Summary
Denne protokol illustrerer de vigtige træk skridt forpligtet til at vurdere relevansen af overvågning vitalitet parameter og DNA reparationsprocesser i genoplive Bacillus subtilis sporer efter behandling med lavt tryk plasma med tracking Fluorescens-mærket DNA reparere proteiner via tidsopløst Fluorescens mikroskopi og scanning Elektron Mikroskopi.
Abstract
Plasma Sterilisation er en lovende alternativ til konventionelle sterilisation metoder til industriel, klinisk, og rumflyvninger formål. Lavtryk plasma (LPP) udledninger indeholder et bredt spektrum af aktive arter, som fører til hurtige mikrobielle inaktivering. For at undersøge effektiviteten og mekanismer for Sterilisation af LPP, bruger vi sporer af testorganismen Bacillus subtilis på grund af deres ekstraordinære modstand mod konventionelle sterilisation procedurer. Vi beskrive produktionen af B. subtilis spore encellelag, sterilisering af lavtryk plasma i en dobbelt Induktivt koblet plasma-reaktoren, karakterisering af spore morfologi ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM), og den analyse af spiring og udvækst af sporer af levende celle mikroskopi. Et større mål af plasma arter er genomisk materiale (DNA) og reparation af plasma-induceret DNA læsioner på spore genoplivning er afgørende for overlevelse af organismen. Her, vi studerer spireevne af sporer og rollen af DNA reparation under sporespiring og udvækst efter behandling med LPP ved at spore fluorescently mærket DNA reparation proteiner (RecA) med tidsopløst Konfokal Fluorescens mikroskopi. Behandlet og ubehandlet spore encellelag er aktiveret for spiring og visualiseret med en inverteret Konfokal levende celle mikroskop over tid til at følge reaktionen af individuelle sporer. Vores observationer viser, at brøkdel af spire og outgrowing sporerne er afhængig af varigheden af LPP-behandling at nå minimum efter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) Fluorescens blev opdaget kun i par sporer og udviklet i alle outgrowing celler med en lille forhøjning i LPP-behandlede sporer. Desuden, nogle af de vegetative bakterier stammer fra LPP-behandlede sporer viste en stigning i cytoplasma og en tendens til at lyse. De beskrevne metoder til analyse af enkelte sporer kunne være eksemplarisk for studiet af andre aspekter af sporespiring og udvækst.
Introduction
Et vigtigt mål for udforskning af rummet er søgning efter underskrifter af livsformer og biomolekyler på andre planeter og måner i vores solsystem. Overførsel af mikroorganismer eller biomolekyler af jordbaserede oprindelse til kritiske områder for efterforskning er i særlig risiko for indvirkning på udvikling og integritet af liv-påvisning missioner på planeter såsom Mars og Europa1. De internationale retningslinjer for planeternes beskyttelse, etableret af Udvalget for Space forskning (COSPAR) i 1967, pålægge strenge regler på robotic og bemandede missioner til andre planeter, deres måner, asteroider og andre himmellegemer og regulere den rengøring og sterilisering af et rumfartøj og kritiske hardwarekomponenter forudgående at iværksætte for at eliminere forurener jordbaserede mikroorganismer og forhindre krydskontaminering af himmellegemer2. I det sidste årti, har anvendelsen af ikke-termiske plasmaer fået bred opmærksomhed i biomedicinske og ernæringsmæssige forskning samt i rumflyvning programmer3,4,5. Plasma Sterilisation er en lovende alternativ til konventionelle sterilisation metoder, som det tilbyder hurtig og effektiv mikrobielle inaktivering6, samtidig være blid til følsomme og varme labile materialer. Plasma udledninger indeholder en blanding af reaktive agenter som frie radikaler, ladede partikler, neutral/ophidset atomer, fotoner i ultraviolet (UV) og vakuum ultraviolet (VUV) spektrum, som fører til hurtige mikrobielle inaktivering3. I denne undersøgelse bruger vi lavtryks plasma genereret af dobbelt Induktivt koblet lavtryks plasma (DICP) kilde7,8 til at inaktivere Bacillus subtilis endosporer fordelt på glasoverfladen test.
Gram-positive bakterier af familien Bacillaceae er vidt udbredt i naturlige habitater fra jord, sedimenter og luften, usædvanlige miljøer såsom renrums faciliteter og den internationale rumstation9,10 ,11. De mest forskellige træk ved slægten Bacillus er evnen til at danne meget resistente hvilende endosporer (herefter benævnt sporer) for at overleve ugunstige betingelser, såsom næringsstoffer udtynding12. Sporerne er generelt mere resistente end deres vegetative celle kolleger til en bred vifte af behandlinger og miljøbelastninger, herunder varme, UV-, gammastråling, udtørring, mekanisk afbrydelse og giftige kemikalier, såsom stærke iltningsmidler eller ændring af pH agenter (gennemgik i referencer13,14) og er derfor ideelle objekter for at teste effektiviteten af mikrobielle inaktivering metoder. Da genomisk DNA er et større mål af plasma behandling af bakterier15,16, reparation af plasma-induceret DNA læsioner (f.eks. DNA dobbeltstrenget pauser) efter spore genoplivning er afgørende for overlevelse af bakterier13, 17.
Dermed, vi studerer spireevne af sporer og rollen af DNA reparation under sporespiring og udvækst efter behandling af sporer med lavt tryk argon plasma af følgende individuelle sporer og deres udtryk for fluorescens-mærket DNA reparation protein RecA med tidsopløst Konfokal Fluorescens mikroskopi. Vi giver en trinvis instruktion i forberedelsen af B. subtilis sporer i encellelag for at opnå reproducerbare testresultater, behandling af spore encellelag med lavt tryk plasma for sterilisation, forberedelse af plasma behandlet sporer for ultrastrukturelle evaluering ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM), og levende celle mikroskopi analyse i forbindelse med individuelle sporer i koncert med overvågning af den aktive DNA reparation processer, der forekommer inden for cellen i svar til plasma behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacillus subtilis Spore produktion og rensning
- Overfør en 5 mL overnight kultur af de respektive for at spore produktionen, B. subtilis stamme, suppleret med passende antibiotika til 200 mL dobbelt-styrke flydende Schaeffer sporulering medium (pr. liter 16 g næringsstof bouillon, KCl 2 g, 0,5 g MgSO 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (3)2, 2 mL 0,1 M frihedsbevægelse2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL 50% (w/v) glukose18) og dyrke det med kraftig luftning ved 37 ° C i 72 timer eller indtil > 95% af kultur har sporeform. Sporer af følgende stammer bruges: B. subtilis PY79 (vilde type) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (mangelfuld DNA reparation protein RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: kat (RecA sammensmeltet med gul fluorescerende proteiner [YFP]19).
- Høste sporer ved centrifugering i 15 min. ved 3.000 x g i 50 mL rør og rense prøverne ved gentagen vask trin (op til 15 gange) ved hjælp af sterilt destilleret H2O og check for renhed og spireevne status af fasekonstrastmikroskopi. Sikre at spore suspensioner består af fase-lyse sporer (> 99%) og er fri for vegetative celler (stave), spirede sporer (sort / grå udseende) og celle debris, ellers yderligere mikroskopi eksperimenter kan blive forstyrret. Vask prøven, indtil ønskede renhed er nået.
- Praecise spore titer af plating ud 50 µL af 10-fold serielle fortyndinger på LB-agar (dvs.: brug 30 µL prøve + 270 µL sterilt vand til en 1:10 fortynding. Tage 30 µL af den pågældende fortynding til 270 µL H2O for en 1: 100 fortynding og så videre) at beregne CFU (kolonidannende enheder) og inkuberes plader ved 37 ° C natten over. Efter CFU bestemmelse, skal du justere prøven til 109 sporer pr. mL af koncentration eller fortynding med sterilt vand.
2. Prøvetilberedning af Aerosol-deponeret Bacillus subtilis sporer
Bemærk: Ophobning og overlapning af sporer kunne medføre shadowing effekter under behandling, i sidste ende resulterer i forfalskede inaktivering kinetik. For at minimere dette problem, skal du forberede sporedannelse proever af en aerosol-deposition teknik20. Kort, styre høj præcision to-stof dyse med en elektrisk timer, der regulerer den flydende gennemløb i koncert med strømmen af trykisoleret bæregas (her N2). Sprede injiceres flydende prøven gennem dysen outlet med nitrogen gasflow.
- Placer en prøve luftfartsselskab i form af steriliseret mikroskopiske dias (for overlevelse kinetik) eller runde 25 mm coverslips (for fluorescerende sporing af DNA reparation processer/cLSM; Konfokal laser scanning mikroskopi) inde den elektrisk drevne aerosol sprøjtning enhed i tråd med dysen. Den anvendte spore koncentration skal svare til en hundredfold af den ønskede slutkoncentration.
- Overføres 1 mL af spore kultur til dysen væske indtag og indlede den sprøjtning 0,1 s ved et tryk på 1,3 bar. Sprøjtet Sporeopslæmningen (1 x 107) danner en tynd film på det mikroskopiske dias, der tørrer hurtigt inden for sekunder at danne et ensartet fordelt spore éncellelag. Gemme de behandlede prøve luftfartsselskaber i en steril beholder ved stuetemperatur.
3. lavtryk Plasma behandling
- Forberede plasma system til behandling af biologiske prøver og betjene systemet på 5 Pa med argon plasma ved 500 W i 5 min. Af dette, er alle overflader i systemet renset og varmet op. Dette reducerer stikning af molekyler fra luften, nemlig nitrogen, ilt og vand, mens udluftning systemet. Efter forbehandling af systemet, lufte kammeret og prøveemner omhyggeligt i midten af reaktortanken ved hjælp af glas stativer.
- Brug mindst tre biologiske replikater. Luk kammeret og evakuere under 2 Pa. bagefter, udfylde proces gas ind i kammeret. Regulere trykket i systemet til 5 Pa.
- Efter den definerede procestid, slukke for strøm og gas levering og omhyggeligt udlufte systemet for at forhindre blæser prøverne fra prøveholderen. Efter ventilation, fjerne prøverne og prøveemner for den næste parameter i systemet. For ikke-plasma-behandlede kontrol udsætte prøver at støvsuge kun (5 Pa) i tilstedeværelse af processen gas svarende til den længste anvendte plasma tid.
4. genvinding og evaluering af Spore overlevelse
- Der fremstilles en opløsning af autoklaveres 10% polyvinylacetat (PVA) og dække prøve carrier omhyggeligt med ca. 500 µL og lad dem lufttørre for 4 h. Strip off tørrede PVA laget (nu med eksemplet spore) ved hjælp af steril pincet og overføre det til en 2 mL reaktion tube. Der tilsættes 1 mL sterilt vand til røret og opløse PVA lag via vortexing. Denne fremgangsmåde fører til > 95% genanvendelse af sporer og påvirker ikke deres spireevne kapacitet21.
- Seriefremstillede Fortynd prøven 1:10 i sterilt vand i en 96-brønd plade (dvs. 270 µL sterilt H2O + 30 µL prøve/tidligere fortynding). Plade ud 50 µL af hver fortynding på Lysogeny bouillon nutrient agar (LB), inkuberes plader ved 37 ° C natten over og optælle antallet af dyrkede kolonier (CFU).
5. levende celle mikroskopi og sporing af DNA reparationsprocesser i spirende sporer
- For spiring eksperimenter, forberede en 1 mm tyk 1,5% LB-agar pad, ved kogning 700 µL medium og afpipetteres i en steril mikroskopi petriskål. Efter 10 min, skære en 8 mm x 8 mm x 1 mm LB-agar pad med en steril skalpel og overføre agar forsigtigt oven på de spore encellelag, som hviler på 25 mm glas coverslips.
Bemærk: Dette trin er afgørende for visualisering af individuelle sporer og tillade følge deres reaktion mod aktivering af spiring induceret af den nutrient agar. Således tjener LB-agar to formål, (1) at fastsætte sporer på overfladen, som undgår relocalization langs overfladen og ud af optisk fokus, og (2) aktivere spore for spiring. - Efter dækker prøve med agar, overføre glas coverslip hurtigt ind i en billeddannelse kammer og mikroskop prøver med en automatiseret Konfokal laser-scanning mikroskop med omvendte optik ved at bruge en 63 X / 1.3 fly apokromatiske oliebestandighedsobjektet.
-
Udføre billeddannelse af fluorescens (YFP) med en excitation boelgelaengden 514 nm og emission kan påvises mellem 520 og 560 nm.
- Optag lysfelt billeder i scannetilstand ved hjælp af en foto multiplikatorer (gennemlys sti).
- Optage time-lapse serien med en laser power på 2,6%, og Indstil Konfokal blænden til 5 luftige enheder og med en prøve hyppighed på 1 indramme per 30 s fra 0 h 5 h, afhængigt af eksperimentet. Det er særligt bemærkelsesværdigt at høje doser af monokromatisk laser belysningsstyrke på 514 nm helt hæmme spiring (figur 1A, B).
- Holde prøverne ved 37 ° C (luftens fugtighed) i en varme scenen under hele billedprocessen. Brug mindst tre biologiske flergangsbestemmelser for hver betingelse. Spore sammenlægning, flerlaget spore distribution eller forurening af støvpartikler, blokering af plasma behandling ("skygger") kan opstå og aktiverer spiring af skygget sporer (figur 1C, D).
Figur 1: potentielle problemer observeret under Konfokal levende celle Fluorescens mikroskopi af plasma behandlet sporer. (A, B) Hæmning af sporespiring af høje doser af monokromatisk (514 nm) laser belysningsstyrke. (A) oversigt (3 x 3 syet billeder) af B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer 180 min. efter indledningen af spireevnen. Ramme i midten blev udsat 30 s mellemrum for høje doser af laserlys (514 nm, 70% laser power), der henviser til, at de omkringliggende regioner (= rammer) ikke var oplyst (flettede billede af lysfelt kanal og RecA-YFP fluorescens; bestilt strukturer blev forårsaget ved hjælp af 35 mm imaging retter med et påtrykt 500 µm gitter). (B) viser en 4 X forstørret visning af grænsen mellem belyst og ikke-belyste region viser at sporer, som blev udsat for høje doser af monokromatisk laser belysningsstyrke ikke spire og vokse ud, hvorimod sporer i ikke-belyste områder fuldt ud at genvinde til vegetative bakterier udtrykker lyse RecA-YFP fluorescens (grønne signal). (C, D) Sporerne er omfattet af forurenende partikler eller flere lag af spore (pile) synes at beskytte underliggende sporer fra inaktivering af plasma behandling og tillade deres spireevne og udvækst ("shadowing virkning"). (C) sporer blev plasma-behandlet for 60 s og afbildet 180 min. efter indledningen af spireevnen eller i (D) for 120 s og afbildet efter 240 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
6. scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Bruge scanning elektronmikroskopi for at give ultrastrukturelle oplysninger om overflade morfologi af plasma behandlet sporer sammenlignet med ubehandlet kontrol. Coat tørrede spore encellelag på coverslips med guld-palladium (3 nm) ved hjælp af en sputter-coater. Bruge et felt-emission scanning elektron mikroskop til imaging prøver, drives på 5 kV acceleration spænding herunder en in-linse sekundære elektron detektor for at afsløre topografi kontrast.
7. dataanalyse
- Bestemme spore overlevelse fra kvotienten N/N0, hvor N er gennemsnitlige CFU behandlede prøver og N0 er gennemsnitlige CFU af ubehandlet vakuum kontrol. Plot spore inaktivering af argon plasma behandling som en funktion af tid (i sekunder). Udtrykke alle data som gennemsnits- og standardafvigelser (n = 3).
- Analysere billeder fremstillet af levende celle imaging ved hjælp af billedbehandling software. Kvantificere andelen af sporespiring og outgrowing efter plasma behandling, tælle sporer i repræsentative rammer i begyndelsen af eksperimentet og efter 4 timer. Betydning bestemmelse i spore overlevelse assays, bruge en-vejs ANOVA-tests (analyse af varians) med statistisk software). P værdier < 0,05 betragtes som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse af plasma-behandlede B. subtilis sporer
Plasma behandling af B. subtilis sporer anvendes i denne undersøgelse viser et fald i overlevelse med stigende varighed af plasma behandling (figur 2). Sporer af stammen at udtrykke recA-gen sammenvokset til YFP viste overlevelse kurver svarende til sporer af vildtype stamme, som angiver, at den genetiske modifikation har ingen signifikant effekt på bakteriel vitalitet. Sporer af RecA-mangelfuld stamme udviser en højere følsomhed mod plasma behandling i forhold til sporerne af vildtype stamme, demonstrerer, at tilstedeværelsen af RecA gen reducerer plasma-induceret tab af vitalitet. Især korte plasma behandling af 15 s (P <0,003) og 30 s (P < 0,004) medføre en betydelig nedgang i vitalitet i RecA-mangelfuld stammer i forhold til vildtype og RecA-YFP stammer. Efter 90 s af plasma behandling, vitalitet af alle stammer, der er reduceret med cirka tre størrelsesordener.
Figur 2: Overlevelse af B. subtilis sporer fra forskellige stammer efter behandling med lavtryks argon plasma. Overlevelse (gennemsnitlig CFU af plasma behandlet sporer/gennemsnit CFU af vakuum behandlede sporer; fejllinjer repræsenterer standardafvigelse) afbildes som funktion af plasma behandlingens varighed. PY79 (vildtype, lukkede cirkler), LAS72 (RecA-YFP, grå cirkler) og LAS24 (ΔrecA; åbne cirkler). Statistiske analyser viste ingen væsentlige forskelle i spore overlevelsesevne mellem PY79 (uændrede RecA) og LAS72 (RecA-YFP-fusion).
Ultrastrukturelle analyse af plasma-behandlede sporer af SEM
For at få en idé om den morfologiske virkningen af plasma blev behandling på sporer, scanning elektronmikroskopi (SEM) brugt til at analysere overflade morfologi af plasma behandlet sporer i forhold til vakuum-behandlede sporer (kontrol). Den ydre overflade af B. subtilis sporer afsløre karakteristiske langsgående ridge-lignende strukturer, som hele tiden kan ses i alle behandlede og ubehandlede sporer (figur 3). Plasma behandling op til 30 s inducerer ingen væsentlige ændringer af spore overflade morfologi i forhold til kontrol (fig. 3A-C). Øget varighed af plasma behandling (60-240 s) fører til en mere kornede spore overflade (figur 3D-F) og små revner og sprækker kan observeres i sporer behandlet for 120 eller 240 s. Desuden lille globules opstår på spore overflader (120 s og 240 s behandlinger, figur 3E, F), som er forårsaget af udgivet materiale fra pelsen, cortex eller fra inderste kerne22. Disse globules dække hele spore og kan findes på vene-formede strukturer samt på mellemliggende overflader.
Figur 3: SEM af B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporer sprøjtes på glas coverslips efter lavtryks plasma behandling. Sporer udsat for at støvsuge kun og ikke til plasma (kontrol) er vist i (A). (B-F) Sporer som var plasma-behandlet med stigende varighed (15, 30, 60, 120 og 240 s). Sporer, som blev behandlet med plasma 60 s eller længere synes mere kornede på deres overflade end kontrol sporer eller sporer som blev plasma behandlet for 15 og 30 s. revner og sprækker (hvide pile) er synlige på overfladen af sporer plasma-behandlet for 120 eller 240 s. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Live celle mikroskopi af plasma-behandlede B. subtilis sporer
Levende celle mikroskopi af genoplivelse sporer fra B. subtilis stammer udtrykker fluorescens-mærket reparation protein RecA (RecA-YFP) er udført for at analysere spireevnen og udtryk for RecA-YFP af individuelle sporer i svar til plasma behandling. Her bruger vi tidsopløst fluorescens laser scanning mikroskopi for at følge spiring, udvækst og progression i vegetativ tilstand af plasma-behandlede sporer (figur 4) med hensyn til potentielt kendte problemer fx shadowing effekter eller den hæmning af spiring af høje doser af monokromatisk laser belysningsstyrke (figur 1). Sporer udsat for vakuum eneste (kontrol, figur 4A-C), udstille par fluorescerende signaler under tidlige stater af spore genoplivning (0 - 65 min, ikke vist). En forøgelse af fluorescens intensitet, sandsynligvis på grund af ophobning af RecA-YFP, er observeret ved ≥ 65 min når vegetative celler dannes og første celler begynder at dele. Alle disse celler havnen et fluorescens signal akkumuleret i mindst én plads i hver celle. Næsten alle sporer (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) behandlet med vakuum, som et kontrolelement spire og udvikle en stavformet celle morfologi med en temmelig ensartet længde på enkelte celler (fig. 4B-C). I modsætning til sporer i vakuum kontrol, sporer behandlet for 15 s med plasma allerede viser en nedsat spireevne på mindre end 75 ± 4% (197 ± 8 sporer, n = 3, figur 4D-F), der angiver, at plasma behandling inducerer skader i hvilende sporer, som forhindrer spiring. Derudover er morfologi af outgrowing celler forskellige fra morfologi af celler i kontrolelementer. Celler vokse enten i udstrakt grad lange stænger (længere end i forhold til kontrol) eller forblive små og holde fast i spore frakke (figur 4G-jeg). Desuden lyse mest aflange celler med stigende Cellestørrelse (hvid pilespidser, figur 4F). Fluorescens signaler af RecA-YFP i cellerne synes at være steget en smule i forhold til signaler i kontrol celler (figur 4C, F), men ingen væsentlige forskelle kan observeres (ikke vist). Sporer som var plasma behandlet for 30 s spire op til 25 ± 6% (99 ± 4 sporer, n = 3) og vegetative celler er især forsinket vækst i forhold til kontrol sporer og sporer efter 15 s af plasma-behandling. Vegetative celler er temmelig lille og stang-formede men varierer i længde (fig. 4G-jeg). Dog celler i alle størrelser kan lyse under længere inkuberingstider set prøver efter 15 s af plasma-behandling. Efter 60 s af plasma-behandling er mindre end 2 ± 2% (8 ± 8 sporer, n = 3) sporer er i stand til at danne vegetative celler (figur 4J-L). Sporer, som er plasma-behandlet for 90, 120 eller 240 s kan analyseres, men de viser ingen udvækst eller enhver ændring i fluorescens niveauer af RecA-YFP (ikke vist).
Figur 4: Konfokal laser-scanning live celle mikroskopi af B. subtilis sporer fra en stamme at udtrykke RecA-YFP efter plasma behandling og indledningen af spireevnen. Sporerne blev fulgt over tid (ét billede pr. 30 s) og billeder for tid-punkt 0, 2 og 4 h er vist. (A-C) Sporer behandlet med vakuum kun og ikke med plasma (kontrol) spire og vokse ud til vegetative celler (B) og indtaste eksponentielle vækstfase (C). (D-L) Sporer behandlet for forskellige varighed med lavtryks argon plasma vise betydelige forskelle i deres udvækst i forhold til sporerne af kontrol (Se tekst for detaljer). (D-F) 15 s behandling (hvid pilespidser repræsenterer vegetative celler, som for nylig mængden), (G-jeg) 30 s behandling (sort pilespidser visualisere vegetative celler, som var små og holde i spore frakke) og (J-L) 60 s behandling efter 0, 2 og 4 h spore restitutionstid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sterilisation af overflader ved hjælp af lav-temperatur, lavtryks plasma er en lovende alternativ til temmelig konventionelle sterilisation procedurer såsom behandling med ioniserende stråling, kemikalier (f.eks. gasser som H2O2 eller ethylenoxid) eller tørre og fugtige varme23. Almindelig sterilisation metoder for det meste give en effektiv sterilisering, men de er kendt for at påvirke det behandlede materiale og udgør en potentiel risiko for operatoren. Lavtryks plasma tilbyder en hurtig og ensartet biologiske inaktivering ved hjælp af sammensætningen af adskillige komponenter såsom UV fotoner, frie elektroner, ioner og forladt atomer eller molekyler (fx ROS). LPP kan derfor anvendes til varme- og korrosion følsomme materialer, såsom termoplastisk polymerer til implantater, elektroniske instrumenter eller komplekse 3D-strukturer. I den nuværende papir vi demonstrere anvendelsen af sådan et testsystem, som encellelag af sprøjtede B. subtilis sporer20 er behandlet i en særlig lavtryks plasma-reaktoren, som blev beskrevet for nylig i detalje7. Mikroskopisk lysfelt undersøgelse af plasma-behandlede sporer kan være tilstrækkeligt til at opnå et samlet skøn sterilisation effektivitet. Men vi er interesseret i at målrette de underliggende mekanismer af lavtryk plasma og dens indflydelse på spore inaktivering på molekylært niveau. I kombination med fluorescerer-tracking mikroskopi det gør os i stand til at kaste lys over detaljerne i denne særlige molekylære svar i plasma-behandlede sporer og potentielt give os indsigt i grundlæggende inaktivering mekanisme af lavtryk plasma.
Her, fokuserer vi på analyse af plasma-behandling effektivitet og virkninger ved hjælp af levende celle mikroskopi, som giver mulighed for følgende individuelle sporer efter indledningen af spireevnen. Bemærkelsesværdigt, denne særlige tilgang afslører et par nye resultater, som ikke kan leveres ved at måle revitalisering af hele spore befolkningen ved hjælp af bestemmelse af celle nummer eller CFU. Først og fremmest plasma-behandling af sporer ikke kun påvirker udvækst kapacitet i en dosisafhængig måde, som forventet fra måling af overlevelse ved bestemmelse af CFUs, men også morfologi af vegetative celler, der udvikler ofte store stænger ude af stand til form septa ifølge korrekt celledeling sammen med små celler stikning i spore (15 s af plasma-behandling) eller celler på en reduceret længde (30 s af plasma-behandling). Observationer af celler med reduceret længde viste ingen opsving til normal celle længde på senere tidspunkter. Derudover leve celle imaging afslører, at de fleste af de morfologisk ændrede celler lyse i senere faser af observation. Det betyder at skade erhvervet af sporerne under plasma-behandling er kun effektiv i senere faser af spore revitalisering, formentlig på grund af DNA-skader og at maskinen bruges til spiring og udvækst er mere robust over for plasma sterilisation end maskinen behov for vegetativ vækst. Bemærkelsesværdigt, udtryk for reparation af DNA RecA protein synes at være lav og næsten fraværende i sporer og udvikler under udvækst og vegetative fase, som er angivet med en stigning i RecA-YFP fluorescens17. Men selv et let øget RecA udtryk i outgrowing plasma-behandlede sporer, i forhold til kontrol sporer, bidrager ikke til at redde celle vitalitet kvantitativt, fordi de fleste celler lyse eller briste efter udvækst, især efter mere end 3 timer af inkubation. Denne effekt kan visualiseres ved hjælp af levende celle film fra time lapse billeder af spirede sporer. Vi kan ikke udelukke, at denne effekt er overvurderet i særlige dyrkning betingelsen hvor cellerne er tvunget i en éncellelag ved hjælp af en tynd overlejring af agar.
Et andet resultatet af analysen af levende celle mikroskopi er, at partikler forureninger (f.eks. støvpartikler, andre sporer) på spore éncellelag overflade kan beskytte de underliggende sporer fra de skadelige virkninger af plasma. I sådanne tilfælde synes endnu længere plasma-behandling at være ineffektive. Da sådanne forureninger er svære at undgå helt, bør alternative plasma-behandling strategier testes, som ved hjælp af planetariske rotation under plasma behandling i forbindelse med længere varighed af behandlingen. Analyse af SEM angiver at spore pelsen er perforeret med øget varighed af plasma-behandling, som er i overensstemmelse med teorien om plasma-medierede virkninger på spørgsmål22,24. En længere eksponeringstid (> 240 s) til plasma kan endda perforere de forurenende partikler og dermed kan skader og inaktivere de underliggende sporer.
Den præsenterede protokol for levende celle mikroskopi af sporespiring og udvækst kan være egnet til andre undersøgelser. Dækker sporer med et tyndt lag af agar tvinger sporer i et særskilt optisk fly og begrænser sideværts bevægelse. Begge effekter garantere, at sporerne og outgrowing celler forblive inden for den valgte imaging ramme. Lignende metoder har været beskrevet før25 men giver mindre fleksibilitet end metoden beskrevet her som giver mulighed for at vælge næsten hvilken som helst prøve carrier (f.eks. et glas dias, coverslip eller petriskålen). I vores hænder kunne andre vegetative bakterier analyseres af levende celle mikroskopi ved hjælp af metoden agar, der dækker). Under alle omstændigheder bør omhyggelig kontrol forsøg udføres for at vurdere eventuelle virkninger af foto skader under levende celle imaging, fordi vi observeret, at høje doser af monokromatisk laserlys helt hæmme sporespiring. Bortset fra afkortning belysning tid, dvs ved at øge observation intervaller, kan dette fænomen forebygges ved at reducere laser intensitet og/eller åbning af en Konfokal blænde (pinhole).
Sammenfattende er blandt de teknikker, der anvendes til at undersøge effektiviteten af plasma-behandling i modellen af sprøjtede B. subtilis spore encellelag, levende celle mikroskopi giver unikt indblik i cellulære begivenheder under spore genoplivning og tilbyder muligheden til at analysere dynamikken i fluorescens-mærket proteiner. Desuden de særlige prøveforberedelse, dvs tildækning af sporer med et tyndt lag af agar, kunne være paradigmatiske for billeddannelse af andre mikroorganismer ved levende celle mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne tak Andrea Schröder for hendes fremragende teknisk bistand under dele af dette arbejde og Nikea J. Ulrich for hendes hjælp under video-optagelser. Vi vil også gerne takke Lyle A. Simmons for sin generøse donation af Bacillus subtilis stammer: LAS72 og LAS24. Dette arbejde blev støttet i dele af tilskud fra den tyske Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) til PA (AW 7/3-1) og RM (MO 2023/2-1) og DLR yder DLR-FuW-Projekt ISS liv, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (til F.M.F, M.R. og R.M.). F.M.F. blev støttet af et ph.d.-stipendium af Helmholtz plads Life Sciences Research School (SpaceLife) på tysk Aerospace Center (DLR) i Köln, Tyskland, som blev finansieret af Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) over en periode på seks år ( Grant nr. VH-ko-300) og modtog yderligere midler fra DLR, herunder Aerospace direktionen og flyvemedicin Institut. Resultaterne af denne undersøgelse vil indgå i Ph.D.-afhandling af Felix M. Fuchs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D.
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P.
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P.
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
