Summary

In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

Published: November 14, 2017
doi:

Summary

Die Auswertung der Gewebeentwicklung in Fraktur Kallus während Endochondral Knochenheilung ist wichtig, den Heilungsprozess überwachen. Wir berichten hier, die Verwendung von einer Magnetresonanztomographie (MRT)-kompatibel Fixateur externe für die Maus Femur erlauben MRI scans während Knochenregeneration bei Mäusen.

Abstract

Endochondral Frakturheilung ist ein komplexer Prozess mit der Entwicklung von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus. Die Menge der verschiedenen Gewebe in der Kallus liefert wichtige Informationen über den Fortschritt der Frakturheilung. Verfügbar in Vivo Techniken, längs der Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Frakturheilung Studien mit kleinen Tieren zu überwachen sind digitale Radiographie und µCT-Bildgebung. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Infolgedessen ist es unmöglich, Knorpel aus fibrösem Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) anatomische Strukturen anhand des Wassergehaltes visualisiert und können daher möglicherweise nicht-invasiv Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren. Hier berichten wir über die Verwendung von ein MRI-kompatiblen Fixateur externe für die Maus Femur, MRI-Scans während Knochenregeneration bei Mäusen zu ermöglichen. Die Experimente zeigten, dass der Fixateur und eine maßgeschneiderte Montagevorrichtung repetitive MRT-Untersuchungen erlauben damit Längsschnittanalyse von Fraktur-Kallus Gewebeentwicklung.

Introduction

Sekundäre Frakturheilung ist die häufigste Form der Knochenheilung. Es ist ein komplexer Prozess imitiert bestimmte Aspekte von ontogenic Endochondral Verknöcherung1,2,3. Die frühen Fraktur Hämatom besteht überwiegend aus Immunzellen, Granulierung und Bindegewebe. Wenig Sauerstoff Spannung und biomechanischen Hochstämme Osteoblasten Differenzierung bei den Frakturspalt behindern, sondern fördern die Differenzierung von Vorläuferzellen in Chondrozyten4,5,6. Diese Zellen beginnen sich zu vermehren sich an der Stelle der Verletzung eine knorpelige Matrix bietet Primärstabilität des gebrochenen Knochens zu bilden. Während der Reifung der Kallus, Chondrozyten, hypertrophe, werden unterziehen Apoptose oder Trans-Osteoblasten differenzieren. Neovaskularisation bei der Knorpel-Knochen-Übergangszone bietet erhöhten Sauerstoffgehalt, die Bildung von Knochengewebe7ermöglicht. Nach knöcherne Überbrückung der Frakturspalt, biomechanische Stabilität erhöht und osteoclastic Umbau der externen Fraktur Kallus auftritt, um physiologische Knochen Kontur und Struktur3zu gewinnen. Daher liefern die Mengen von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus wichtige Informationen über die Knochenheilung Prozess. Gestörte oder verzögerte Heilung wird sichtbar durch Veränderungen der Hornhaut Gewebeentwicklung sowohl bei Menschen und Mäusen8,9,10,11. Verfügbar in Vivo Techniken zur Längsrichtung Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Studien mit kleinen Tieren der Frakturheilung überwachen gehören digitale Radiographie und µCT imaging-12,13. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu MRT bietet ausgezeichneten Weichgewebe Kontrast und kann daher möglicherweise Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren.

Bisherige Arbeit zeigte vielversprechende Ergebnisse für Postmortem MRI bei Mäusen mit14 und in Vivo MRT artikuläre Frakturen bei Mäusen während intramembranous Knochendefekt heilende15. Beide Studien gaben auch begrenzte räumliche Auflösung und Gewebe-Kontrast. Wir zeigten zuvor die Machbarkeit der hochauflösenden in Vivo MRT für längs-Beurteilung der weichen Kallus-Bildung während der murinen Endochondral Frakturheilung16. Hier berichten wir über das Protokoll für die Verwendung eines MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie bei Mäusen um Kallus Gewebeentwicklung längs während der Endochondral Frakturheilung Prozess zu überwachen. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans.

Protocol

alle Tier Experimente internationale Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten und wurden von den regionalen Regulierungsbehörden (Nr. 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland) genehmigt. Alle Mäuse waren gepflegt in Gruppen von zwei bis fünf Tiere pro Käfig auf einem 14 h Licht, 10 h dunkel zirkadianen Rhythmus mit Wasser und Nahrung zur Verfügung gestellt Ad Libitum. 1. Vorbereitung der chirurgisches Material und Vorbehandlung der Mäuse…

Representative Results

Erstens kann der Erfolg des chirurgischen Eingriffs durch Analyse von MRT-Untersuchungen bestätigt werden (siehe Beispiel in Abbildung 2). Alle vier Pins sollte in der Mitte der femoral Welle befinden. Die Größe der Lücke Osteotomie sollte zwischen 0,3-0,5 mm. Wenn die Größe der Osteotomie Lücke stark von diesen Werten variiert, sollte die Maus von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Zweiten…

Discussion

Modifikationen und Fehlerbehebung:

Das Hauptziel dieser Studie war es, ein Protokoll für die Verwendung von einem MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie in der Maus mit der Fähigkeit, Kallus Gewebeentwicklung längs während des Endochondral Frakturheilung Prozesses überwachen zu beschreiben. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans. Halbautom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verena Fischer, Katja Prystaz, Yvonne Hägele und Anne Subgang für ausgezeichneten technischen Support. Wir danken auch der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC1149, INST40/499-1) und der AO Trauma Foundation Deutschland für die Finanzierung dieser Studie.

Materials

Anaesthesia tube FMI, Seeheim, Germany ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine  FMI, Seeheim, Germany ZUA-82-GME-MA
Artery forceps  Aesculap, Tuttlingen, Germany BH104R
Autoclave Systec, Wettenberg, Germany DX-150
Autoclaving packaging Stericlin, Feuchtwangen, Germany 2301-04/06/10/12/16
Avizo software FEI, Burlington, USA Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system Bruker Biospin, Ettlingen, Germany 117/16
Bulldog clamp  Aesculap, Tuttlingen, Germany BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15 Aesculap, Tuttlingen, Germany BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm  RISystem, Davos, Switzerland HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml) Ratiopharm, Ulm, Germany
Dressing forceps 115 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany BD210R
Dressing forceps 130 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany BD025R
Drill bit coated 0.45 mm  RISystem, Davos, Switzerland HS820420
Durogrip needle holder 125 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany BM024R
Foliodrape  Hartmann, Heidenheim, Germany 2513026
Frekaderm Fresenius, Bad Homburg, Germany 4928211
Gigli saw 0.44 mm  RISystem, Davos, Switzerland RIS.590.110.25
Hand drill RISystem, Davos, Switzerland RIS.390.130-01
Heating plate  FMI, Seeheim, Germany IOW-3704
Hygonorm gloves  Hygi, Telgte, Germany 2706
Isoflurane Abbot, London, UK Forene
Micro forceps 155 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany BD343R
Micro scissors 120 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm  RISystem, Davos, Switzerland RIS.611.300-10
Needle case for drills  Aesculap, Tuttlingen, Germany BL911R
Needle holder Aesculap, Tuttlingen, Germany BB078R
Octenisept Schülke, Norderstedt, Germany 121403
Osirix software Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland Version 4.0
Oxygen, medical grade MTI, Ulm, Germany
Resolon 5/0 Resorba, Nürnberg, Germany 88143
Saline 0.9% Braun, Melsungen, Germany 3570350
Scalpel handle 125 mm Aesculap, Tuttlingen, Germany BB073R
Scissors 150 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany BC006R
Sealer for autoclave packaging  Hawo GmbH, Obrigheim, Germany HM500
Sterican 27 G  Braun, Melsungen, Germany 4657705
Sterile surgical blades no. 11/15  Aesculap, Tuttlingen, Germany BB511/515
Surgical gloves  Hartmann, Heidenheim, Germany Peha-micron 9425712
Surgical light  Maquet SA, Ardon, France Blue line 80
Syringes 5 ml  Braun, Melsungen, Germany Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm  Aesculap, Tuttlingen, Germany OC091R
Tramadol 25 mg/l Grünenthal, Aachen, Germany 100mg/ml
Vasofix Safety  Braun, Melsungen, Germany 4268113S-01
Vicryl 5-0  Ethicon, Norderstedt, Germany V30371
Visdisic eye ointment  Bausch & Lomb, Berlin, Germany 3099559

References

  1. Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
  2. Einhorn, T. A. The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop Relat Res. (355), S7-S21 (1998).
  3. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  4. Augat, P., et al. Local tissue properties in bone healing: influence of size and stability of the osteotomy gap. J Orthop Res. 16 (4), 475-481 (1998).
  5. Claes, L. E., Heigele, C. A. Magnitudes of local stress and strain along bony surfaces predict the course and type of fracture healing. J Biomech. 32 (3), 255-266 (1999).
  6. Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. (355), 132-147 (1998).
  7. Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development. 144 (2), 221-234 (2017).
  8. Hankenson, K. D., Zimmerman, G., Marcucio, R. Biological perspectives of delayed fracture healing. Injury. 45, 8-15 (2014).
  9. Meyer, R. A., et al. Age and ovariectomy impair both the normalization of mechanical properties and the accretion of mineral by the fracture callus in rats. J Orthop Res. 19 (3), 428-435 (2001).
  10. Nikolaou, V. S., Efstathopoulos, N., Kontakis, G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 40 (6), 663-668 (2009).
  11. Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse Models in Bone Fracture Healing Research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
  12. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-14 (2013).
  13. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
  14. Zachos, T. A., Bertone, A. L., Wassenaar, P. A., Weisbrode, S. E. Rodent models for the study of articular fracture healing. J Invest Surg. 20 (2), 87-95 (2007).
  15. Taha, M. A., et al. Assessment of the efficacy of MRI for detection of changes in bone morphology in a mouse model of bone injury. J Magn Reson Imaging. 38 (1), 231-237 (2013).
  16. Haffner-Luntzer, M., et al. Evaluation of high-resolution In Vivo MRI for longitudinal analysis of endochondral fracture healing in mice. PLoS One. 12 (3), 0174283 (2017).
  17. Beckmann, N., Falk, R., Zurbrugg, S., Dawson, J., Engelhardt, P. Macrophage infiltration into the rat knee detected by MRI in a model of antigen-induced arthritis. Magn Reson Med. 49 (6), 1047-1055 (2003).
  18. Al Faraj, ., Shaik A, S. u. l. t. a. n. a., Pureza, A., A, M., Alnafea, M., Halwani, R. Preferential macrophage recruitment and polarization in LPS-induced animal model for COPD: noninvasive tracking using MRI. PLoS One. 9 (3), 90829 (2014).
  19. Rolle, A. M., et al. ImmunoPET/MR imaging allows specific detection of Aspergillus fumigatus lung infection in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 1026-1033 (2016).
  20. Niemeyer, M., et al. Non-invasive tracking of human haemopoietic CD34(+) stem cells in vivo in immunodeficient mice by using magnetic resonance imaging. Eur Radiol. 20 (9), 2184-2193 (2010).

Play Video

Cite This Article
Haffner-Luntzer, M., Müller-Graf, F., Matthys, R., Abaei, A., Jonas, R., Gebhard, F., Rasche, V., Ignatius, A. In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur. J. Vis. Exp. (129), e56679, doi:10.3791/56679 (2017).

View Video