva, porque nem todos os achados em organismos mais simples são diretamente relevantes para os aspectos complexos das doenças humanas. Além disso, a maior complexidade do cérebro humano muitas vezes torna difícil para o modelo de desenvolvimento humano e distúrbios nos animais. Com a evolução e o progresso da tecnologia de células-tronco (hiPSCs) humanas pluripotentes induzidas, as células somáticas podem ser reprogramadas em células-tronco e em seguida diferenciadas em células neuronais para estudar doenças humanas. Avanços em tecnologias hiPSCs e “omic” (genômica, transcriptomics, proteômica, metabolomics) prometem revolucionar a compreensão do desenvolvimento do cérebro humano. Estas tecnologias agora tornam possível uma abordagem de “medicina de precisão” para a caracterização das doenças neuropsiquiátricas em uma base caso-a-caso.

O grampo atual no campo de modelagem de doença hiPSC é para diferenciar as células em subtipos neuronais específicos em uma monocamada ou usar um sistema de cultura 3D chamado um organoides para recapitular aspectos do cérebro desenvolvimento1,2, 3. Estes sistemas foram incrivelmente valiosos em estudando e descobrindo aspectos únicos do desenvolvimento humano e doença4,5,6,7. No entanto, tanto culturas neuronal e organoids muitas vezes exigem em qualquer lugar de semanas a meses na cultura antes de estarem prontos para estudar. A natureza demorada esses protocolos e o montante dos recursos necessários para manter que estes sistemas de cultura muitas vezes limitam o número de experiências que podem ser executadas e o número de variáveis (como fatores de crescimento ou drogas) que podem ser testados. Além disso, muitos estudos utilizando organoids e neurônios pós mitóticos concentraram-se em processos como formação de consequência ou sinapse dendrito, que ocorrem mais tarde, em desenvolvimento. Enquanto estes processos têm sido implicados na patologia dos transtornos globais do desenvolvimento como autismo e esquizofrenia, no início do desenvolvimento eventos que ocorrem antes de diferenciação neuronal definitiva também são importantes para a patogênese da doença8 ,9,10,11,12,13. De fato, estudos genômicos recentes mostram que o período de meados de-fetal, que é composto de proliferação, migração e consequência natural do processo, é particularmente importante na patogênese de autismo11,14. Assim, é importante estudar o tronco neural e populações de células progenitoras para entender melhor estes processos anteriores. Sistemas de organoides que são recapitular considerado para melhor desenvolvimento do cérebro humano devido à sua natureza 3D e estrutura organizada, contêm um pool de progenitor que tem sido utilizado para estudar alguns desses eventos anteriores. No entanto, a população do progenitor em organoids muitas vezes é escassa e mais como células gliais radiais que neural tronco ou progenitoras células5,15. Assim, seria benéfico ter um método de alto throughput para estudar os estágios iniciais de neurodesenvolvimento em uma população de células ativamente proliferativa.

No laboratório, nós criamos um protocolo que utiliza células precursoras neurais hiPSC-derivado (NPCs), uma população mista de haste neural e de células progenitoras que é altamente proliferativas, para estudar processos de desenvolvimento neurológico, como a proliferação, migração celular, e extensão do processo inicial (axônio). Estes ensaios foram desenvolvidos a partir de técnicas utilizadas em nosso laboratório durante décadas para estudar com sucesso neurodesenvolvimento em rato e rato culturas cortical16,17,18,19,20, 21,22,23. Importante, também foi mostrado que fenótipos e sinais regulamentares definidos nos sistemas de cultura de rato e rato são altamente preditivos dos mecanismos que estão ativos na vivo, indicando o valor destas técnicas16, 17,18,19,24. Após a diferenciação inicial de hiPSCs para NPCs, estes métodos permitem estudar processos de desenvolvimento vitais, em questão de dias. Esses métodos têm muitas vantagens: (1) exigem equipamentos pouco sofisticados e são fáceis de implementar, (2) numerosas repetições experimentais podem ser realizadas em um curto período de tempo, permitindo a rápida confirmação da reprodutibilidade dos resultados e (3) variáveis de cultura como matrizes de revestimento, os efeitos de fatores de crescimento e atividade de fármacos podem ser testadas de forma rápida e econômica. Além disso, aproveitamos o papel bem estabelecido extracelulares de fatores de crescimento como reguladores da críticos dos diversos processos de desenvolvimento. NPCs foram expostos para selecionar sinais do desenvolvimento que diretamente estimulam eventos como consequência de axônio, proliferação e migração celular e tem encontrado que eles aprimoram a capacidade de identificar defeitos que não são aparentes em condições de controle19 , 25 , 26 , 27 , 28. da mesma forma, a facilidade de avaliar drogas fornece uma poderosa Avenida para adotar técnicas de medicina de precisão para testar a eficácia de diversas intervenções terapêuticas. Assim, este protocolo facilita um alto throughput, reprodutível e uma metodologia simples para estudar o desenvolvimento precoce do cérebro, patogênese da doença e os potenciais efeitos benéficos de drogas e fatores de crescimento no desenvolvimento neurológico fenótipos.

Protocol

1. segurança procedimentos e manutenção do gabinete de segurança biológica Procedimentos de segurança de nível de biossegurança 2 (BSL-2) Siga as orientações da instituição sobre como trabalhar com materiais BSL-2. Descarte de materiais de BSL-2 de acordo com as práticas da instituição. Indica os quartos e equipamentos que são usados para materiais BSL-2. Use todos os equipamento protetor pessoal (PPE), incluindo luvas e jaleco. Manuten…

Representative Results

Um dos objetivos desses estudos é definir a atividade proliferativa dos NPCs, ou seja, um aumento no número de células. Isto é conseguido através da avaliação de síntese de DNA da população total da célula, uma abordagem de alto rendimento que mede a incorporação de timidina tritiada de traçador radioativo em extratos de células e reflete todas as células empenhadas fase S, se eles são sintetizando, por 5 minutos ou as duas horas inteiras. Além disso, estes ensaios permi…

Discussion

Os protocolos apresentados aqui ilustram métodos rápidos e simples para estudar processos fundamentais de desenvolvimento neurológico e testar drogas usando células precursoras neurais derivadas hiPSC e fatores de crescimento. hiPSC tecnologia revolucionou o estudo da patogênese de doenças do desenvolvimento neurológico, fornecendo-em um acesso sem precedentes para viver humanas células neuronais de indivíduos afetados. De fato, há inúmeros estudos de hiPSC de transtornos de desenvolvimento neurológico, inclu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho do governador de Nova Jersey para pesquisas médicas e tratamento de autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca fundação familiar, Mindworks Charitable Trust de chumbo e a Fundação da comunidade judaica de maior MetroWest NJ.

Materials

PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 
ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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