פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.
פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי למטרות תעשייה, קליני, ומטרות בחלל. לחץ נמוך פלזמה (LPP) הפרשות מכיל קשת רחבה של מינים הפעילים, אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה. ללמוד את היעילות ואת מנגנוני עיקור מאת ל”י/נ, אנו משתמשים נבגים של האורגניזם מבחן Bacillus subtilis בגלל עמידותם יוצאת דופן מפני תהליכי עיקור קונבנציונלי. אנו מתארים את הייצור של B. subtilis נבג monolayers, תהליך עיקור פלזמה לחץ נמוך ב כור פלזמה inductively בשילוב כפול, אפיון מורפולוגיה נבג באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM), ו ניתוח של נביטה, תוצר של נבגים על ידי מיקרוסקופ תא חי. יעד עיקרי של מינים פלזמה הוא חומר גנטי (DNA), תיקון פלזמה-induced נגעים DNA בעת התחייה נבג הוא חיוני להישרדות של האורגניזם. כאן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ותיקון התפקיד של ה-DNA במהלך נבג, תוצר לאחר הטיפול עם ל”י/נ באיתור מתויג fluorescently DNA תיקון חלבונים (רקה) עם זמן לפתור פלורסצנטיות קונאפוקלית מיקרוסקופ. מטופלים, נבג לא מטופל monolayers הם מופעלים עבור נביטה, דמיינו במיקרוסקופ הפוכה קונאפוקלית תא חי לאורך זמן לעקוב אחרי התגובה של נבגים בודדים. התצפיות שלנו לחשוף השבר של הנבטת ו. הנוכחי נבגים תלויה משך הטיפול-LPP להגיע למינימום לאחר 120 ס’ רקה-YFP קרינה פלואורסצנטית (חלבון פלורסצנטיות צהוב) זוהה רק כמה נבגים ופיתח בכל . הנוכחי תאים עם העלאה קלה בנבגים שטופלו ל”י/נ יתר על כן, חלק מהחיידקים וגטטיבי נגזר שטופלו LPP נבגים הראו עלייה ציטופלזמה, נטו lyse. השיטות שתואר לניתוח של נבגים בודדים יכול להיות למופת לחקר היבטים אחרים של נבג ותוצר.
יעד מרכזי של חקר החלל הוא החיפוש אחר חתימות של צורות חיים ושל מולקולות על גופים פלנטריים וירח אחרים במערכת השמש שלנו. העברת מיקרואורגניזמים או מולקולות כדור הארץ לאזורים קריטי של חקר הוא סיכון מסוים לפגיעה פיתוח, שלמות של החיים-זיהוי משימות על גופים פלנטריים כגון מאדים ואת אירופה1. ההנחיות הבינלאומי של הגנה על כוכבי הלכת, הוקמה על ידי הוועדה של שטח מחקר (COSPAR) בשנת 1967, לכפות חוקים נוקשים על משימות רובוטיות ומזומן כוכבי לכת אחרים, ירחים שלהם, אסטרואידים וגופים שמימיים אחרים ולווסת ניקוי ועיקור של חללית, רכיבי חומרה קריטיים מוקדמת להשיק כדי לשלול זיהום מיקרואורגניזמים יבשתי ולמנוע זיהום לחצות של גופים שמימיים2. במהלך העשור האחרון, היישום של הלא-thermal פלזמות צבר רחב לב במחקר ביו-רפואי, תזונה, כמו גם בחלל יישומים3,4,5. פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי כפי שהוא מציע איון חיידקים מהיר ויעיל6, בעת היותו עדין כדי רגיש וחומרים יציב חום. פלזמה הפרשות מכילות תערובת של תגובתי סוכני כגון פוטונים אולטרה סגול (UV) ולאחר ספקטרום אולטרה סגול ואקום (VUV) אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה3אטומים מתרגש/נייטרלי, חלקיקים טעונים, רדיקלים חופשיים. במחקר זה, אנו משתמשים בלחץ נמוך פלזמה שנוצר על ידי זוגי בשילוב inductively פלזמה בלחץ נמוך (DICP) מקור7,8 כדי להשבית Bacillus subtilis endospores מופץ על זכוכית בדיקת השטח.
חיידקים גראם חיוביים של משפחת Bacillaceae מופצים באופן נרחב בבתי-גידול טבעיים של אדמה, משקעים אוויר כמו כמו דופן סביבות כגון מתקני חדר נקי, תחנת החלל הבינלאומית9,10 ,11. התכונה ברורים ביותר של הסוג של Bacillus היא יכולת ליצור עמידים מאוד endospores רדום (ןלהל נבגים) כדי לשרוד את התנאים שלילי, כגון דלדול מזין12. הנבגים עמידים בדרך כלל הרבה יותר מאשר עמיתיהם תא וגטטיבית מגוון של טיפולים, לחצים סביבתיים, כולל חום, UV, הקרנה גמא, לייבוש, הפרעה מכנית של כימיקלים רעילים, כגון המחמצנים חזק או סוכני שינוי ב- pH (נבדקה הפניות13,14) ולכן הם אובייקטים האידיאלי לבדיקת היעילות של שיטות איון מיקרוביאלי. מאז הדנ א הגנומי יעד עיקרי של טיפול פלזמה של15,חיידקים16, תיקון פלזמה-induced נגעים דנ א (למשל שוברת הד כפול) על נבג התחייה חיונית להישרדות של חיידקים13, 17.
לכן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ואת התפקיד של DNA לתקן במהלך נבג, תוצר לאחר בטיפול את הנבגים עם לחץ נמוך ארגון פלזמה על-ידי נבגים בודדים הבאים ותיקון שלהם ביטוי של DNA מתויג קרינה פלואורסצנטית חלבון רקה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונאפוקלית זמן לפתור. אנחנו נותנים הוראה צעד אחר צעד של הכנת B. subtilis נבגים ב monolayers להשגת תוצאות הבדיקה לשחזור, הטיפול של ספורה monolayers עם לחץ נמוך פלזמה עבור עיקור, הכנת פלזמה מטופלים נבגים עבור ultrastructural הערכה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM), וניתוח מיקרוסקופיה של תא חי ברמה של נבגים בודדים בהופעה עם ניטור פעיל הדנ א תיקון תהליכים המתרחשים בתוך התא בתגובה טיפול פלזמה.
עיקור וסירוס של משטחים באמצעות בטמפרטורה נמוכה, פלזמה בלחץ נמוך היא חלופה מבטיח עיקור די קונבנציונלי הליכים כגון טיפול עם מייננת קרינה, כימיקלים (למשל גזים כמו H2O2 או אתילן אוקסיד) או חום לח ויבש23. שיטות העיקור רגילים מספקים בעיקר של עיקור יעיל, אך הם ידועים כדי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה אנדריאה שרדר לסיוע טכני מעולה שלה במהלך חלקים של עבודה זו, Nikea ג’יי אולריך על הסיוע במהלך הצילומים וידאו. כן נרצה להודות לייל א סימונס על התרומה הנדיבה שלו של זנים Bacillus subtilis : LAS72 ו- LAS24. עבודה זו נתמכה חלקים על ידי מענקים מ קרן מחקר גרמני (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon פאק 728) הפלסטינית (או 7/3-1), RM (2023 מו/2-1) ואת ה-DLR להעניק חיים ISS DLR-FuW-פרויקט, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R., חומרי גלם). F.M.F. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי של אסכולת מחקר מדעי החיים שטח (SpaceLife) הלמהולץ-הגרמני וחלל מרכז (DLR) בקלן, גרמניה, אשר מומן על ידי האגודה הלמהולץ (הלמהולץ-Gemeinschaft) על פני תקופה של שש שנים ( מענק מס VH-KO-300) וקיבל כספים נוספים מבית ה-DLR, לרבות המנהלים וחלל, המכון לרפואה התעשייה האווירית לישראל. התוצאות של מחקר זה ייכלל את עבודת הדוקטורט של פליקס מ פוקס.
Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
Glass slides | VWR | 48300-026 | |
Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
Glucose | Merck | 215422 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |