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Biology

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बैसिलस सबटिलिस बीजाणुओं के अस्तित्व पर कम दबाव प्लाज्मा नसबंदी के हानिकारक प्रभावों की जांच

Published: November 30, 2017 doi: 10.3791/56666
Automatic Translation
1, 1,2,3, 2, 4, 2, 4, 3, 1
1Department of Radiation Biology, Institute of Aerospace Medicine, Space Microbiology Research Group, German Aerospace Center (DLR e.V.), 2Institute of Electrical Engineering and Plasma Technology, Faculty of Electrical Engineering and Information Technology, Ruhr-University Bochum, 3Institute of Electrical Engineering and Plasma Technology, Faculty of Electrical Engineering and Information Technology, Biomedical Applications of Plasma Technology, Ruhr-University Bochum, 4Advanced Light and Electron Microscopy (ZBS 4), Robert Koch Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण लगातार कदम पर नज़र रखने के द्वारा कम दबाव प्लाज्मा के साथ उपचार के बाद बैसिलस सबटिलिस बीजाणु को पुनर्जीवित करने में जीवन शक्ति पैरामीटर और डीएनए की मरंमत प्रक्रियाओं की प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए आवश्यक दिखाता है प्रतिदीप्ति-बला समय के माध्यम से डीएनए की मरंमत प्रोटीन-संकल्पित फोकल माइक्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ।

Abstract

प्लाज्मा नसबंदी औद्योगिक, नैदानिक और spaceflight प्रयोजनों के लिए पारंपरिक नसबंदी तरीकों के लिए एक होनहार विकल्प है । कम दबाव प्लाज्मा (LPP) निर्वहन सक्रिय प्रजातियों, जो तेजी से माइक्रोबियल निष्क्रियता के लिए नेतृत्व की एक व्यापक स्पेक्ट्रम होते हैं । LPP द्वारा नसबंदी की दक्षता और तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम पारंपरिक बंध्याकरण प्रक्रियाओं के खिलाफ अपने असाधारण प्रतिरोध के कारण परीक्षण जीव बैसिलस सबटिलिस के बीजाणुओं का उपयोग करते हैं । हम सबटिलिस बीजाणु monolayers के उत्पादन का वर्णन, एक डबल inductively युग्मित प्लाज्मा रिएक्टर में कम दबाव प्लाज्मा द्वारा नसबंदी प्रक्रिया, बीजाणु के लक्षण विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर, और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के द्वारा बीजों के अंकुरण और वृद्धि का विश्लेषण । प्लाज्मा प्रजातियों का एक प्रमुख लक्ष्य जीनोमिक सामग्री (डीएनए) और बीजाणु पुनर्जीवित पर प्लाज्मा प्रेरित डीएनए घावों की मरंमत जीव के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है । यहां हम बीजाणुओं की अंकुरण क्षमता और बीजाणु अंकुरण के दौरान डीएनए की मरंमत की भूमिका का अध्ययन करते है और समय-हल फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट-बला डीएनए रिपेयर प्रोटीन (RecA) पर नज़र रखकर LPP के साथ उपचार के बाद वृद्धि करते हैं । इलाज और अनुपचारित बीजाणु monolayers अंकुरण के लिए सक्रिय कर रहे हैं और व्यक्तिगत बीजाणुओं की प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए समय के साथ एक औंधा फोकल लाइव सेल माइक्रोस्कोप के साथ visualized. हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि अंकुरण और बीजाणुओं को कम करने का अंश LPP-उपचार की अवधि पर निर्भर है, १२० s. RecA-YFP (yellow प्रतिदीप्ति प्रोटीन) प्रतिदीप्ति के बाद केवल कुछ बीजाणुओं में पाया गया और सभी में विकसित LPP-उपचारित बीजाणुओं में थोड़ी सी ऊंचाई के साथ कोशिकाओं को तबदील करना । इसके अलावा, LPP-उपचारित बीजाणुओं से प्राप्त वनस्पति जीवाणुओं में से कुछ में कोशिका में वृद्धि हुई और लाइसे की प्रवृत्ति दिखाई दी । व्यक्तिगत बीजाणुओं के विश्लेषण के लिए वर्णित तरीके बीजाणु अंकुरण और वृद्धि के अन्य पहलुओं के अध्ययन के लिए अनुकरणीय हो सकते हैं ।

Introduction

अंतरिक्ष अन्वेषण का एक प्रमुख लक्ष्य जीवन रूपों और अन्य ग्रहों के शरीर और हमारे सौर मंडल में चंद्रमाओं पर अणुओं के हस्ताक्षर के लिए खोज है । सूक्ष्मजीवों या अंवेषण के महत्वपूर्ण क्षेत्रों के लिए स्थलीय मूल के अणुओं के हस्तांतरण विशेष रूप से इस तरह के मंगल और यूरोपा1के रूप में ग्रहों के शरीर पर जीवन का पता लगाने मिशन के विकास और अखंडता को प्रभावित करने के लिए जोखिम की है । ग्रहों की सुरक्षा के अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देश, १९६७ में अंतरिक्ष अनुसंधान (COSPAR) की समिति द्वारा स्थापित, अंय ग्रहों, उनके चांद, क्षुद्रग्रह, और अंय खगोलीय पिंडों को आबाद और रोबोट मिशन पर सख्त नियमों थोपना और विनियमित सफाई और एक अंतरिक्ष यान और महत्वपूर्ण हार्डवेयर घटकों की नसबंदी के लिए शुरू करने से पहले प्रदूषित स्थलीय सूक्ष्मजीवों को खत्म करने और खगोलीय पिंडों के पार संक्रमण को रोकने के लिए2। पिछले दशक के दौरान, गैर थर्मल प्लाज्मा के आवेदन जैव चिकित्सा और पोषण अनुसंधान में व्यापक ध्यान प्राप्त किया है, साथ ही साथ spaceflight अनुप्रयोगों में3,4,5। प्लाज्मा नसबंदी पारंपरिक नसबंदी तरीकों के लिए एक होनहार विकल्प है के रूप में यह तेजी से और कुशल माइक्रोबियल निष्क्रियता प्रदान करता है6, जबकि संवेदनशील और गर्मी labile सामग्री के लिए कोमल जा रहा है । प्लाज्मा निर्वहन ऐसे मुक्त कण के रूप में प्रतिक्रियाशील एजेंटों का एक मिश्रण होते हैं, आरोप कणों, तटस्थ/उत्तेजित परमाणुओं, पराबैंगनी (यूवी) में फोटॉनों, और वैक्यूम पराबैंगनी (VUV) स्पेक्ट्रम जो तेजी से माइक्रोबियल निष्क्रियता के लिए सीसा3। इस अध्ययन में, हम कम दबाव प्लाज्मा डबल inductively युग्मित कम दबाव प्लाज्मा (DICP) स्रोत7,8 को निष्क्रिय बैसिलस सबटिलिस endospores ग्लास परीक्षण सतह पर वितरित द्वारा उत्पंन का उपयोग करें ।

ग्राम-परिवार के सकारात्मक जीवाणु Bacillaceae व्यापक रूप से मिट्टी, तलछट, और हवा के रूप में अच्छी तरह से साफ कमरे की सुविधा और अंतरराष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन के रूप में असामान्य वातावरण में के रूप में के रूप में के रूप में के प्राकृतिक निवास में वितरित कर रहे हैं9,10 ,11. जीनस बैसिलस की सबसे अलग विशेषता इस तरह के पोषक तत्वों की कमी के रूप में प्रतिकूल परिस्थितियों, जीवित रहने के लिए उच्च प्रतिरोधी सुप् endospores (इसके बाद बीजाणुओं के रूप में निर्दिष्ट) फार्म करने की क्षमता है12। बीजाणु आम तौर पर गर्मी, यूवी, गामा विकिरण, सुखाना, यांत्रिक व्यवधान, और ऐसे मजबूत ऑक्सीकरण रोधी के रूप में विषाक्त रसायनों, सहित उपचार और पर्यावरणीय तनाव की एक किस्म के लिए उनके वनस्पति कोशिका समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक प्रतिरोधी रहे हैं पीएच-बदलते एजेंटों (संदर्भ में समीक्षा की13,14) और इसलिए माइक्रोबियल निष्क्रियता के तरीकों की दक्षता के परीक्षण के लिए आदर्श वस्तुएं हैं । चूंकि जीनोमिक डीएनए बैक्टीरिया15,16के प्लाज्मा उपचार का एक प्रमुख लक्ष्य है, जीवाणु पुनरुद्धार पर प्लाज्मा प्रेरित डीएनए घावों (जैसे डीएनए डबल किनारा टूटता है) की मरंमत13बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, 17.

इस प्रकार, हम बीजाणुओं की अंकुरण क्षमता और बीजाणु अंकुरण के दौरान डीएनए की मरंमत की भूमिका और कम दबाव आर्गन प्लाज्मा के साथ बीजाणुओं के उपचार के बाद व्यक्तिगत बीजाणु और प्रतिदीप्ति-लेबल डीएनए की मरंमत की उनकी अभिव्यक्ति का अध्ययन समय के साथ प्रोटीन RecA-हल फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । हम प्रतिलिपि परीक्षण परिणामों को प्राप्त करने के लिए monolayers में सबटिलिस बीजाणुओं की तैयारी के चरण निर्देश द्वारा एक कदम देते हैं , बंध्याकरण के लिए कम दबाव प्लाज्मा के साथ बीजाणु monolayers के उपचार, प्लाज्मा की तैयारी के लिए बीजाणुओं का इलाज ultrastructural मूल्यांकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), और सक्रिय डीएनए की मरंमत के प्लाज्मा उपचार के जवाब में सेल के भीतर होने वाली प्रक्रियाओं की निगरानी के साथ संगीत कार्यक्रम में व्यक्तिगत बीजाणु के स्तर पर रहते सेल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का उपयोग कर ।

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Protocol

1. बैसिलस सबटिलिस बीजाणु उत्पादन और शुद्धि

  1. बीजाणु उत्पादन के लिए, संबंधित B. सबटिलिस तनाव के 5 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति हस्तांतरण, उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक, २०० मिलीलीटर डबल-शक्ति तरल Schaeffer sporulation मध्यम (प्रति लीटर 16 ग्राम पोषक शोरबा, KCl 2 जी, ०.५ ग्राम MgSO 4* 7 ज2ओ, 2 एमएल 1 एम सीए (नो3)2, 2 एमएल ०.१ एम MnCl2 * • 4 एच2ओ, 2 मिलीलीटर 1 मिमी FeSO4, 2 मिलीलीटर ५०% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज18) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर जोरदार वातन के साथ यह खेती ७२ H के लिए या जब तक > ९५% संस्कृति अजूनही sporulated. निम्नलिखित उपभेदों के बीजाणुओं का उपयोग किया जाता है: b. सबटिलिस PY79 (जंगली प्रकार) b. सबटिलिस PY79ΔrecA:: नव (डीएनए रिपेयर प्रोटीन recA की कमी) b. सबटिलिस PY79 recA-yfp:: बिल्ली (पीले रंग के साथ जुड़े recA फ्लोरोसेंट प्रोटीन [YFP]19) ।
  2. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में ३,००० x g पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा फसल बीजाणु और दोहराया धोने कदम (अप करने के लिए 15 बार) का उपयोग कर बाँझ आसुत एच2हे और चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्धता और अंकुरण की स्थिति के लिए जांच के द्वारा नमूनों को शुद्ध । सुनिश्चित करें कि बीजाणु निलंबन के चरण से बाहर होते हैं-चमकीले बीजाणु (> ९९%) और वनस्पति कोशिकाओं (छड़), अंकुरित बीजाणु (काले रंग के रूप में) और कोशिका के मलबे से मुक्त होते हैं, अन्यथा आगे माइक्रोस्कोपी प्रयोगों को परेशान किया जा सकता है । वांछित शुद्धता तक पहुँच जाता है जब तक नमूना धो.
  3. ५० µ एल से बाहर चढ़ाना द्वारा बीजाणु titer को समाप्त 10-गुना पर पौंड-आगर (अर्थात्: उपयोग 30 µ l नमूना + २७० µ l बाँझ पानी एक 1:10 कमजोर पड़ने के लिए. एक 1:100 कमजोर पड़ने के लिए २७० µ एल एच2ओ के लिए विशेष कमजोर पड़ने से 30 µ एल ले लो और आगे) CFU की गणना करने के लिए (कॉलोनी बनाने इकाइयों) और ३७ ° c रातोंरात पर प्लेटें मशीन । CFU निर्धारण के बाद, नमूने को ध्यान से या बाँझ पानी के साथ कमजोर द्वारा प्रति मिलीलीटर 109 बीजाणु को समायोजित करें ।

2. एयरोसोल-जमती बैसिलस सबटिलिस बीजाणुओं के नमूने तैयार करना

नोट: संचय और जीवाणुओं के अतिव्यापी उपचार के दौरान छाया प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अंततः ूःतुत निष्क्रियता कैनेटीक्स में जिसके परिणामस्वरूप । इस समस्या को कम करने के लिए, एक एयरोसोल-जमाव तकनीक20द्वारा बीजाणु नमूने तैयार । संक्षेप में, एक इलेक्ट्रिक टाइमर है कि दबाव वाहक गैस (यहां एन2) के प्रवाह के साथ संगीत कार्यक्रम में तरल प्रवाह को नियंत्रित करता है के साथ उच्च परिशुद्धता दो पदार्थ नोक नियंत्रित करते हैं । नाइट्रोजन गैस के प्रवाह का उपयोग कर नोजल आउटलेट के माध्यम से इंजेक्शन तरल नमूना फैलाने ।

  1. निष्फल सूक्ष्म स्लाइड के रूप में एक नमूना वाहक प्लेस (अस्तित्व कैनेटीक्स के लिए) या दौर 25 मिमी coverslips (डीएनए की मरंमत प्रक्रियाओं की फ्लोरोसेंट ट्रैकिंग के लिए/cLSM; फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी) विद्युत संचालित एयरोसोल छिड़काव इकाई के अंदर नोक के साथ संरेखण में । प्रयुक्त बीजाणु एकाग्रता वांछित अंतिम एकाग्रता के एक सौ के अनुरूप करने की जरूरत है ।
  2. नोजल द्रव प्रवेश करने के लिए बीजाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और १.३ बार के दबाव में ०.१ एस के छिड़काव की प्रक्रिया शुरू करते हैं । छिड़काव बीजाणु निलंबन (1 x 107) एक समान रूप से वितरित बीजाणु monolayer फार्म के लिए सेकंड के भीतर तेजी से सूख जाता है कि सूक्ष्म स्लाइड पर एक पतली फिल्म रूपों । कमरे के तापमान पर एक बाँझ कंटेनर में इलाज नमूना वाहकों की दुकान.

3. कम दबाव प्लाज्मा उपचार

  1. जैविक नमूनों के उपचार के लिए प्लाज्मा प्रणाली तैयार करें और 5 पीए पर 5 मिनट के लिए ५०० डब्ल्यू में आर्गन प्लाज्मा के साथ प्रणाली संचालित । इस के द्वारा, सिस्टम में सभी सतहों को साफ और गर्म कर रहे हैं । यह परिवेशी वायु, अर्थात् नाइट्रोजन, ऑक्सीजन, और पानी से अणुओं के चिपके हुए कम कर देता है, जबकि प्रणाली वेंट । प्रणाली के पूर्व उपचार के बाद, चैंबर वेंट और नमूनों को ध्यान से कांच के रैक की मदद से रिएक्टर पोत के केंद्र में जगह है ।
  2. न्यूनतम तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग करें । कक्ष को बंद करें और 2 Pa. बाद में, कक्ष में प्रक्रिया गैस भरें । 5 Pa करने के लिए सिस्टम में दबाव को विनियमित ।
  3. निर्धारित प्रक्रिया समय के बाद, बिजली और गैस की आपूर्ति बंद कर देते हैं, और सावधानी से नमूना धारक से नमूने उड़ाने को रोकने के लिए प्रणाली वेंट । वेंटिलेशन के बाद, नमूनों को हटाने और सिस्टम में अगले पैरामीटर के लिए नमूने जगह है । गैर प्लाज्मा इलाज नियंत्रण के लिए नमूनों को बेनकाब करने के लिए केवल वैक्यूम करने के लिए (5 Pa) प्रक्रिया गैस की उपस्थिति में सबसे लंबे समय तक लागू प्लाज्मा समय के बराबर ।

4. वसूली और बीजाणु अस्तित्व का मूल्यांकन

  1. autoclaved 10% polyvinyl एसीटेट (PVA) का एक समाधान तैयार है और लगभग ५०० µ एल के साथ नमूना वाहक को कवर और उन्हें हवा-सूखे PVA परत से पट्टी (अब बीजाणु नमूने युक्त) सूख संदंश का उपयोग कर और यह एक 2 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण रिएक्शन ट्यूब. ट्यूब के लिए बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें और भंवर के माध्यम से PVA परत भंग । इस कार्यविधि से बीजाणुओं की > 95% पुनर्प्राप्ति होती है और उनकी अंकुरण क्षमता21को प्रभावित नहीं करती है ।
  2. प्रश्नपत्र एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में बाँझ पानी में 1:10 पर नमूना पतला (यानी २७० µ l बाँझ एच2O + 30 µ l नमूना/पूर्व कमजोर पड़ने). थाली बाहर ५० Lysogeny शोरबा पोषक तत्व (पौंड) पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के µ एल, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें मशीन और बड़े कालोनियों (CFU) की संख्या की गणना ।

5. लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और बीजाणु अंकुरण में डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया की ट्रैकिंग

  1. अंकुरण प्रयोगों के लिए, एक 1 मिमी मोटी १.५% पौंड-आगर पैड, ७०० µ एल मध्यम उबलते द्वारा तैयार है और यह एक बाँझ माइक्रोस्कोपी पेट्री डिश में प्लास्टिक । 10 मिनट के बाद, एक बाँझ स्केलपेल के साथ एक 8 मिमी x 8 मिमी x 1 मिमी पौंड-आगर पैड और 25 मिमी कांच coverslips पर आराम कर रहे हैं जो बीजाणु monolayers के शीर्ष पर ध्यान से स्थानांतरित करने के लिए बाहर काट दिया ।
    नोट: यह चरण व्यक्तिगत बीजाणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए महत्वपूर्ण है और उनकी प्रतिक्रिया का पालन करने की अनुमति देता है, जो पोषक क्षेत्र द्वारा प्रेरित अंकुरण के सक्रियण की ओर है । इस प्रकार, पौंड-आगर दो प्रयोजनों के कार्य करता है, (1) सतह पर बीजाणुओं को ठीक करने के लिए, जो सतह पर और ऑप्टिकल फ़ोकस के साथ स्थानीयकरण को टाल देता है, और (2) अंकुरण के लिए बीजाणु को सक्रिय करने के लिए ।
  2. आगार के साथ नमूना को कवर करने के बाद, एक इमेजिंग चैंबर में जल्दी से गिलास coverslip हस्तांतरण और एक स्वचालित फोकल लेजर के साथ नमूने माइक्रोस्कोप-औंधा प्रकाशिकी एक 63X का उपयोग कर के साथ खुर्दबीन स्कैनिंग/1.3 विमान apochromatic तेल विसर्जन उद्देश्य ।
  3. प्रदर्शन इमेजिंग प्रतिदीप्ति (YFP) के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ ५१४ एनएम और उत्सर्जन ५२० और ५६० एनएम के बीच का पता लगाया जा सकता है ।
    1. फोटो गुणकों (संचारित-प्रकाश पथ) में से एक का उपयोग कर स्कैनिंग मोड में उज्ज्वल क्षेत्र छवियों रिकॉर्ड.
    2. रिकॉर्ड २.६% की एक लेजर शक्ति के साथ समय चूक श्रृंखला, और 5 हवादार इकाइयों के लिए फोकल एपर्चर सेट और 30 के प्रति 1 फ्रेम का एक नमूना आवृत्ति 0 ज से 5 ज, प्रयोग पर निर्भर करता है । यह विशेष रूप से ध्यान दें कि ५१४ एनएम में रंग लेजर रोशनी की उच्च खुराक पूरी तरह से अंकुरण को बाधित (चित्रा 1ए, बी) है ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस (परिवेश हवा आर्द्रता) में एक हीटिंग चरण में नमूने पूरे इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान रखें । प्रत्येक शर्त के लिए ंयूनतम तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग करें । बीजाणु एकत्रीकरण के मामले में, multilayered बीजाणु वितरण या धूल कणों से संक्रमण, प्लाज्मा उपचार ("छाया") के अवरुद्ध हो सकता है और छाया हुआ बीजाणुओं के अंकुरण सक्षम (चित्रा 1सी, डी) ।

Figure 1
चित्रा 1: संभावित समस्याओं के दौरान मनाया फोकल लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्लाज्मा का इलाज बीजाणु । (A, B) रंग (५१४ एनएम) लेजर रोशनी की उच्च खुराक द्वारा बीजाणु अंकुरण के निषेध । (अ) अवलोकन (३ एक्स ३ सिले फ्रेम्स) के बी. सबटिलिस (LAS72, RecA-YFP) बीजाणुओं के अंकुरण की दीक्षा के बाद १८० मि. बीच में फ्रेम लेजर प्रकाश (५१४ एनएम, ७०% लेजर शक्ति) की उच्च खुराक के लिए 30 एस अंतराल पर उजागर किया गया था, जबकि आसपास के क्षेत्रों (= फ्रेम) प्रबुद्ध नहीं थे (उज्ज्वल क्षेत्र चैनल और RecA-YFP प्रतिदीप्ति की छवि का विलय; आदेश दिया संरचनाओं थे एक अंकित ५०० µm ग्रिड के साथ ३५ mm इमेजिंग डिश का उपयोग करके कारण). (ख) प्रबुद्ध और गैर प्रबुद्ध क्षेत्र दिखा रहा है कि बीजाणु, जो रंग लेजर रोशनी की उच्च खुराक को उजागर किया गया अंकुरित नहीं हुआ और बाहर बढ़ने के बीच सीमा के एक 4x बढ़ाया देखने को दर्शाता है, जबकि में बीजाणु गैर प्रबुद्ध क्षेत्रों पूरी तरह से उज्ज्वल RecA-YFP प्रतिदीप्ति (ग्रीन सिग्नल) व्यक्त वनस्पति बैक्टीरिया के लिए ठीक हो । (C, D) दूषित कणों या बीजाणुओं के कई परतों (तीरों) से आच्छादित बीजाणु प्लाज्मा उपचार द्वारा निष्क्रियता से अंतर्निहित बीजाणुओं की रक्षा करते हैं और उनके अंकुरण और वृद्धि ("छाया प्रभाव") की अनुमति देते हैं । (ग) बीजाणु ६० s के लिए प्लाज्मा-उपचारित थे और अंकुरण की दीक्षा के बाद १८० मिनट में या १२० s के लिए (D) और २४० मिनट के बाद imaged. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

6. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)

  1. अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में प्लाज्मा के बीजाणुओं की सतह आकृति विज्ञान के बारे में ultrastructural जानकारी प्रदान करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें । कोट सोने के साथ coverslips पर बीजाणु monolayers-पैलेडियम (3 एनएम) एक धूम-कोट का उपयोग करके सूख गया । इमेजिंग के लिए एक क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें नमूनों, एक में लेंस माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर सहित 5 केवी त्वरण वोल्टेज पर संचालित स्थलाकृति विपरीत प्रकट करने के लिए ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. n/n0, जहां n इलाज के नमूनों की औसत CFU है और n0 के औसत CFU अनुपचारित वैक्यूम नियंत्रण है से बीजाणु जीवित रहने का निर्धारण । प्लाट बीजाणु (सेकंड में) समय के एक समारोह के रूप में आर्गन प्लाज्मा उपचार द्वारा निष्क्रियता । सभी डेटा को औसत और मानक विचलन (n = 3) के रूप में अभिव्यक्त करें ।
  2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके लाइव सेल इमेजिंग द्वारा प्राप्त छवियों का विश्लेषण करें । बीजाणु अंकुरण के अनुपात को बढ़ाता है और प्लाज्मा उपचार के बाद तबदील हो जाता है, प्रयोग की शुरुआत में प्रतिनिधि फ्रेम में बीजाणु गिनती के साथ ही 4 एच के बाद । बीजाणु जीवन रक्षा परख में महत्व निर्धारण के लिए, एक तरह से ANOVA-परीक्षणों का उपयोग करें (प्रसरण का विश्लेषण) सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के साथ) । पृ मान < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है ।

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Representative Results

प्लाज्मा के अस्तित्व का इलाज सबटिलिस बीजाणु

इस अध्ययन में प्रयुक्त सबटिलिस बीजाणुओं के प्लाज्मा उपचार प्लाज्मा उपचार (चित्रा 2) की अवधि में वृद्धि के साथ अस्तित्व में कमी दिखा । recA-जीन YFP करने के लिए जुड़े तनाव के बीजाणुओं अस्तित्व में जंगली प्रकार तनाव के बीजाणु के समान घटता दिखाया, यह दर्शाता है कि आनुवंशिक संशोधन बैक्टीरियल जीवन शक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है । RecA के बीजाणु-कमी तनाव जंगली प्रकार तनाव के बीजाणु की तुलना में प्लाज्मा उपचार की दिशा में एक उच्च संवेदनशीलता प्रदर्शन, प्रदर्शन है कि RecA जीन की उपस्थिति जीवन शक्ति के प्लाज्मा प्रेरित नुकसान को कम करने है । 15 एस के विशेष रूप से लघु प्लाज्मा उपचार (p <०.००३) और 30 s (p < 0.004) जंगली प्रकार और RecA-YFP उपभेदों की तुलना में RecA की कमी वाले उपभेदों में जीवन शक्ति की एक महत्वपूर्ण कमी के कारण । प्लाज्मा उपचार के ९० एस के बाद, सभी उपभेदों की जीवन शक्ति परिमाण के लगभग तीन आदेश से कम है ।

Figure 2
चित्रा 2: कम दबाव आर्गन प्लाज्मा के साथ उपचार के बाद विभिन्न उपभेदों से बी सबटिलिस बीजाणुओं की उत्तरजीविता । जीवन रक्षा (प्लाज्मा का अर्थ CFU बीजाणुओं का मतलब है CFU का इलाज किया बीजाणुओं का मतलब है; त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं) प्लाज्मा उपचार की अवधि के खिलाफ साजिश रची है । PY79 (वाइल्ड टाइप; क्लोज्ड सर्कल्स), LAS72 (RecA-YFP; ग्रे सर्कल्स) और LAS24 (ΔRecA; ओपन सर्कल्स) । सांख्यिकीय विश्लेषण PY79 (unभएकै RecA) और LAS72 (RecA-YFP-फ्यूजन) के बीच बीजाणु जीवित रहने में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया ।

Ultrastructural SEM द्वारा प्लाज्मा-उपचारित बीजाणुओं का विश्लेषण

बीजाणुओं पर प्लाज्मा उपचार के रूपात्मक प्रभाव का एक विचार प्राप्त करने के लिए, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग वैक्यूम-व्यवहार किए गए बीजाणुओं (नियंत्रण) की तुलना में प्लाज्मा की सतह आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । सबटिलिस बीजाणुओं की बाहरी सतह विशेषता अनुदैर्ध्य रिज-जैसे संरचनाओं जो लगातार सभी इलाज और अनुपचारित बीजाणु (चित्रा 3) में दिखाई दे रहे हैं प्रकट होता है । प्लाज्मा उपचार 30 एस करने के लिए नियंत्रण की तुलना में बीजाणु सतह आकृति विज्ञान की कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन लाती है (चित्रा 3ए सी) । प्लाज्मा उपचार की अवधि में वृद्धि (६०-२४० s) एक और दानेदार बीजाणु सतह (चित्रा 3डी एफ) की ओर जाता है और छोटे दरारें और दरारें १२० या २४० एस के लिए इलाज बीजाणुओं में मनाया जा सकता है । इसके अलावा, छोटे globules बीजाणु सतहों (१२० एस और २४० एस उपचार, चित्रा 3ई, एफ), जो कोट, प्रांतस्था या भीतरी कोर22से जारी की सामग्री के कारण होता है पर उठता है । इन globules पूरे बीजाणु कवर और नस के आकार संरचनाओं पर पाया जा सकता है और साथ ही मध्यवर्ती सतहों पर ।

Figure 3
चित्रा 3: B. सबटिलिस की SEM (LAS72, RecA-YFP) बीजाणुओं कम दबाव प्लाज्मा उपचार के बाद ग्लास coverslips पर छिड़काव । केवल वैक्यूम करने के लिए और नहीं प्लाज्मा (नियंत्रण) में दिखाया गया बीजाणु (A) में दिखाए जाते हैं. (ख-च) बीजाणु जिन्हें बढ़ती अवधि (15, 30, ६०, १२० और २४० s) के साथ प्लाज्मा-व्यवहार किया गया था । बीजाणु जो प्लाज्मा-उपचारित ६० एस या अधिक लंबे होते हैं, वे बीजाणुओं या बीजाणुओं के नियंत्रण से उनकी सतह पर अधिक दानेदार दिखते हैं, जो 15 और 30 एस के लिए प्लाज्मा का इलाज करते थे । दरारें और दरारें (सफेद तीर) बीजाणु प्लाज्मा-१२० या २४० एस के लिए इलाज की सतह पर दिखाई दे रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

प्लाज्मा की लाइव सेल माइक्रोस्कोपी-इलाज सबटिलिस बीजाणु

B. सबटिलिस उपभेदों से बीजाणुओं को पुनर्जीवित करने की लाइव सेल माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति-बला मरम्मत प्रोटीन RecA (RecA-YFP) में अंकुरण क्षमता और व्यक्तिगत बीजाणुओं के RecA-YFP की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है प्लाज्मा उपचार के लिए प्रतिक्रिया । यहां, हम समय-हल फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए अंकुरण, वृद्धि, और प्लाज्मा-इलाज बीजाणुओं की वनस्पति राज्य में प्रगति का पालन करें (चित्रा 4) संभावित रूप से ज्ञात मुद्दों के संबंध में जैसे छाया प्रभाव या रंग लेजर रोशनी की उच्च खुराक द्वारा अंकुरण के निषेध (चित्रा 1). केवल वैक्यूम करने के लिए उजागर बीजाणु (नियंत्रण, चित्रा 4ए-सी), बीजाणु पुनरुद्धार के प्रारंभिक राज्यों के दौरान कुछ फ्लोरोसेंट संकेतों का प्रदर्शन (0-65 मिनट, नहीं दिखाया गया है) । प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि, सबसे शायद RecA-YFP के संचय के कारण, ≥ ६५ मिनट में मनाया जाता है जब वनस्पति कोशिकाओं का गठन कर रहे है और पहली कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए शुरू करते हैं । इन कोशिकाओं के सभी एक प्रतिदीप्ति प्रत्येक कोशिका के अंदर कम से कम एक स्थिति में संचित संकेत बंदरगाह । लगभग सभी बीजाणु (९८ ± 2%; ५८९ ± 14, n = 4) एक नियंत्रण के रूप में निर्वात के साथ इलाज उगना और एक छड़ी के आकार का विकसित कक्ष आकृति के एक नहीं बल्कि एक समान लंबाई के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं (चित्रा 4बी-सी). निर्वात नियंत्रणों में बीजाणुओं के विपरीत, प्लाज्मा के साथ 15 एस के लिए इलाज के बीजाणु पहले से ही कम ७५ ± 4% (१९७ ± 8 बीजाणु, एन = 3, चित्रा 4डी एफ) के एक कम अंकुरण क्षमता दिखाने के लिए, यह दर्शाता है कि प्लाज्मा उपचार निष्क्रिय बीजाणुओं में नुकसान लाती है, जो अंकुरण को रोकता है । इसके अलावा, बढ़ना कोशिकाओं की आकृति विज्ञान नियंत्रण में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान से अलग है । कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर लंबी छड़ में या तो बढ़ने (से अधिक नियंत्रण की तुलना में) या छोटे रहना और बीजाणु कोट (चित्रा 4जी मैं) में रहना । इसके अलावा, सेल आकार (सफेद तीर प्रमुखों, चित्रा 4एफ) बढ़ाने के साथ सबसे लंबी कोशिकाओं लाइसे । कोशिकाओं के भीतर RecA-YFP के प्रतिदीप्ति संकेतों नियंत्रण कोशिकाओं में संकेतों की तुलना में थोड़ा बढ़ जाने लगते हैं (चित्रा 4सी, एफ), लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर देखा जा सकता है (नहीं दिखाया गया है). बीजाणु जो 30 एस के लिए प्लाज्मा का इलाज किया गया 25 ± 6% तक उगना (९९ ± 4 बीजाणु, एन = 3) और वनस्पति कोशिकाओं प्लाज्मा के 15 एस-उपचार के बाद बीजाणुओं और बीजाणुओं को नियंत्रित करने की तुलना में वृद्धि में विशेष रूप से देरी कर रहे हैं । वनस्पति कोशिकाओं बल्कि छोटे और रॉड के आकार के होते हैं, लेकिन लंबाई में भिंनता (चित्रा 4जी मैं) । हालांकि, सभी आकार की कोशिकाओं को लंबे समय तक गर्मी के दौरान लाइसे के रूप में नमूनों के लिए देखा जा सकता है 15 प्लाज्मा के एस-उपचार । प्लाज्मा के ६० एस के बाद-2 ± 2% से कम उपचार (8 ± 8 बीजाणु, n = 3) बीजाणु वनस्पति कोशिकाओं (चित्रा 4जे-एल) बनाने में सक्षम होते हैं । बीजाणु जो ९०, १२० या २४० s के लिए प्लाज्मा इलाज कर रहे है विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन वे कोई वृद्धि या RecA-YFP के प्रतिदीप्ति स्तर में कोई परिवर्तन नहीं दिखा () नहीं दिखाया गया है ।

Figure 4
चित्रा 4 : प्लाज्मा उपचार और अंकुरण की दीक्षा के बाद RecA-YFP व्यक्त कर रहे एक तनाव से सबटिलिस के बीजाणुओं का केंद्र लेजर स्कैनिंग लाइव सेल माइक्रोस्कोपी । समय के साथ बीजाणुओं का पालन किया गया (एक छवि प्रति 30 एस) और समय के लिए छवियां-अंक 0, 2 और 4 एच दिखाए जाते हैं । (A-C) केवल वैक्यूम के साथ और नहीं प्लाज्मा (नियंत्रण) के साथ इलाज बीजाणु अंकुरित और वनस्पति कोशिकाओं (ख) के लिए बाहर हो जाना और घातीय वृद्धि चरण (ग) दर्ज करें । (D-L) कम दबाव वाले आर्गन प्लाज्मा के साथ अलग अवधि के लिए उपचारित बीजाणु नियंत्रण के बीजाणुओं की तुलना में उनकी वृद्धि में महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं (विवरण के लिए पाठ देखें). (D-F) 15 एस उपचार (सफेद तीर सिर वनस्पति कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो हाल ही में लीजड), (जी मैं) 30 एस उपचार (काले तीर सिर वनस्पति कोशिकाओं है, जो छोटे थे और बीजाणु कोट में रहना कल्पना) और (J-L) ६० s उपचार 0 एच, 2 एच और 4 एच बीजाणु वसूली समय के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

कम तापमान का उपयोग कर सतहों की नसबंदी, कम दबाव प्लाज्मा इस तरह के विकिरण के साथ उपचार के रूप में बल्कि पारंपरिक नसबंदी प्रक्रियाओं के लिए एक होनहार विकल्प है, रसायन (एच2ओ2 की तरह गैसों केउदाहरण या ईथीलीन ऑक्साइड) या शुष्क और नम गर्मी23। साधारण नसबंदी के तरीकों ज्यादातर एक प्रभावी नसबंदी प्रदान करते हैं, लेकिन वे इलाज सामग्री को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है और ऑपरेटर के लिए एक संभावित जोखिम का प्रतिनिधित्व करते हैं । कम दबाव प्लाज्मा इस तरह के यूवी फोटॉनों, मुक्त इलेक्ट्रॉनों, आयनों और बाहर निकले परमाणुओं या अणुओं के रूप में कई घटकों की संरचना का उपयोग कर एक तेजी से और सजातीय जैविक निष्क्रियता प्रदान करता है (उदा. ROS) । इसलिए, LPP को लागू किया जा सकता गर्मी और संक्षारण संवेदनशील सामग्री, जैसे प्रत्यारोपण के लिए थर्माप्लास्टिक पॉलिमर, इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों या जटिल 3d संरचनाओं । वर्तमान समाचार पत्र में हम ऐसे परीक्षण प्रणाली के अनुप्रयोग का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें सबटिलिस बीजाणुओं का monolayers20 विशेष रूप से कम दबाव वाले प्लाज्मा रिएक्टर में इलाज किया जाता है जो हाल ही में7विस्तार में बताया गया था । सूक्ष्म उज्ज्वल प्लाज्मा-उपचारित बीजाणुओं के क्षेत्र परीक्षा नसबंदी दक्षता का एक समग्र अनुमान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है । हालांकि, हम कम दबाव प्लाज्मा और एक आणविक स्तर पर बीजाणु निष्क्रियता पर अपने प्रभाव के अंतर्निहित तंत्र को लक्षित करने में रुचि रखते हैं । fluoresce के साथ संयोजन में-ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी यह हमें प्लाज्मा में इस विशेष आणविक प्रतिक्रिया के विवरण पर प्रकाश डाला करने के लिए सक्षम बनाता है बीजाणुओं का इलाज और संभवतः हमें कम दबाव प्लाज्मा के मौलिक निष्क्रियण तंत्र में अंतर्दृष्टि दे ।

यहां, हम लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्लाज्मा-उपचार दक्षता और प्रभावों के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो अंकुरण की दीक्षा के बाद व्यक्तिगत बीजाणुओं का पालन करने की अनुमति देता है । उल्लेखनीय है, इस विशेष दृष्टिकोण नए परिणाम जो कोशिका संख्या या CFU के निर्धारण का उपयोग कर पूरे बीजाणु जनसंख्या के पुनरोद्धार को मापने के द्वारा प्रदान नहीं किया जा सकता है की एक जोड़ी से पता चलता है । सबसे पहले, प्लाज्मा-बीजाणुओं के उपचार न केवल एक खुराक पर निर्भर तरीके से वृद्धि की क्षमता को प्रभावित करता है, के रूप में CFUs के निर्धारण से अस्तित्व की माप से उम्मीद के रूप में, लेकिन यह भी वनस्पति कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, जो अक्सर विकसित बड़ी छड़ में असमर्थ जीवाणु (प्लाज्मा के 15 एस-उपचार) या एक कम लंबाई (प्लाज्मा के 30 एस-उपचार) में चिपके कोशिकाओं के साथ उचित कोशिका विभाजन के अनुसार सेपता फार्म करने के लिए । कम लंबाई वाले कक्षों की टिप्पणियों ने बाद के समय बिंदुओं पर सामांय कक्ष की लंबाई में कोई पुनर्प्राप्ति नहीं दिखाई । इसके अलावा, लाइव सेल इमेजिंग से पता चलता है कि आकृति बदल कोशिकाओं के अधिकांश अवलोकन के बाद के चरणों में लाइसे । इसका मतलब यह है कि प्लाज्मा उपचार के दौरान बीजाणुओं द्वारा अधिग्रहीत क्षति बीजाणु पुनरोद्धार के बाद के चरणों में ही प्रभावी है, संभवतः डीएनए की क्षति के कारण और यह कि अंकुरण और वृद्धि के लिए इस्तेमाल की गई मशीनरी प्लाज्मा नसबंदी की तुलना में अधिक मजबूत है । वनस्पति विकास के लिए मशीनरी की जरूरत है । उल्लेखनीय है, डीएनए की मरंमत RecA प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कम है और लगभग बीजाणुओं में अनुपस्थित लगता है और वृद्धि और वनस्पति चरण के दौरान विकसित के रूप में RecA-YFP प्रतिदीप्ति17में वृद्धि से संकेत दिया । हालांकि, प्लाज्मा-व्यवहारिक बीजाणुओं को तबदील करने में भी थोड़ा वृद्धि हुई RecA अभिव्यक्ति, बीजाणुओं को नियंत्रित करने की तुलना में, कोशिका शक्ति को मात्रा से बचाव करने में मदद नहीं करती है, क्योंकि अधिकांश कोशिकाएं लाइसे या वृद्धि के बाद फट जाती हैं, विशेष रूप से 3 से अधिक एच के बाद ऊष्मायन. इस प्रभाव का समय समाप्त छवियों अंकुरित बीजाणुओं से लाइव सेल फिल्मों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । हम बाहर नहीं कर सकते कि इस प्रभाव विशेष खेती की हालत से बल मिलता है, जहां कोशिकाओं को एक monolayer में मजबूर कर रहे है आगर के एक पतली ओवरले का उपयोग कर ।

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण का एक अन्य परिणाम यह है कि संक्रमण कण (जैसे धूल के कण, अन्य बीजाणु) बीजाणु monolayer सतह पर प्लाज्मा के हानिकारक प्रभावों से अंतर्निहित बीजाणुओं को ढाल सकते हैं । ऐसे मामलों में भी अब प्लाज्मा-उपचार असक्षम होने लगता है. के बाद से इस तरह के संदूषणों को पूरी तरह से बचना मुश्किल है, वैकल्पिक प्लाज्मा उपचार रणनीतियों का परीक्षण किया जाना चाहिए, इस तरह के उपचार की विस्तारित अवधि के साथ संयोजन के रूप में प्लाज्मा उपचार के दौरान ग्रहों रोटेशन का उपयोग कर के रूप में । SEM द्वारा विश्लेषण इंगित करता है कि बीजाणु कोट प्लाज्मा की वृद्धि की अवधि के साथ छिद्रित है-उपचार जो प्लाज्मा की थ्योरी के साथ लाइन में है-बात पर प्रभाव मध्यस्थता22,24। एक लंबे समय तक जोखिम (> 240 एस) प्लाज्मा को भी दूषित कणों छिद्र हो सकता है और इस तरह के नुकसान और अंतर्निहित बीजाणु निष्क्रिय कर सकते हैं ।

बीजाणु अंकुरण और वृद्धि के लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अंय अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो सकता है । आगर की एक पतली परत के साथ बीजाणुओं को कवर एक विशिष्ट ऑप्टिकल विमान में बीजाणु बलों और पार्श्व आंदोलन को प्रतिबंधित करता है । दोनों प्रभाव यह गारंटी देते हैं कि बीजाणु और तबदील हो चुके कक्ष चयनित इमेजिंग फ़्रेम में रहते हैं । इसी तरह के दृष्टिकोण25 से पहले वर्णित किया गया है लेकिन विधि से कम लचीलापन प्रदान यहां वर्णित है जो लगभग किसी भी नमूना वाहक (उदाहरण के लिए एक गिलास स्लाइड, coverslip या पेट्री डिश चुनने की अनुमति देता है) । हमारे हाथ में अंय वनस्पति जीवाणुओं रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है का उपयोग कर-विधि को कवर) । किसी भी मामले में, सावधान नियंत्रण प्रयोगों लाइव सेल इमेजिंग के दौरान फोटो क्षति के संभावित प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए, क्योंकि हमने देखा कि रंग लेजर लाइट की उच्च खुराक पूरी तरह से बीजाणु अंकुरण को रोकते हैं । इसके अलावा प्रदीप्ति समय को छोटा करने से, अर्थात अवलोकन के अंतरालों को बढ़ाने से, इस घटना से लेजर की तीव्रता को कम करके रोका जा सकता है तथा फोकल छिद्र (pinhole) का खुलना/

सारांश में, प्लाज्मा की दक्षता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल तकनीक के बीच में स्प्रे B. सबटिलिस बीजाणु monolayers के मॉडल में उपचार, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी बीजाणु पुनरुद्धार के दौरान सेलुलर घटनाओं में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और संभावना प्रदान करता है प्रतिदीप्ति-बला प्रोटीन की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए । इसके अलावा, विशेष नमूना तैयारी, यानी आगर की एक पतली परत के साथ बीजाणुओं को कवर, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा अन्य सूक्ष्मजीवों के इमेजिंग के लिए paradigmatic किया जा सकता है ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

लेखक इस काम के कुछ हिस्सों के दौरान उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Andrea Schröder धंयवाद और वीडियो शूट के दौरान उसकी सहायता के लिए Nikea जे Ulrich । हम भी बैसिलस सबटिलिस उपभेदों: LAS72 और LAS24 के अपने उदार दान के लिए Lyle A. सिमंस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम के भागों में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon पाक ७२८) फिलीस्तीनी अथॉरिटी (ऐडवर्ड्स 7/3-1) और RM (मो 2023/2-1) और डीएलआर अनुदान डीएलआर-FuW-Projekt आईएसएस जीवन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, programme RF-FuW, Teilprogramm ४७५ (टू एफ. एम. एफ., यूननट और R.M.) । F.M.F. Helmholtz अंतरिक्ष जीवन विज्ञान अनुसंधान स्कूल (SpaceLife) की एक पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित था जर्मन एयरोस्पेस केंद्र (डीएलआर) में कोलोन, जर्मनी, जो Helmholtz एसोसिएशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (Helmholtz-Gemeinschaft) छह साल की अवधि में ( अनुदान सं. VH-KO-३००) और डीएलआर से अतिरिक्त धन प्राप्त किया, एयरोस्पेस कार्यकारी बोर्ड और एयरोस्पेस चिकित्सा संस्थान सहित । इस अध्ययन के परिणाम में पीएच. डी. फेलिक्स एम Fuchs की थीसिस को शामिल किया जाएगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two substance nozzle (model 970-8) Schlick 14,404 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter
Luria Bertani Medium Sigma Aldrich 70122-100G
Tube connectors Festo n/a G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC Bosch Rexroth 820005100
PLN Polyamid tube Festo 558206 d = 6 mm
Glass slides VWR 48300-026
Electric Timer 550-2-C Gefran F000074 220 V
attofluor cell chamber Menzel, Fisher Ref. 3406816 d=25 mm, round
MgSO4*7 H2O Sigma Aldrich 13152
Ca(NO3)2 Sigma Aldrich 202967
MnCl2 * 4 H2O Sigma Aldrich 244589
FeSO4 * 7H2O AppliChem 13446-34-9
Glucose Merck 215422
KCl Sigma Aldrich P9541-500G
Nutrient Broth (NB) Merck 105443
Luria-Bertani (LB) Merck 110283
96-wellplate ThermoFisher 243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 Carl Zeiss Microscopy GmbH n/a
Leo 1530 Gemini Carl Zeiss Microscopy GmbH n/a
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) Carl Zeiss Microscopy GmbH n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) Systat GmbH, Erkrath, Germany n/a
Attofluor cell chamber Invitrogen A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom ibidi 81168

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १२९ प्लाज्मा नसबंदी प्रदूषित बैसिलस सबटिलिस बीजाणु प्रतिरोध डीएनए की मरंमत लाइव सेल इमेजिंग SEM cLSM प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर <em>बैसिलस सबटिलिस</em> बीजाणुओं के अस्तित्व पर कम दबाव प्लाज्मा नसबंदी के हानिकारक प्रभावों की जांच
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Fuchs, F. M., Raguse, M., Fiebrandt, … More

Fuchs, F. M., Raguse, M., Fiebrandt, M., Madela, K., Awakowicz, P., Laue, M., Stapelmann, K., Moeller, R. Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56666, doi:10.3791/56666 (2017).

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