Undersøge de skadelige effekter af lav pres Plasma sterilisation på overlevelse af Bacillus subtilis sporer ved hjælp af Live celle mikroskopi
Summary
Denne protokol illustrerer de vigtige træk skridt forpligtet til at vurdere relevansen af overvågning vitalitet parameter og DNA reparationsprocesser i genoplive Bacillus subtilis sporer efter behandling med lavt tryk plasma med tracking Fluorescens-mærket DNA reparere proteiner via tidsopløst Fluorescens mikroskopi og scanning Elektron Mikroskopi.
Abstract
Plasma Sterilisation er en lovende alternativ til konventionelle sterilisation metoder til industriel, klinisk, og rumflyvninger formål. Lavtryk plasma (LPP) udledninger indeholder et bredt spektrum af aktive arter, som fører til hurtige mikrobielle inaktivering. For at undersøge effektiviteten og mekanismer for Sterilisation af LPP, bruger vi sporer af testorganismen Bacillus subtilis på grund af deres ekstraordinære modstand mod konventionelle sterilisation procedurer. Vi beskrive produktionen af B. subtilis spore encellelag, sterilisering af lavtryk plasma i en dobbelt Induktivt koblet plasma-reaktoren, karakterisering af spore morfologi ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM), og den analyse af spiring og udvækst af sporer af levende celle mikroskopi. Et større mål af plasma arter er genomisk materiale (DNA) og reparation af plasma-induceret DNA læsioner på spore genoplivning er afgørende for overlevelse af organismen. Her, vi studerer spireevne af sporer og rollen af DNA reparation under sporespiring og udvækst efter behandling med LPP ved at spore fluorescently mærket DNA reparation proteiner (RecA) med tidsopløst Konfokal Fluorescens mikroskopi. Behandlet og ubehandlet spore encellelag er aktiveret for spiring og visualiseret med en inverteret Konfokal levende celle mikroskop over tid til at følge reaktionen af individuelle sporer. Vores observationer viser, at brøkdel af spire og outgrowing sporerne er afhængig af varigheden af LPP-behandling at nå minimum efter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) Fluorescens blev opdaget kun i par sporer og udviklet i alle outgrowing celler med en lille forhøjning i LPP-behandlede sporer. Desuden, nogle af de vegetative bakterier stammer fra LPP-behandlede sporer viste en stigning i cytoplasma og en tendens til at lyse. De beskrevne metoder til analyse af enkelte sporer kunne være eksemplarisk for studiet af andre aspekter af sporespiring og udvækst.
Introduction
Et vigtigt mål for udforskning af rummet er søgning efter underskrifter af livsformer og biomolekyler på andre planeter og måner i vores solsystem. Overførsel af mikroorganismer eller biomolekyler af jordbaserede oprindelse til kritiske områder for efterforskning er i særlig risiko for indvirkning på udvikling og integritet af liv-påvisning missioner på planeter såsom Mars og Europa1. De internationale retningslinjer for planeternes beskyttelse, etableret af Udvalget for Space forskning (COSPAR) i 1967, pålægge strenge regler på robotic og bemandede missioner til andre planeter, deres måner, asteroider og andre himmellegemer og regulere den rengøring og sterilisering af et rumfartøj og kritiske hardwarekomponenter forudgående at iværksætte for at eliminere forurener jordbaserede mikroorganismer og forhindre krydskontaminering af himmellegemer2. I det sidste årti, har anvendelsen af ikke-termiske plasmaer fået bred opmærksomhed i biomedicinske og ernæringsmæssige forskning samt i rumflyvning programmer3,4,5. Plasma Sterilisation er en lovende alternativ til konventionelle sterilisation metoder, som det tilbyder hurtig og effektiv mikrobielle inaktivering6, samtidig være blid til følsomme og varme labile materialer. Plasma udledninger indeholder en blanding af reaktive agenter som frie radikaler, ladede partikler, neutral/ophidset atomer, fotoner i ultraviolet (UV) og vakuum ultraviolet (VUV) spektrum, som fører til hurtige mikrobielle inaktivering3. I denne undersøgelse bruger vi lavtryks plasma genereret af dobbelt Induktivt koblet lavtryks plasma (DICP) kilde7,8 til at inaktivere Bacillus subtilis endosporer fordelt på glasoverfladen test.
Gram-positive bakterier af familien Bacillaceae er vidt udbredt i naturlige habitater fra jord, sedimenter og luften, usædvanlige miljøer såsom renrums faciliteter og den internationale rumstation9,10 ,11. De mest forskellige træk ved slægten Bacillus er evnen til at danne meget resistente hvilende endosporer (herefter benævnt sporer) for at overleve ugunstige betingelser, såsom næringsstoffer udtynding12. Sporerne er generelt mere resistente end deres vegetative celle kolleger til en bred vifte af behandlinger og miljøbelastninger, herunder varme, UV-, gammastråling, udtørring, mekanisk afbrydelse og giftige kemikalier, såsom stærke iltningsmidler eller ændring af pH agenter (gennemgik i referencer13,14) og er derfor ideelle objekter for at teste effektiviteten af mikrobielle inaktivering metoder. Da genomisk DNA er et større mål af plasma behandling af bakterier15,16, reparation af plasma-induceret DNA læsioner (f.eks. DNA dobbeltstrenget pauser) efter spore genoplivning er afgørende for overlevelse af bakterier13, 17.
Dermed, vi studerer spireevne af sporer og rollen af DNA reparation under sporespiring og udvækst efter behandling af sporer med lavt tryk argon plasma af følgende individuelle sporer og deres udtryk for fluorescens-mærket DNA reparation protein RecA med tidsopløst Konfokal Fluorescens mikroskopi. Vi giver en trinvis instruktion i forberedelsen af B. subtilis sporer i encellelag for at opnå reproducerbare testresultater, behandling af spore encellelag med lavt tryk plasma for sterilisation, forberedelse af plasma behandlet sporer for ultrastrukturelle evaluering ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM), og levende celle mikroskopi analyse i forbindelse med individuelle sporer i koncert med overvågning af den aktive DNA reparation processer, der forekommer inden for cellen i svar til plasma behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilisation af overflader ved hjælp af lav-temperatur, lavtryks plasma er en lovende alternativ til temmelig konventionelle sterilisation procedurer såsom behandling med ioniserende stråling, kemikalier (f.eks. gasser som H2O2 eller ethylenoxid) eller tørre og fugtige varme23. Almindelig sterilisation metoder for det meste give en effektiv sterilisering, men de er kendt for at påvirke det behandlede materiale og udgør en potentiel risiko for operatoren. Lavtr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne tak Andrea Schröder for hendes fremragende teknisk bistand under dele af dette arbejde og Nikea J. Ulrich for hendes hjælp under video-optagelser. Vi vil også gerne takke Lyle A. Simmons for sin generøse donation af Bacillus subtilis stammer: LAS72 og LAS24. Dette arbejde blev støttet i dele af tilskud fra den tyske Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) til PA (AW 7/3-1) og RM (MO 2023/2-1) og DLR yder DLR-FuW-Projekt ISS liv, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (til F.M.F, M.R. og R.M.). F.M.F. blev støttet af et ph.d.-stipendium af Helmholtz plads Life Sciences Research School (SpaceLife) på tysk Aerospace Center (DLR) i Köln, Tyskland, som blev finansieret af Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) over en periode på seks år ( Grant nr. VH-ko-300) og modtog yderligere midler fra DLR, herunder Aerospace direktionen og flyvemedicin Institut. Resultaterne af denne undersøgelse vil indgå i Ph.D.-afhandling af Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
