Summary
Dit protocol illustreert de belangrijke opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de relevantie van het toezicht op de parameter van de vitaliteit en DNA-herstelsynthese in de heropleving van sporen van Bacillus subtilis na behandeling met lage druk plasma door tracking fluorescentie-gelabelde DNA repair eiwitten via time-resolved confocale microscopie en elektronenmicroscopie scannen.
Abstract
Plasma sterilisatie is een veelbelovend alternatief voor conventionele sterilisatie methoden voor industriële, klinisch, en ruimtevaart doeleinden. Lagedruk plasma (LPP) lozingen bevatten een breed spectrum van actieve soorten, die tot snelle microbiële inactivatie leiden. Studeren op de efficiëntie en de mechanismen van sterilisatie door LPP, gebruiken we sporen van het testorganisme Bacillus subtilis vanwege hun buitengewone weerstand tegen conventionele sterilisatie procedures. We beschrijven de productie van B. subtilis spore monolayers, het sterilisatieproces door lagedruk plasma in een dubbele inductief gekoppeld plasma reactor, de karakterisatie van spore morfologie met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM), en de analyse van kieming en uitgroei van sporen door levende cel microscopie. Een belangrijk doelwit van plasma soorten is genomische materiaal (DNA) en reparatie van plasma-geïnduceerde DNA laesies op spore opleving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van het organisme. Hier, bestuderen we de capaciteit van de kieming van sporen en de rol van DNA herstellen tijdens spore ontkieming en uitgroei na behandeling met LPP door het bijhouden van fluorescently-gelabelde DNA reparatie eiwitten (RecA) met time-resolved confocal fluorescentie microscopie. Behandeld en onbehandeld spore monolayers zijn geactiveerd voor kieming en gevisualiseerd met een omgekeerde confocal levende cel Microscoop na verloop van tijd te volgen van de reactie van afzonderlijke sporen. Onze waarnemingen blijkt dat de Fractie van ontkiemen en ontgroei sporen afhankelijk van de duur van LPP-behandeling minimaal bereiken is nadat 120 s. RecA-YFP (gele fluorescentie eiwit) fluorescentie werd alleen in enkele sporen ontdekt en ontwikkeld in alle ontgroei cellen met een lichte verhoging in sporen LPP-behandeld. Bovendien, sommige van de vegetatieve bacteriën afgeleid van LPP-behandelde sporen sprake van een toename in cytoplasma en neiging lyse. De beschreven methoden voor de analyse van afzonderlijke sporen zou exemplarisch zijn voor de studie van andere aspecten van spore kieming en uitgroei.
Introduction
Een belangrijk doel van de verkenning van de ruimte is de zoektocht naar handtekeningen van levensvormen en biomoleculen op andere planetaire lichamen en manen in ons zonnestelsel. De overdracht van micro-organismen of biomoleculen van terrestrische oorsprong naar kritieke gebieden van exploratie is bijzonder risico bestaat om de impact van de ontwikkeling en de integriteit van leven-detectie missies op planetaire lichamen zoals Mars en Europa1. De internationale richtlijnen voor de bescherming van de planetaire, vastgesteld door het Comité voor ruimte onderzoek (COSPAR) in 1967, strikte regels op bemande en gerobotiseerde missies naar andere planeten, hun manen, asteroïden en andere hemellichamen opleggen en regelen de reiniging en sterilisatie van een ruimtevaartuig en essentiële hardwarecomponenten vooraf te lanceren om te elimineren besmetten terrestrische micro-organismen en het voorkomen van kruisbesmetting van hemellichamen2. In het afgelopen decennium, heeft de toepassing van niet-thermisch plasma's opgedaan brede aandacht in biomedische en nutritionele onderzoek, evenals in de bemande ruimtevaart toepassingen3,4,5. Plasma sterilisatie is een veelbelovend alternatief aan conventionele sterilisatie-methodes, want het biedt snelle en efficiënte microbiële inactivatie6, terwijl het zacht om gevoelige en hitte-labiele materialen. Plasma lozingen bevatten een mengsel van reactieve agenten zoals vrije radicalen, geladen deeltjes, fotonen in het ultraviolette (UV) en vacuüm ultraviolet (VUV) spectrum die tot snelle microbiële inactivatie3 leidenneutrale/opgewonden atomen. In deze studie, we gebruiken lagedruk plasma gegenereerd door dubbele inductief gekoppeld lagedruk plasma (DICP) bron-7,8 te inactivering van Bacillus subtilis endosporen verdeeld over test glasoppervlak.
Gram-positieve bacteriën van de familie Bacillaceae zijn op grote schaal verspreid in natuurlijke habitats van bodem, sedimenten en lucht evenals in ongewone omgevingen zoals schone Kamerfaciliteiten en de International Space Station9,10 ,11. De meest duidelijke functie van het geslacht Bacillus is de mogelijkheid om zeer resistent slapende endosporen (hierna "sporen" genoemd) om te overleven van ongunstige omstandigheden, zoals de uitputting van de voedende12vormen. Sporen zijn over het algemeen veel bestendiger dan hun tegenhangers van de vegetatieve cel naar een groot aantal behandelingen en milieu benadrukt, met inbegrip van warmte, UV, gamma bestraling, uitdroging, verstoring van de mechanische en giftige chemische stoffen, zoals sterke oxidatiemiddelen of pH-veranderende agenten (herzien in verwijzingen13,14) en zijn daarom ideaal objecten voor het testen van de efficiëntie van de microbiële inactivatie methoden. Aangezien genomic DNA een belangrijke doelstelling van de plasma behandeling van bacteriën15,16, de reparatie van plasma-geïnduceerde DNA laesies is (bijvoorbeeld dubbele bundel van DNA breekt) op spore opleving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van de bacteriën13, 17.
Dus, we bestuderen de kiemkracht van de sporen en de rol van DNA-herstel tijdens spore ontkieming en uitgroei na behandeling van de sporen met lage druk argon plasma door volgende afzonderlijke sporen en hun uitdrukking van fluorescentie-gelabelde DNA herstellen eiwit RecA met time-resolved confocal fluorescentie microscopie. We geven een stap voor stap instructie van de voorbereiding van B. subtilis sporen in monolayers om reproduceerbare testresultaten, de behandeling van spore monolayers met lage druk plasma voor sterilisatie, de voorbereiding van plasma behandeld sporen voor Ultrastructurele evaluatie met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM) en levende cel microscopie analyse op het niveau van individuele sporen in concert met het toezicht op de actieve DNA-herstelprocessen die zich voordoen binnen de cel op reactie op plasma behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacillus subtilis Spore productie en zuivering
- Voor de productie van de spore, overdracht van een overnachting cultuur van 5 mL van de respectieve B. subtilis stam, aangevuld met de juiste antibiotica, 200 mL dubbele sterkte Schaeffer sporevorming vloeistof (per liter 16 g nutriënten Bouillon, KCl 2 g, 0,5 g MgSO 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (3)2, 2 mL 0,1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL 50% (m/v) glucose18) en ontwikkelt met krachtige beluchting bij 37 ° C gedurende 72 uur of tot > 95% van de cultuur heeft sporevorm. De sporen van volgende stammen worden gebruikt: B. subtilis PY79 (wild type) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (tekort van DNA reparatie proteïne RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: kat (RecA gefuseerd met geel fluorescerende eiwit [YFP]19).
- Oogst van sporen door centrifugeren gedurende 15 minuten op 3000 x g in 50 mL tubes en zuiveren van de monsters door herhaalde wassen stappen (maximaal 15 keer) die via steriel gedistilleerd H2O en controleer de status van de zuiverheid en de kiemkracht door fase contrast microscopie. Ervoor zorgen dat spore schorsingen bestaan uit fase-lichte sporen (> 99%) en zijn vrij van vegetatieve cellen (staven), ontkiemde sporen (zwart / grijs verschijning) en cel puin, anders verder microscopie experimenten kunnen worden verstoord. Was het monster totdat het gewenste zuiverheid is bereikt.
- De titer van de spore door beplating uit 50 µL 10-fold seriële verdunningen op LB-agar io (dat wil zeggen: gebruik 30 µL monster + 270 µL steriel water voor een 1:10 verdunning. Neem 30 µL van de bijzondere verdunning op 270 µL H2O voor de verdunning van een 1:100 enzovoort) voor het berekenen van de CFU (kolonievormende eenheden) en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Na de vaststelling van de CFU, aanpassen aan 109 sporen per mL monster door zich te concentreren of verdunnen met steriel water.
2. bereiding van aërosol-gestort Bacillus subtilis sporen
Opmerking: Accumulatie en overlapping tussen de sporen kunnen leiden tot schaduw effecten tijdens de behandeling, uiteindelijk resulterend in vervalste inactivatie kinetiek. Om dit probleem te minimaliseren, spore monsters te bereiden door een aërosol-afzetting techniek20. Kort, controleren de hoge precisie twee-stof-mondstuk met een elektrische timer die de vloeibare doorvoer in concert met de stroom van hydrofoor draaggas (hier N2 regelt). Het verspreiden van het geïnjecteerde vloeistof monster via het mondstuk stopcontact met behulp van de gasstroming stikstof.
- Plaats de drager van een monster in de vorm van gesteriliseerde microscopische dia's (voor overleving kinetiek) of ronde 25 mm coverslips (voor TL volgen van DNA-herstel processen/cLSM; confocale laser scanning microscopie) binnen het elektrisch bediende aërosol spuiten eenheid in afstemming met het mondstuk. De gebruikte spore-concentratie moet overeenkomen met een van de gewenste eindconcentratie honderdvoudig.
- 1 mL van de cultuur van de spore overbrengen in het mondstuk vloeistof inlaat en leidt hij het sproeien proces van 0,1 s bij een druk van 1,3 bar. De gespoten entsuspensie (1 x 107) vormt een dunne film over de microscopische dia die snel binnen een minuut droogt tot het vormen van een gelijkmatig verdeelde spore enkelgelaagde. De behandelde monster dragers worden opgeslagen in een steriele verpakking bij kamertemperatuur.
3. lage druk Plasma behandeling
- Bereid de plasma-systeem voor de behandeling van biologische monsters en functioneren van het systeem op 5 Pa met argon plasma bij 500 W voor 5 min. Door dit, worden alle oppervlakken in het systeem gereinigd en opgewarmd. Hierdoor steken van moleculen uit de lucht, namelijk stikstof, zuurstof en water, terwijl de ontluchting van het systeem. Na de voorbehandeling van het systeem, luchten van de kamer en plaats de monsters zorgvuldig in het midden van het schip van de reactor met behulp van glas rekken.
- Het gebruik van ten minste drie replicaat-biologische organismen. Sluit de zaal en evacueren hieronder 2 Pa. Vul daarna het proces gas in de kamer. Regelen van de druk in het systeem 5 Pa.
- Uitschakelen van de elektriciteits- en gassector levering na de gedefinieerde verwerkingstijd, en zorgvuldig vent het systeem om te voorkomen dat de monsters van de monsterhouder waait. Na ventilatie, verwijderen van de monsters en plaats de monsters voor de volgende parameter in het systeem. Voor niet-plasma-behandelde controles bloot te vacuüm alleen monsters (5 Pa) in aanwezigheid van het proces gas gelijk aan de langste toegepaste plasma-tijd.
4. herstel en evaluatie van Spore Survival
- Bereiden van een oplossing van gesteriliseerde met autoclaaf 10% polyvinylacetaat (PVA), dekken de vervoerder monster zorgvuldig met ongeveer 500 µL en laat ze aan voor 4 h. Strip uit de gedroogde PVA-laag (nu met het spore-monster) met behulp van steriele pincet en overbrengen naar een 2 mL reactiebuis. Voeg 1 mL steriel water aan de buis en los de PVA laag via vortexing. Deze procedure leidt tot > 95% terugwinning van sporen en heeft geen invloed op hun kiemkracht vermogen21.
- Serieel Verdun het monster op 1:10 in steriel water in een 96-wells-plaat (d.w.z. 270 µL steriele H2O + 30 µL monster/voormalige verdunning). Plaat uit 50 µL van elke verdunning op lysogenie Bouillon nutriënt agar (LB), Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts en opsommen en zo het aantal volwassen koloniën (CFU).
5. levende cel microscopie en Tracking van DNA-herstelsynthese in sporen ontkiemen
- Voor de kieming experimenten, bereiden een 1 mm dik 1,5% LB-agar pad, door het koken van 700 µL medium en Pipetteer in een petrischaal steriele microscopie. Na 10 min, Knip een 8 x 8 mm x 1 mm LB-agar pad met een steriel scalpel en breng de agar voorzichtig op de top van de spore monolayers die op 25 mm glas coverslips rusten.
Opmerking: Deze stap is cruciaal voor de visualisatie van afzonderlijke sporen en laten hun reactie, op weg naar de activering van kiemkracht geïnduceerd door de nutriëntagar. De LB-agar dient dus twee doelen, (1) het oplossen van de sporen aan het oppervlak, die Herlokalisatie langs het oppervlak en optische onscherp vermijdt, en (2) activeren van de spore voor de kiemkracht. - Na die betrekking hebben op het monster met agar, breng het dekglaasje glas aan snel in een imaging kamer en Microscoop de monsters met een geautomatiseerde confocale laser scanning microscoop met omgekeerde optica met behulp van een 63 X / 1.3 vliegtuig apochromatische olie onderdompeling doelstelling.
-
Uitvoeren van beeldvorming van fluorescentie (YFP) met een excitatie golflengte van 514 nm en emissie kan worden ontdekt tussen 520- en 560 nm.
- Record helder-veld beelden in de scanmodus met behulp van een van de foto multiplicatoren (verzonden-licht pad).
- Vastleggen van time-lapse serie met een kracht van de laser van 2,6%, en de confocal diafragma instellen tot 5 luchtige eenheden en met een samplefrequentie van 1 frame per 30 s van 0 h tot en met 5 h, afhankelijk van het experiment. Het is vermeldenswaardig dat hoge doses van monochromatisch laser verlichting op 514 nm remmen volledig kiemkracht (Figuur 1A, B).
- Houd de monsters bij 37 ° C (de luchtvochtigheid) in een fase van verwarming tijdens de gehele procedure. Gebruik ten minste drie biologische replicatieonderzoeken voor elke voorwaarde. In geval van spore aggregatie, distributie van meerdere lagen spore of vervuiling door stofdeeltjes, blokkering van de plasma behandeling ("schaduwen") zou kunnen optreden en inschakelen van de ontkieming van schaduw sporen (Figuur 1C, D).
Figuur 1: potentiële problemen waargenomen tijdens de confocal levende cel fluorescentie microscopie van plasma behandeld sporen. (A, B) Remming van de spore kiemkracht door hoge doses van monochromatisch (514 nm) laser verlichting. (A) overzicht (3 x 3 gestikte beelden) van B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporen 180 min na inleiding van kiemkracht. Het frame in het midden werd blootgesteld 30 s tussenpozen aan hoge doses van laserlicht (514 nm, 70% laser macht) Overwegende dat de omringende regio's (= frames) waren niet verlicht (samengevoegde afbeelding van helder-veld kanaal en RecA-YFP fluorescentie; besteld structuren werden veroorzaakt door het gebruik van 35 mm imaging gerechten met een raster ingeprinte 500 µm). (B) toont een 4 X vergrote weergave van de grens tussen het verlichte en niet-verlicht in de regio dat sporen, die werden blootgesteld aan hoge doses van monochromatisch laser verlichting niet ontkiemen en groeien, overwegende dat sporen niet-verlichte gebieden herstellen volledig naar vegetatieve bacteriën uiting van heldere RecA-YFP fluorescentie (groene signaal). (C, D) Sporen vallende verontreinigende deeltjes of meerdere lagen van spore (pijlen) lijkt onderliggende sporen behoeden voor inactivatie door plasma behandeling en laat hun kiemkracht en uitgroei ("schaduw effect"). (C) sporen waren plasma-behandeld voor 60 s en verbeelde 180 min na inleiding van kiemkracht of in (D) voor 120 s en beeld na 240 min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
6. scanning elektronen microscopie (SEM)
- Gebruik scanning elektronen microscopie ultrastructurele informatie bieden over de bovengrondse morfologie van plasma behandeld sporen in vergelijking met onbehandelde controles. Jas van gedroogde spore monolayers op coverslips met goud-palladium (3 nm) met behulp van een sputter-coater. Gebruik een veld-emissie scannende elektronen microscoop voor de monsters, gevoed met 5 kV versnelling spanning met inbegrip van een in-lens secundaire electron detector te onthullen topografie contrast denkbaar.
7. de gegevensanalyse
- Bepalen het voortbestaan van de spore uit het quotiënt0is N/N, waar N staat voor het gemiddelde CFU van behandelde monsters en N0 is de gemiddelde CFU van onbehandelde vacuüm controles. Plot spore inactivatie door argon plasma behandeling als een functie van de tijd (in seconden). Als gemiddelden en standaardafwijkingen uiting te geven aan alle gegevens (n = 3).
- Analyseren van beelden verkregen door levende cellen geschikt zijn met behulp van het imaging software. Kwantificeren van het aandeel van de spore kieming en ontgroei na plasma behandeling, sporen in representatieve frames aan het begin van het experiment en na 4 uur tellen. Voor de bepaling van betekenis in spore overleving assays, gebruik one-way ANOVA-tests (variantie-analyse) met statistische software). P -waarden < 0.05 worden beschouwd als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voortbestaan van plasma-behandelde B. subtilis sporen
Plasma behandeling van de sporen van B. subtilis gebruikt in deze studie show een afname van de overleving met het verhogen van de duur van de plasma behandeling (Figuur 2). Sporen van de stam de recAuitdrukken-gen gesmolten tot YFP toonde overleving curven vergelijkbaar met sporen van de wild type stam, die aangeeft dat de genetische modificatie geen significante invloed op de bacteriële vitaliteit heeft. Sporen van de stam van RecA-deficiënte vertonen een hogere gevoeligheid voor plasma behandeling in vergelijking met sporen van de wild type stam, aan te tonen dat de aanwezigheid van het gen RecA is het verminderen van plasma-geïnduceerde verlies van vitaliteit. Vooral korte plasma behandeling van 15 s (P <0.003) en 30 s (P < 0.004) leiden tot een aanzienlijke daling van de vitaliteit in RecA-deficiënte stammen in vergelijking met wild type en RecA-YFP stammen. Na 90 s van plasma behandeling, de vitaliteit van alle stammen wordt verminderd door ongeveer drie ordes van grootte.
Figuur 2: Voortbestaan van B. subtilis sporen van verschillende stammen na behandeling met lagedruk argon plasma. Voortbestaan (gemiddelde CFU van plasma behandeld sporen/gemiddelde CFU van vacuüm behandelde sporen; foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie) wordt uitgezet tegen de duur van de plasma behandeling. PY79 (wild type; gesloten cirkels), LAS72 (RecA-YFP, omringd door grijze rondjes) en LAS24 (ΔrecA; open cirkels). Statistische analyse toonde geen significante verschillen in het overlevingsvermogen van de spore tussen PY79 (ongewijzigd RecA) en LAS72 (RecA-YFP-fusion).
Ultrastructurele analyse van plasma-behandelde sporen door SEM
Om een idee van de morfologische effecten van het plasma werd behandeling op de sporen, scanning elektronen microscopie (SEM) gebruikt voor het analyseren van de bovengrondse morfologie van plasma behandeld sporen in vergelijking met vacuüm-behandelde sporen (control). Het buitenoppervlak van B. subtilis sporen onthullen karakteristiek longitudinale ridge-achtige structuren die voortdurend zichtbaar zijn in alle behandelde en onbehandelde sporen (Figuur 3). Plasma behandeling tot 30 s induceert geen significante veranderingen van de morfologie spore oppervlakte in vergelijking met controle (Figuur 3A-C). Verhoging van de duur van de plasma behandeling (60-240 s) leidt tot een meer granulair spore oppervlak (Figuur 3D-F) en kleine scheuren en kloven kunnen worden waargenomen in sporen behandeld voor 120 of 240 s. Bovendien, kleine bolletjes ontstaan op spore oppervlakken (120 s en 240 s behandelingen, Figuur 3E, F), die wordt veroorzaakt door vrijgegeven materiaal van de jas, schors of uit de binnenste kern22. Deze bolletjes dekken de hele spore en kunnen worden gevonden op de ader-vormige structuren evenals op tussenliggende oppervlakken.
Figuur 3: SEM van B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporen gespoten op glas coverslips na de lagedruk plasma behandeling. Sporen worden blootgesteld aan vacuüm alleen en niet aan plasma (control) staan in (A). (B-F) Sporen die plasma-behandeld waren met toenemende duur (15, 30, 60, 120 en 240 s). Sporen die plasma-behandeld 60 waren s of meer weergegeven meer granulair aan hun oppervlak dan controle sporen of sporen die werden plasma-behandeld voor 15 en 30 s. barsten en kloven (witte pijlen) zichtbaar op het oppervlak van sporen plasma-behandeld voor 120 of 240 s. zijn Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Live cel microscopie van plasma-behandelde B. subtilis sporen
Levende cel microscopie van heropleving van sporen van B. subtilis stammen uitdrukken van de fluorescentie-gelabelde reparatie proteïne RecA (RecA-YFP) wordt uitgevoerd om te analyseren de kiemkracht en de uitdrukking van RecA-YFP van afzonderlijke sporen in reactie op plasma behandeling. Hier, gebruiken we tijd-resolved confocale laser scanning microscopie te volgen van kiemkracht, uitgroei en progressie in vegetatieve toestand van plasma-behandelde sporen (Figuur 4) met betrekking tot mogelijk bekende problemen bijvoorbeeld schaduw effecten of de remming van de ontkieming van hoge doses van monochromatisch laser verlichting (Figuur 1). Paar TL signalen vertonen sporen blootgesteld aan vacuüm enige (besturingselement, Figuur 4A-C), tijdens de vroege Staten van spore revival (0 - 65 min, niet afgebeeld). Een toename van de intensiteit van de fluorescentie, meest waarschijnlijk te wijten aan accumulatie van RecA-YFP, is waargenomen bij ≥ 65 min vegetatieve cellen worden gevormd als eerste cellen beginnen te verdelen. Al deze cellen haven een signaal van de fluorescentie opgebouwd in ten minste één positie binnenkant van elke cel. Bijna alle sporen (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) behandeld met vacuüm als een besturingselement ontkiemen en ontwikkelen van de morfologie van een staafvormig cel met een tamelijk uniforme lengte van afzonderlijke cellen (Figuur 4B-C). In tegenstelling tot de sporen in vacuüm besturingselementen, sporen behandeld voor 15 s met plasma Toon al een verminderde kiemkracht van minder dan 75 ± 4% (197 ± 8 sporen, n = 3, Figuur 4D-F), die aangeeft dat plasma behandeling schade in slapende sporen induceert, dat voorkomt kieming. Bovendien, verschilt de morfologie van cellen ontgroei van de morfologie van cellen in besturingselementen. Cellen hetzij in uitgebreid lange staven (langer dan in vergelijking met controle) groeien of klein blijven en stok in de vacht van de spore (Figuur 4G-ik). Bovendien, meest langgerekte cellen lyse met het verhogen van de grootte van de cel (witte pijl hoofden, Figuur 4F). Signalen van de fluorescentie van RecA-YFP binnen de cellen lijken te worden iets verhoogd in vergelijking met de signalen in cellen (Figuur 4C, F), maar geen significante verschillen waarneembaar (niet afgebeeld). Sporen die plasma waren behandeld voor 30 s ontkiemen tot 25 ± 6% (99 ± 4 sporen, n = 3) en de vegetatieve cellen zijn met name vertraagd in de groei in vergelijking met controle sporen en sporen na 15 albums van plasma-behandeling. Vegetatieve cellen zijn nogal klein en staafvormig maar variëren in lengte (Figuur 4G-ik). Echter, cellen van alle soorten en maten kunnen lyse tijdens langere incubatietijd tijden zoals gezien voor de monsters na 15 albums van plasma-behandeling. Na 60 s van plasma-behandeling minder dan 2 ± 2% (8 ± 8 sporen, n = 3) sporen zijn kunnen vormen vegetatieve cellen (Figuur 4J-L). Sporen die worden plasma-behandeld voor 90, 120 of 240 s kan worden geanalyseerd, maar ze vertonen geen uitgroei of wijzigingen fluorescentie niveaus van RecA-YFP (niet afgebeeld).
Figuur 4: Confocale laser-scannen leven cel microscopie van B. subtilis sporen van een stam uiting van RecA-YFP na plasma behandeling en tijdens het initiëren van kiemkracht. Sporen werden gevolgd na verloop van tijd (één afbeelding per 30 s) en beelden voor tijd-punten 0, 2 en 4 h staan. (A-C) Sporen behandeld met vacuüm alleen niet met plasma (control) ontkiemen en groeien uit tot vegetatieve cellen (B) en voeren exponentiële groeifase (C). (D-L) Sporen behandeld voor de duur van de verschillende met de lagedruk argon plasma tonen aanzienlijke verschillen in hun uitgroei in vergelijking met de sporen van het besturingselement (zie tekst voor meer informatie). (D-F) 15 s behandeling (witte pijl hoofden vertegenwoordigen vegetatieve cellen, die onlangs lysed), (G-ik) 30 s behandeling (zwarte pijl hoofden visualiseren vegetatieve cellen, die klein waren en stok in de vacht van de spore) en (J-L) 60 s behandeling na 0 h, 2 h en 4 h spore hersteltijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisatie van oppervlakken met behulp van lage-temperatuur, lagedruk plasma is een veelbelovend alternatief aan vrij conventioneel sterilisatie procedures zoals behandeling met ioniserende straling, chemische stoffen (zoals gassen als H2O2 of ethyleenoxide) of droge en vochtige warmte23. Gewone sterilisatie methoden bieden meestal een doeltreffende sterilisatie, maar ze zijn bekend om te beïnvloeden het behandelde materiaal en vertegenwoordigen een potentieel risico voor de exploitant. Lagedruk plasma biedt een snelle en homogene biologische inactivering met behulp van de samenstelling van de verschillende componenten zoals UV fotonen, vrije elektronen, ionen en verlaten atomen of moleculen (bijvoorbeeld ROS). LPP kan daarom worden toegepast op warmte- en corrosie gevoelige materialen, zoals thermoplastische polymeren voor implantaten, elektronische instrumenten of complexe 3D-structuren. In het huidige document we aantonen dat de toepassing van een dergelijk testsysteem, welke monolayers van gespoten B. subtilis sporen20 worden behandeld in een bepaalde lagedruk plasma reactor die onlangs werd beschreven in detail7. Microscopisch onderzoek van de heldere-veld van plasma-behandelde sporen kan volstaan voor het verkrijgen van een globale raming op van de efficiëntie van de sterilisatie. Echter, wij zijn geïnteresseerd in het gericht op de onderliggende mechanismen van lagedruk plasma en de invloed daarvan op spore inactivatie op een moleculair niveau. In combinatie met lichten-tracking microscopie het stelt ons in staat om licht werpen op de details van deze specifieke moleculaire reactie in plasma-behandelde sporen en potentieel geven ons inzicht in de fundamentele inactivatie-mechanisme van lagedruk plasma.
Hier, richten we op de analyse van de efficiëntie van de plasma-behandeling en de effecten met behulp van levende cellen microscopie, waarmee afzonderlijke sporen na inleiding van kiemkracht. Deze specifieke aanpak blijkt opmerkelijk, een aantal nieuwe resultaten die niet kunnen worden verstrekt door het meten van de revitalisatie van de bevolking van de gehele spore met behulp van de bepaling van het celaantal of CFU. Eerst en vooral, plasma-behandeling van sporen niet alleen aangaat de capaciteit van uitgroei op een dosis-afhankelijke manier, zoals verwacht uit de meting van de overleving door bepaling van de CFUs, maar ook de morfologie van vegetatieve cellen, die vaak de ontwikkeling van grote staven naar formulier septa volgens goede celdeling samen met kleine cellen steken in de spore (15 s van plasma-behandeling) of cellen bij een beperkte lengte (30 s van plasma-behandeling). Waarnemingen van cellen met beperkte lengte toonde geen herstel tot normale cel lengte op latere tijdstippen. Bovendien leven cel imaging blijkt dat de meeste van de morfologisch gewijzigde cellen lyse in latere stadia van observatie. Dit betekent dat schade overgenomen door de sporen tijdens de plasma-behandeling alleen effectief in latere stadia van spore revitalisatie, vermoedelijk als gevolg van DNA-schade is en dat de machine die wordt gebruikt voor de ontkieming en uitgroei robuuster naar plasma sterilisatie dan is de machines die nodig zijn voor vegetatieve groei. Opmerkelijk, expressie van het DNA-reparatie RecA-eiwit lijkt te zijn laag en bijna afwezig in sporen en ontwikkelt tijdens de uitgroei en vegetatieve fase, zoals aangegeven door een toename van de fluorescentie RecA-YFP17. Echter, zelfs een licht verhoogd RecA expressie in ontgroei plasma-behandelde sporen, in vergelijking met controle sporen, helpt niet om te redden van de vitaliteit van de cel kwantitatief, omdat de meeste cellen lyse of na uitgroei, vooral na meer dan 3 uur barsten incubatie. Dit effect kan worden gevisualiseerd met behulp van levende cellen films van time lapse beelden van gekiemde sporen. We kunnen niet uitsluiten dat dit effect genoeg is benadrukt door de conditie van de bepaalde teelt waar de cellen worden gedwongen in een enkelgelaagde met behulp van een dunne bedekking van agar.
Een ander resultaat van de analyse van levende cellen microscopie is dat deeltjes verontreinigingen (bijvoorbeeld stofdeeltjes, andere sporen) op het oppervlak van spore enkelgelaagde de onderliggende sporen van de schadelijke effecten van het plasma kunnen beschermen. In dergelijke gevallen lijkt zelfs langer plasma-behandeling inefficiënt te zijn. Aangezien dergelijke besmettingen moeilijk zijn te vermijden volledig, moeten alternatieve plasma-behandeling strategieën worden getest, zoals het gebruik van planetaire rotatie tijdens plasma behandeling in combinatie met de verlenging van de duur van de behandeling. De analyse door SEM geeft aan dat de vacht van de spore is geperforeerd met verhoogde duur van de plasma-behandeling die strookt met de theorie van de plasma-gemedieerde effecten op materie22,24. Een langdurige blootstellingstijd (> 240 s) aan plasma misschien zelfs perforate de verontreinigende deeltjes en dus kan beschadigen en inactivering van de onderliggende sporen.
Het gepresenteerde protocol voor levende cellen microscopie van spore ontkieming en uitgroei kunnen geschikt voor ook andere studies. Die betrekking hebben op de sporen met een dun laagje agar dwingt de sporen in een verschillende optische vlak en beperkt de laterale beweging. Beide effecten zorgen dat sporen en ontgroei cellen binnen het geselecteerde imaging frame blijven. Soortgelijke benaderingen zijn beschreven vóór25 maar geven minder flexibel dan de methode die hier worden beschreven waarmee vrijwel elke steekproef drager (bijvoorbeeld een glasplaatje, dekglaasje aan of petrischaal) kiezen. In onze handen kunnen andere vegetatieve bacteriën worden geanalyseerd door levende cel microscopie met behulp van de methode agar-bedekking). In ieder geval moeten zorgvuldige controle experimenten worden uitgevoerd om te evalueren van mogelijke effecten van foto schade tijdens de levende cel imaging, omdat we waargenomen dat hoge doses van monochromatisch laserlicht volledig spore kiemkracht remmen. Naast het verkorten van de verlichting tijd, dat wil zeggen door het verhogen van de frequentie van observatie, kan dit verschijnsel worden voorkomen door het verminderen van de intensiteit van de laser en/of de opening van de confocal diafragma (gaatje).
Kortom, onder de technieken die worden gebruikt voor het bestuderen van de efficiëntie van plasma-behandeling in het model van gespoten B. subtilis spore monolayers, levende cel microscopie biedt unieke inzichten in cellulaire gebeurtenissen tijdens spore revival en biedt de mogelijkheid voor het analyseren van de dynamiek van de fluorescentie-gelabelde proteïnen. Bovendien, de bijzondere monsterverwerking, dat wil zeggen dekking van sporen met een dun laagje agar, zou paradigmatische voor de beeldvorming van andere micro-organismen door levende cel microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Andrea Schröder bedanken de auteurs voor haar uitstekende technische bijstand tijdens delen van dit werk en Nikea J. Ulrich voor haar hulp tijdens de video-shoot. Wij willen ook Lyle A. Simmons bedanken voor zijn genereuze donatie van de stammen van Bacillus subtilis : LAS72 en LAS24. Dit werk werd ondersteund in delen door subsidies uit de Duitse Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) aan PA (AW 7/3-1) en RM (MO 2023/2-1) en de DLR toekennen DLR-FuW-Projekt ISS leven, Programm RF-FuW Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. en R.M.). F.M.F. werd ondersteund door een PhD scholarship van de Helmholtz ruimte Life Sciences Research School (SpaceLife) op de Duitse Aerospace Center (DLR) in Keulen, Duitsland, die werd gefinancierd door het Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) over een periode van zes jaar ( Grant nr. VH-ko-300) en extra middelen ontvangen de DLR, met inbegrip van lucht-en ruimtevaart Raad van bestuur en het Instituut voor lucht-en ruimtevaartindustrie geneeskunde. De resultaten van deze studie zullen worden opgenomen in de doctoraatsthesis van Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
