Summary
Bu iletişim kuralı canlılık parametre ve düşük basınç plazma ile tedaviden sonra Bacillus subtilis sporlar canlandırıcı olarak DNA onarım işlemleri izleme alaka değerlendirmek için izleme tarafından gereken önemli ardışık adımlar gösterilmektedir Floresans etiketli DNA onarım proteinler confocal mikroskobu zaman karar vermek ve elektron mikroskobu tarama yoluyla.
Abstract
Plazma sterilizasyon geleneksel sterilizasyon yöntemleri sanayi, klinik ve uzay uçuşu amaçlar için umut verici bir alternatiftir. Alçak basınç plazma (LPP) deşarj için hızlı mikrobiyal inactivation kurşun etkin türleri, geniş bir yelpazede içerir. Verimlilik ve mekanizmaları sterilizasyon LPP tarafından çalışmaya, sporlar test organizmanın Bacillus subtilis geleneksel sterilizasyon prosedürleri karşı olağanüstü onların direnci nedeniyle kullanıyoruz. B. subtilis spor monolayers, bir çift İndüktif eşleşmiş plazma reaktörü, tarama elektron mikroskobu (SEM), kullanarak spor morfolojisi karakterizasyonu plazmada düşük basınç sterilizasyon işleminin üretim tarif ve çimlenme ve sporlar canlı cep mikroskobu tarafından akıbet analizi. Plazma türler uğrak bir genomik malzeme (DNA) ve plazma kaynaklı DNA lezyonlar spore canlanma üzerine tamiri organizmanın hayatta kalmak için çok önemli. Burada, biz sporlar çimlenme kapasitesi çalışma ve DNA'ın rolü onarım spor çimlenmesi ve akıbet sırasında LPP ile tedaviden sonra fluorescently etiketli DNA onarım proteinler (RecA) zaman çözüldü confocal Floresans mikroskobu ile takip ederek. Tedavi ve tedavi edilmezse spor monolayers çimlenme için harekete geçirmek ve bir ters confocal canlı cep mikroskobu ile bireysel sporlar reaksiyon izleyin zaman içinde görüntülenir. Gözlemlerimiz takımıdır ve sporlar büyümüş kısmını LPP-tedavi en az 120 RecA-YFP (sarı Floresans protein) Floresans sadece birkaç sporlar algılandı ve toplamda geliştirilen s. sonra ulaşma süresi bağlıdır ortaya LPP tedavi sporlar içinde hafif bir ayrıcalık hücrelerle büyümüş. Ayrıca, bazı bitkisel bakteri LPP tedavi sporlar sitoplazma içinde artış gösterdi türetilen ve koşullar olarak gördüler. Bireysel Sporlar çözümlenmesi için açıklanan yöntemleri diğer yönleri spor çimlenmesi ve akıbet çalışma için örnek olabilir.
Introduction
Uzay araştırmaları ana amacı yaşam formları ve biomolecules diğer gezegen organları ve uyduları Güneş Sistemi'ndeki imzalar için aramasıdır. Mikroorganizmaların transferi veya kritik alanlarda keşif için karasal kökenli biomolecules geliştirme ve hayat-algılama misyonlar Mars ve Europa1gibi gezegen Cesetlerdeki bütünlüğünü çarpışmaya belirli risk var. Gezegensel koruma Komitesi, uzay araştırma (gösterge tarafından) 1967'de kurulan, uluslararası kurallara ve diğer gezegenler, onların uyduları, asteroitler ve diğer Gök cisimleri insanlı ve robotik görev üzerinde sıkı kuralları empoze düzenleyen Temizlik ve sterilizasyon bir uzay aracı ve kritik donanım bileşenlerinin önceki karasal mikroorganizmaların kirletici ortadan kaldırmak ve Gök cisimleri2çapraz kontaminasyonu önlemek için başlatmak için. Son on yıl içinde sigara termik Plazmaları uygulanması geniş dikkat Biyomedikal ve beslenme araştırma yanı sıra uzay uçuşu uygulamaları3,4,5kazanmıştır. Nazik için hassas ve ısı değişken malzeme olurken hızlı ve verimli mikrobiyal inactivation6, sunduğundan plazma sterilizasyon geleneksel sterilizasyon yöntemleri için umut verici bir alternatiftir. Plazma deşarj serbest radikaller, parçacıklar, atomlar tarafsız/heyecanlı, hızlı mikrobiyal inactivation3' e yol fotonlar ultraviyole (UV) ve vakum ultraviyole (VUV) spektrum gibi reaktif maddeler karışımını içerir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis Endosporlar cam test yüzey üzerinde dağıtılmış devre dışı bırakabilirsiniz için alçak basınç plazma Çift Kişilik İndüktif eşleşmiş alçak basınç plazma (DICP) kaynak7,8 tarafından oluşturulan kullanın.
Gram-pozitif bakteri Bacillaceae ailesinin yaygın olarak toprak, çökeller ve hava de temiz Oda imkanları ve Uluslararası Uzay İstasyonu9,10 gibi olağandışı ortamlar gibi doğal habitatları dağıtılır ,11. En farklı cins Bacillus besin tüketme12gibi olumsuz koşullar hayatta kalmak için son derece dayanıklı uyuyan Endosporlar (bundan sonra sporlar anılacaktır) oluşturmak için yetenek özelliğidir. Sporlar onların bitkisel hücre göre daha genellikle çok daha dayanıklı çeşitli tedaviler ve çevresel stresleri, ısı, UV, gama ışınlama, kuruma, mekanik bozulma ve güçlü oksitleyiciler gibi zehirli kimyasallar da dahil olmak üzere veya pH değişen ajanlar (başvurular13,14' te gözden) ve bu nedenle mikrobiyal inactivation yöntemleri verimliliği test için ideal nesneleridir. Genomik DNA uğrak bir bakteri15,16, plazma kaynaklı DNA lezyonlar tamiri plazma tedavisinin olduğu (örneğin DNA çift iplik sonları) Spor canlanma bakteri13, yaşam için çok önemlidir 17.
Bu nedenle, biz sporlar çimlenme kapasitesi ve DNA tamiri rolü spor çimlenmesi ve akıbet sırasında düşük basınç argon plazma ile sporlar aşağıdaki bireysel sporlar tarafından tedavi sonra çalışma ve onların ifade Floresans etiketli DNA onarım protein RecA zaman çözüldü confocal Floresans mikroskobu ile. Biz ulaşmak tekrarlanabilir test sonuçları, spor monolayers sterilizasyon için düşük basınç plazma ile tedavisi, tedavi plazma sporlar için hazırlanması için monolayers içinde bir adim adim öğretim B. subtilis sporlar hazırlanması vermek Bireysel Sporlar etkin DNA izleme ile konser düzeyinde tarama elektron mikroskobu (SEM) ve canlı cep mikroskobu çözümlemesi kullanarak ultrastructural değerlendirme süreçleri plazma tedaviye yanıt hücre içerisinde meydana gelen onarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bacillus subtilis Spore üretim ve arıtma
- Spore üretimi için ilgili 5 mL gecede kültürünün aktarım B. subtilis zorlanma, 200 mL çift-güç sıvı Schaeffer sporulation orta (başına litre 16 gr besin et suyu, KCl 2 g, 0.5 g MgSO uygun antibiyotikler ile takıma 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (NO3)2, 2 mL 0.1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL % 50 (w/v) glikoz18) ve 37 ° C'de 72 h için veya Kültür > %95 kadar güçlü havalandırma ile yetiştirmek sporulated. Aşağıdaki suşları sporlar kullanılır: B. subtilis PY79 (yabani türü) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (eksik DNA onarım protein RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: (RecA erimiş sarı ile kedi Floresan protein [YFP]19).
- Sporlar tarafından 3000 x g 50 mL tüpler de 15 dakika aralıklarla hasat ve tekrarlanan çamaşır numaralı adımları (15 kere) steril distile H2O ve onay için saflık ve çimlenme durumu faz kontrast mikroskobu tarafından kullanarak örnekleri arındırmak. Spor süspansiyonlar faz parlak sporlar (> %99) dışında oluşur ve aksi takdirde daha fazla mikroskobu deneyler rahatsız bitkisel hücreleri (çubuklar), germinated sporlar (siyah / gri görünüş) ve hücre artıkları, ücretsiz emin olun. İstenen saflık ulaşılana kadar örnek yıkayın.
- Spore titresi kaplama LB-agar üzerinde 10 kat seri dilutions 50 µL dışarı tarafından belirli (yani: kullanım 30 µL örnek + 270 µL steril su 1:10 seyreltme. 30 belirli seyreltme için 270 µL H2O 1: 100 seyreltme için µL ve benzeri take) CFU (birimleri oluşturan colony) hesaplamak ve 37 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya için. Sonra CFU belirlenmesi, konsantre veya steril su ile sulandrarak örnek mL başına 109 sporlar için ayarlayın.
2. örnek Bacillus subtilis Aerosol yatırılır sporlar hazırlanması
Not: Birikimi ve sporlar örtüşen etkileri tedavi sırasında gölgeleme için sonuçta sahte inactivation Kinetik kaynaklanan neden olabilir. Bu sorunu en aza indirmek için bir aerosol ifade tekniği20tarafından spor örnekleri hazır olun. Kısaca, denetim yüksek hassasiyetli iki madde başlığı ile sıvı üretilen iş akışını ile konser düzenleyen bir elektrik zaman taşıyıcı gaz (burada N2) basınç altında. Azot gaz akışı kullanarak meme çıkış yoluyla enjekte sıvı örnek dağıtmak.
- Steril mikroskobik slaytlarını (hayatta kalma Kinetik) şeklinde bir örnek taşıyıcı yerleştirin veya 25 mm coverslips yuvarlak (DNA onarım floresan takibi için süreçleri/cLSM; confocal lazer mikroskobu tarama) elektrikle çalışan aerosol püskürtme birimi içinde meme ile uyum içinde. Karşılık gelen kullanılan spor konsantrasyon ihtiyacı bir artmadan istenen son konsantrasyon.
- 1 mL spor kültürünün meme sıvı koya aktarmak ve 0,1 püskürtme işlemini başlatmak 1.3 bar basınçta s. Toz boya spor süspansiyon (1 x 107) hızla kurur birörnek dağıtılmış spore monolayer oluşturmak için saniye içinde mikroskobik slayt üzerinde ince bir film oluşturur. Tedavi örnek taşıyıcıları steril bir kap oda sıcaklığında saklayın.
3. düşük basınç plazma tedavisi
- Biyolojik örnekler tedavisinde plazma sistemi hazırlamak ve 5'te sisteminin çalışması Pa argon plazma 500 W 5 min için ile. Bu, sistemdeki tüm yüzeyler temizlenir ve coşkuyu. Bu sistem havalandırma sırasında ortam havası, yani azot, oksijen ve su moleküllerinin yapışmasını azaltır. Önarıtma sistemin sonra odası delik ve örnekleri dikkatle cam raflar yardımıyla reaktör gemisi merkezinde yer.
- En az üç biyolojik çoğaltır kullanın. Odayı kapatın ve 2 tahliye baba. daha sonra odanın içine süreç gaz doldurun. 5 sistemindeki basınç düzenleyen baba.
- Tanımlanmış işlem süresi sonra güç ve gaz kaynağını ve dikkatle örnekleri örnek sahibinden üfleme önlemek için sistem delik. Havalandırma sonra örnekleri çıkarın ve sonraki parametrenin örnekleri sistemdeki yerleştirin. Plazma tedavi denetimleri örnekleri yalnızca vakum kullanır için (5 Pa) işlemi gaz uygulamalı plazma en uzun zaman eşdeğer huzurunda.
4. kurtarma ve Spore hayatta kalma değerlendirilmesi
- Autoclaved % 10 polivinil asetat (PVA) çözeltisi hazırlamak ve örnek taşıyıcısının dikkatle yaklaşık 500 µL kapak ve onlara izin air-dry 4 h şerit için (şimdi spor örnek içeren) kurutulmuş PVA katman steril forseps kullanarak ve 2 mL için transfer tepki tüp. 1 mL steril su tüp ekleyin ve PVA katman vortexing üzerinden geçiyoruz. Bu yordamı yol açar > % 95'i kurtarma sporlar ve onların çimlenme yeteneğini21etkilemez.
- Seri olarak örnek 1:10 bir 96-şey plaka (yani 270 µL steril H2O + 30 µL örnek/eski seyreltme) steril su oranında seyreltin. Her seyreltme Lysogeny suyu besin agar (LB) üzerinde 50 µL dışarı plaka, plaka 37 ° C'de gecede kuluçkaya ve yetişkin koloniler (CFU) sayısı numaralandırılamıyor.
5. cep mikroskobu ve sporlar takımıdır içinde DNA onarım işlemleri izleme canlı
- 700 µL orta ve damlalıklı kaynatılarak 1 mm kalın bir % 1.5 LB-agar yastık, çimlenme deneyler için hazırlamak steril mikroskobu petri kabına içine. 10 dakika sonra bir 8 x 8 mm x 1 mm LB-agar yastık steril neşter ile kesip ve agar 25 mm cam coverslips üzerinde dinlenme dikkatle spor monolayers üzerine aktarın.
Not: Bu adım bireysel sporlar görselleştirme için çok önemlidir ve onların tepki, çimlenme aktivasyonu doğru takip besin agar tarafından indüklenen izin. Böylece, LB-agar (1) relocalization yüzey boyunca ve optik odak dışı önler, yüzeyde sporlar düzeltmek için ve (2) Spor çimlenmesi için etkinleştirmek için iki amaca hizmet eder. - Örnek agar ile kapsayan sonra cam coverslip hızlı bir şekilde bir görüntüleme odası ve mikroskop bir otomatik confocal mikroskop lazer tarama ile örnekleri ile ters optik bir 63 X kullanarak transfer / 1.3 uçak apochromatic yağı daldırma amaç.
-
Görüntüleme gerçekleştirmek, floresan (YFP) bir uyarma ile dalga boyu 514 nm ve emisyon 520 ve 560 nm arasında tespit edilebilir.
- Tarama modunda fotoğraf çarpanları (iletilen ışık yolunu) birini kullanarak kayıt alan parlak görüntüler.
- Kayıt bir lazer gücü % 2.6 ile hızlandırılmış serisi ve 5 havadar birimleri ve 30 başına 1 kare Örnek sıklığı confocal diyafram ayarlamak için deneme bağlı olarak 5 h 0 h s. Banknot yüksek dozlarda tek renkli aydınlatma 514, lazer 's nm tamamen inhibe çimlenme (şekil 1A, B).
- Örnekleri 37 ° C'de (ortam havası nem) tüm görüntüleme işlemi sırasında bir Isıtma aşamasında tutmak. En az üç biyolojik çoğaltır her koşul için kullanın. Spore toplama, çok katmanlı spore dağıtım veya toz parçacıkları tarafından kirlenme durumunda plazma tedavisi ("gölgeleme") engelleme meydana ve çimlenme gölgeli sporlar (şekil 1C, D) etkinleştirin.
Şekil 1: olası sorunları tedavi plazma sporlar confocal canlı hücre Floresans mikroskobu sırasında gözlenen. (A, B) Spor çimlenmesi tek renkli, yüksek dozlarda tarafından inhibisyonu (514 nm) lazer aydınlatma. (A) genel bakış (3 x 3 dikişli kare) B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) 180 dk çimlenme inisiyasyon sonra sporlar. (= Kare) çevre bölgelerde değil aydınlatılmış ise orta çerçeve için lazer ışık (514 nm, % 70 lazer güç), yüksek dozda 30 s aralıklarla çıkmıştır (Birleştirilen görüntüyü alan parlak kanal ve RecA-YFP floresan; yapıları vardı emretti 35 mm bir baskılı 500 µm Izgara yemekleri Imaging kullanımından kaynaklanan). (B) gösterir bir 4 X büyütülmüş görünümü arasında ise tek renkli lazer aydınlatma yüksek dozda maruz kaldılar sporlar, değil çimlenme yaptım ve dışarı, büyümek gösterilen ışıklı ve sigara ışıklı bölge kenarlığının sporlar Sigara ışıklı bölgeler tamamen parlak RecA-YFP floresan (yeşil sinyal) ifade bitkisel bakteri kurtarabilirsiniz. (C, D) Sporlar parçacıklar kirletici tarafından kapsanan veya spor (oklar) çoklu katmanlar temel sporlar inactivation plazma tedavi ile korumak ve onların çimlenme ve çıkıntı "(gölgeleme etkisi") izin görünüyor. (C) sporlar başlatma çimlenme veya (D) sonra plazma 60 s ve görüntülü 180 dk nedeniyle tedavi için 120 s ve 240 dk. sonra yansıma Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
6. tarama elektron mikroskobu (SEM)
- Tarama elektron mikroskobu tedavi plazma sporlar ile karşılaştırıldığında tedavi edilmezse denetimleri yüzey morfolojisi hakkında ultrastructural bilgi sağlamak için kullanın. Kurutulmuş spor monolayers coverslips altın-Paladyum üzerinde ceket (3 nm) sputter coater kullanarak. Bir alan emisyon Taramalı elektron mikroskobu topografya kontrast ortaya çıkarmak için bir lens ikincil elektron dedektörü de dahil olmak üzere 5 kV ivme gerilim işletilen örnekleri, görüntüleme için kullanın.
7. veri analizi
- Burada N ortalama CFU tedavi örnekleri, N0 ortalama işlenmemiş vakum denetimlerin CFU spore survival bölüm N/N0, üzerinden belirlemek. Spore inactivation argon plazma tedavisinde süre (saniye olarak) bir fonksiyonu olarak tarafından arsa. Ortalama ve standart sapmalar tüm verileri ifade (n = 3).
- Görüntüleme yazılımı kullanarak canlı hücre görüntüleme tarafından elde edilen görüntüleri analiz. Spore çimlenme oranı ölçmek ve plazma tedaviden sonra büyümüş, sporlar başında deneme yanı sıra 4 h sonra temsilcisi kare say. Spore hayatta kalma deneyleri önemi tayini için tek yönlü ANOVA testleri (Varyans analizi) ile istatistiksel yazılım kullanın). P değerleri < 0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plazma tedavi B. subtilis yaşama sporlar
B. subtilis sporlar tedavisinde plazma plazma tedavi (Şekil 2) süresi artan ile hayatta kalma bir düşüş Bu çalışma göstermek kullanılır. Sporlar recAifade baskı-gen YFP için erimiş hayatta kalma eğrileri benzer sporlar genetik değişiklik bakteriyel canlılık üzerinde önemli bir etkisi olduğunu belirten vahşi türü baskı gösterdi. Sporlar RecA eksikliği baskı RecA gen varlığı canlılık plazma kaynaklı kaybı azaltarak gösteren vahşi türü gerginliği, sporlar için karşılaştırıldığında plazma tedavi karşı daha yüksek bir hassasiyet sergilemek. Özellikle 15 tedavisinde plazma kısa s (P <0,003) ve 30 s (P < 0,004) RecA eksikliği suşları ile karşılaştırıldığında vahşi türü ve RecA-YFP suşları canlılık, önemli bir düşüş neden. Sonra 90 s plazma tedavi, tüm suşlarının canlılık yaklaşık üç büyüklük azalır.
Resim 2: B. subtilis yaşama alçak basınç argon plazma ile tedaviden sonra farklı suşları sporlar. Hayatta kalma (tedavi plazma sporlar/ortalama vakum tedavi sporlar CFU ortalama CFU; standart sapma gösteren hata çubukları) plazma tedavi süresi karşı çizilir. PY79 (yabani türü; kapalı daireler), LAS72 (RecA-YFP; gri daireler) ve LAS24 (ΔrecA; açık daireler). İstatistiksel analiz spore Beka PY79 arasında hiçbir önemli farklılıklar gösterdi (değiştirilmemiş RecA) ve LAS72 (RecA-YFP-füzyon).
Plazma tedavi sporlar SEM tarafından ultrastructural analizi
Plazma morfolojik etkisi hakkında bir fikir edinmek için elektron mikroskobu (SEM) tarama sporlar, tedavi tedavi plazma sporlar ile karşılaştırıldığında vakum tedavi sporlar (kontrol) yüzey morfolojisi analiz etmek için kullanıldı. B. subtilis sporlar dış yüzeyine sürekli tüm tedavi ve tedavi edilmezse sporlar içinde (şekil 3) görülebilir karakteristik uzunlamasına ridge benzeri yapıları ortaya koyuyor. Plazma tedavisi 30 s spor yüzey morfolojisi denetim (şekil 3A-C) ile karşılaştırıldığında hiçbir önemli değişiklik neden olmaktadır. Plazma tedavi (60-240 s) süresi artan bir daha ayrıntılı spore yüzey (şekil 3D-F) ve küçük çatlaklar yol açar ve çatlaklar için 120 veya 240 s tedavi sporlar görülebilmektedir. Ayrıca, küçük globüller spore yüzeylerinde ortaya (120 s ve 240 s tedavileri, şekil 3E, F), hangi mantoyu yayımlanan malzeme tarafından neden olduğu korteks veya22iç çekirdek. Bu globüller bütün spor kapak ve damar şeklinde yapıları üzerinde yanı sıra ara yüzeylerde bulunabilir.
Şekil 3: B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporlar SEM püskürtülür cam coverslips üzerinde alçak basınç plazma tedaviden sonra. Sporlar yalnızca vakum maruz ve değil plazma (kontrol) gösterildiği (A). (B-F) Plazma süresi artan ile tedavi edilen sporlar (15, 30, 60, 120 ve 240 s). 60 plazma tedavi edildi sporlar s ya da artık bu onların yüzeyde daha ayrıntılı denetim sporlar veya plazma-15 ve 30 s. çatlaklar ve çatlaklar (beyaz ok) sporlar plazma-120 veya 240 s. için tedavi yüzeyi görünür için tedavi edildi sporlar daha görünür Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Canlı cep mikroskobu plazma tedavi B. subtilis , sporlar
B. subtilis suşları Floresans etiketli onarım protein RecA (RecA-YFP) ifade gelen sporlar canlandırma canlı cep mikroskobu çimlenme kapasite ve RecA-YFP içinde bireysel sporlar, ifade amacıyla gerçekleştirilen Plazma tedaviye yanıt. Confocal lazer tarama mikroskobu zaman çözüldü bitkisel devlet plazma tedavi sporlar (şekil 4) örneğin gölgeleme etkileri potansiyel olarak bilinen sorunlar ile ilgili olarak çimlenme, çıkıntı ve ilerleme takip etmek burada, kullandığımız veya çimlenme tek renkli lazer aydınlatma (şekil 1) yüksek dozda tarafından inhibisyonu. Vakum tek (kontrol için şekil 4A-C), maruz sporlar spor canlanma (0 - 65 dk gösterilmez) erken Birleşik sırasında kaç floresan sinyallerini sergi. Floresan yoğunluğu, en büyük olasılıkla RecA-YFP, birikimi nedeniyle bir artış ≥ 65 dk bitkisel hücre oluşur ve ilk hücreleri bölmek başlatmak görülmektedir. Bu hücrelerin tümünü her hücre içinde en az bir konumda birikmiş bir floresan sinyal liman. Hemen hemen tüm sporlar (% 98 ± 2; 589 ± 14, n = 4) bir denetim çimlenme ve tek tek hücreler (şekil 4B-C) oldukça Tekdüzen uzunluğu olan bir çubuk şeklinde hücre morfolojisi geliştirmek olarak vakum ile kabul edilir. Vakum denetimlerde sporlar aksine, sporlar için 15 tedavi s plazma ile zaten göstermek düşük çimlenme kapasitesi ise 75 ± % 4 (197 ± 8 sporlar, n = 3, şekil 4D-F), plazma tedavi uyuyan sporlar, zarar görmesine neden olmaktadır gösteren hangi çimlenme engeller. Ayrıca, hücreleri büyümüş morfolojisi denetimleri hücre morfolojisi farklıdır. Hücreleri de yoğun uzun çubuklar (denetimine karşılaştırıldığında daha uzun) içine büyümek veya küçük kalır ve sopa spor ceket (şekil 4G-Ben). Ayrıca, hücre boyutunu (beyaz ok uçları, şekil 4F) artan ile en uzun hücreleri parçalayıcı. RecA-YFP floresan sinyallerini hücrelerindeki kontrol hücreleri (şekil 4C, F) sinyalleri ile karşılaştırıldığında biraz arttı gibi görünüyor ama hiçbir önemli farklılıklar (değil gösterilir) görülebilir. Plazmaydı sporlar tedavi için 30 s çimlenme 25 ± % 6 (99 ± 4 spor, n = 3) ve bitkisel hücrelerin özellikle 15 sonra Denetim sporlar ve sporlar ile karşılaştırıldığında büyüme gecikmeli plazma-tedavi s. Bitkisel hücreleri oldukça küçük ve çubuk şeklinde ama uzunluğu değişir (şekil 4G-Ben). Ancak, hücre her boyuttaki örnekleri için 15 sonra görülen uzun kuluçka süreleri sırasında koşullar s plazma-tedavi. 60 sonra plazma-tedavi az 2 ± %2 s (8 ± 8 sporlar, n = 3) sporlar bitkisel hücreleri (şekil 4J-L) oluşturmak edebiliyoruz. 90 için plazma kabul edilir sporlar, 120 veya 240 s analiz ama RecA-YFP (gösterilmez) floresan düzeylerinde hiçbir çıkıntı veya herhangi bir değişiklik gösterirler.
Resim 4: Confocal lazer tarama canlı cep mikroskobu B. subtilis sporlar, RecA-YFP plazma tedavi ve çimlenme inisiyasyon sonra ifade bir zorlanma. Sporlar zaman içinde takip (30 başına bir görüntü s) ve görüntüler zaman-puan 0, 2 ve 4 h için gösterilir. (A-C) Sporlar yalnızca vakum ile tedavi ve değil plazma (kontrol) ile çimlenme ve bitkisel hücrelere (B) büyümek ve üstel büyüme aşaması (C) girin. (D-L) Alçak basınç argon plazma ile farklı süre için tedavi sporlar göstermek onların yapılan sporlar denetimin göre önemli farklılıklar (metin Ayrıntılar için bakınız). (D-F) 15 s tedavi (beyaz ok uçları temsil son zamanlarda lysed bitkisel hücreleri), (G-Ben) 30 (siyah ok uçları küçük bitkisel hücrelerin görselleştirmek ve sopa spor ceket) s tedavi ve (J-L) 60 s tedavi 0 h, 2 h ve 4 h spor sonrası toparlanma süresini. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Düşük sıcaklık kullanarak yüzeyler sterilizasyon, alçak basınç plazma alternatifi bir umut verici iyonize radyasyon, kimyasallar ile tedavi gibi oldukça konvansiyonel sterilizasyon yordamlarına (örneğin gazlar tarihlerde H2O2 veya etilen oksit) veya kuru ve nemli ısı23. Sıradan sterilizasyon yöntemleri çoğunlukla etkili bir sterilizasyon sağlar, ancak onlar işleci için potansiyel bir riski ve tedavi malzeme etkisi bilinmektedir. Alçak basınç plazma UV fotonlar, serbest elektronlar, iyonlar gibi çeşitli bileşenleri bileşimi kullanarak hızlı ve homojen bir biyolojik inactivation Teklifler ve Atom veya moleküller (örneğin ROS) çıkıldı. Bu nedenle, LPP implantlar, elektronik aletleri veya karmaşık 3D-yapılar için termoplastik polimerler gibi ısı ve korozyona karşı hassas malzemelere uygulanabilir. Bugünkü gazetede böyle bir test sistemi uygulama göstermek,20 püskürtülür B. subtilis hangi monolayers sporlar son zamanlarda ayrıntı7' de açıklanan bir belirli alçak basınç plazma reaktörü ele alınır. Plazma tedavi sporlar mikroskobik alan parlak incelenmesi sterilizasyon verimlilik genel bir tahmin almak için yeterli olabilir. Ancak, biz düşük basınç plazma temel mekanizmaları ve moleküler düzeyde spor inactivation üzerindeki etkisi hedefleme ilgilendi. Bulabilsem izleme mikroskobu ile birlikte bu belirli moleküler yanıt olarak plazma tedavi sporlar ayrıntılarını ışık ve potansiyel olarak bize düşük basınç plazma temel inactivation mekanizmasının içine anlayışlar verebilir bize sağlar.
Burada, plazma-tedavi verimliliği ve etkileri analizi bireysel sporlar çimlenme inisiyasyon sonra takip sağlar canlı cep mikroskobu kullanarak ele. Dikkat çekici, belirli bu yaklaşım birkaç cep numarası veya CFU belirlenmesi kullanarak tüm spor nüfusun yeniden canlandırılması ölçerek sağlanan cant yeni sonuçlar ortaya koymaktadır. İlk olarak, plazma-sporlar tedavisinde sadece sonucu kapasitesi doz bağımlı bir şekilde hayatta kalma ölçüm tarafından CFUs belirlenmesi, aynı zamanda sık sık büyük çubuklar yapamaz geliştirmek bitkisel hücre morfolojisi beklendiği gibi etkiler form septa göre uygun hücre bölünmesi ile birlikte küçük hücreler içinde spor yapışmasını için (15 s plazma-tedavi) veya hücreleri, sınırlı bir süre (30 s plazma-tedavi). Gözlemler azaltılmış uzunluğu içeren hücrelerin yok kurtarma normal hücre uzunluğu için daha sonra zaman noktalarda gösterdi. Ayrıca, hücre morfolojik değişmiş hücrelerin çoğu gözlem daha sonraki aşamalarında koşullar ortaya Imaging yaşıyorum. Bu sporlar tarafından plazma-tedavi sırasında edinilen hasar sadece spor yeniden canlandırılması, DNA hasar nedeniyle muhtemelen daha sonraki aşamalarında etkili olduğunu ve çimlenme ve akıbet için kullanılan makine plazma sterilizasyon doğru daha sağlam olduğunu anlamına gelir Bitkisel büyüme için gerekli makine. Dikkat çekici, DNA tamiri RecA protein ifade sporlar içinde düşük ve neredeyse yok gibi görünüyor ve akıbet ve bitkisel faz sırasında RecA-YFP Floresan17artış tarafından belirtildiği şekilde geliştirir. Ancak, hatta bir biraz artan RecA ifade büyümüş plazma tedavi sporlar, denetim sporlar, ile karşılaştırıldığında en hücreleri parçalayıcı veya çıkıntı sonra özellikle birden fazla 3 h sonra patlama çünkü hücre canlılık nicelik, kurtarmak için yardımcı olmuyor Kuluçka dönemiydi. Bu etkiyi canlı hücre film--dan germinated sporlar zaman atlamalı görüntüleri kullanarak görüntülenmeyecektir. Biz bu etkiyi hücreleri agar ince bir kaplama kullanarak bir monolayer nerede kalıyorlar belirli yetiştirme koşul tarafından overemphasized dışlayamazsınız.
Başka bir canlı cep mikroskobu göre analiz sonucu partikül contaminations (örneğin toz parçacıkları, diğer sporlar) Spor monolayer yüzeyi plazma zararlı etkilerinden temel sporlar kalkan olur. Bu gibi durumlarda daha da uzun süre plazma-tedavi verimsiz görünmektedir. Böyle contaminations tamamen önlemek için zor olduğundan, alternatif plazma-tedavi stratejileri, tedavinin uzun süre birlikte gezegen döndürme plazma tedavisi sırasında kullanılması gibi test edilmelidir. SEM göre analiz spor ceket plazma-tedavi madde22,24üzerinde etkileri plazma-aracılı teorisi doğrultusunda olan artan süresi ile delikli gösterir. Uzun süreli pozlama süresi (> 240 s) plazma için hatta bulaşıcı parçacıklar ekleyip ve böylece zarar ve temel sporlar devre dışı bırakabilirsiniz.
Canlı cep mikroskobu spor çimlenmesi ve akıbet için sunulan Protokolü diğer çalışmalar için de uygun olabilir. Sporlar agar ince bir tabaka ile kapsayan ayrı bir optik düzlemde sporlar zorlar ve yanal hareketi kısıtlar. Her iki etkileri sporlar ve büyümüş hücreler seçili görüntüleme çerçevesi içinde kalmasını garanti. Benzer yaklaşımlar25 daha önce açıklanan ama yöntem daha az esneklik sağlayan neredeyse herhangi bir örnek taşıyıcı (örneğin bir cam slayt, coverslip veya Petri kabına) seçme burada açıklanan sağlamak. Elimizde başka bitkisel bakteri agar-kaplama yöntemi kullanarak canlı cep mikroskobu tarafından çözümlenmesi). Her neyse, dikkatli kontrol deneyleri çünkü biz tek renkli lazer ışık yüksek dozda tamamen spor çimlenmesi inhibe gözlenen canlı hücre görüntüleme sırasında fotoğraf hasar olası etkilerini değerlendirmek için yapılmalıdır. Aydınlatma saat gözlem aralıkları, artırarak Yani kısalma dışında bu olay lazer yoğunluğu azaltmak ve/veya confocal diyafram (pinhole) açılış tarafından engellenebilir.
Özetle, verimliliği plazma-tedavi püskürtülür B. subtilis , modeli eğitim için kullanılan teknikler arasında spor monolayers, canlı cep mikroskobu hücresel olaylar benzersiz anlayışlar spore canlanma sırasında sağlar ve imkanı sunuyor Floresans etiketli proteinler dinamiklerini analiz etmek. Ayrıca, belirli numune hazırlama, Yani sporlar kapsayan agar, ince bir tabaka ile paradigmatik diğer mikroorganizmalar tarafından canlı cep mikroskobu görüntüleme için olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Andrea Schröder bu iş ve Nikea J. Ulrich parçaları video çekimi sırasında yardımını sırasında onun mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Biz de Lyle A. Simmons Bacillus subtilis suşları onun cömert bağış için teşekkür etmek istiyorum: LAS72 ve LAS24. Bu eser yerlerinde hibe tarafından Alman Araştırma Vakfı (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) PA (AW 7/3-1) desteklenen bir durumdu ve DLR-FuW-Projekt ISS hayat, program RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, Mr ve RM) RM (MO 2023/2-1) ve DLR verin. F.M.F. adlı Alman Havacılık ve Uzay Merkezi (DLR) Köln, Almanya, 6 yıl (bir süre içinde Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) tarafından finanse edildi Helmholtz alanı Yaşam Bilimleri Araştırma okul (SpaceLife) bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir Grant No VH-ko-300) ve Havacılık yönetim kurulu ve Havacılık tıp Enstitüsü gibi DLR ek fon aldı. Bu çalışmanın sonuçları Felix M. Fuchs Doktora tez dahil edilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D.
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P.
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P.
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
