Summary
현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.
Abstract
신 부유한 반복 키 2 (LRRK2)에 돌연변이 가족성 파 킨 슨 병 (FPD) 연결 될 표시 되었습니다. LRRK2의 키 니 아 제 활동의 비정상적인 활성화 PD의 병 인에 연루 되어, 이후 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 생리 적인 수준을 평가 하는 방법을 확립 필수적입니다. 최근 연구는 LRRK2 랩 GTPase 가족, Rab10를 포함 하 여 생리 적 조건 하에서 phosphorylates 밝혔다. Immunoblotting에 대 한 현재 사용할 수 있는 인 산화 특정 항 체의 불 쌍 한 감도 때문에 의해 그것을 감지 하기 어려운 되었습니다 LRRK2 경작된 한 세포에 의해 내 생 Rab10의 인 산화는 질량 분석에 의해 검출 될 수, 있지만 Rab10입니다. 여기, 우리는 간단한 설명 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지 방식의 immunoblotting 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 인산 염-바인딩 태그 (태그 P)를 함께 활용 하 여 기반을 N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N',N'-트리 스 (pyridin-2-yl-메 틸)-1, 3-diaminopropan-2-올. 현재 프로토콜 P 태그를 활용 하는 방법의 예제를 제공 뿐만 아니라 또한 어떻게 돌연변이 억제 물 치료/관리 또는 어떤 다른 요인 든 지의 세포와 조직에 LRRK2 하류 신호을 변경의 평가 가능 하 게 .
Introduction
PD 주로 영향을 미치는 dopaminergic 신경은 midbrain에 노인1모터 시스템의 장애에서 발생 하는 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 대부분의 환자는 산발적으로 PD를 개발, 질병을 상속 하는 가족이 있습니다. FPD2연결 될 몇몇 유전자에 돌연변이 발견 되었습니다. FPD에 대 한 원인 유전자 중 하나입니다 LRRK2, 8 개의 missense 돌연변이 (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, 및 I2020T) 라는 PARK8 지배적 상속된 FPD에 연결 보고3,,45를 지금까지 있다. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 산발적 PD 환자 또한 식별 LRRK2 로커 스에서 게놈 변이 위험 요인으로 PD, 제안 LRRK2의 기능에 이상이 모두 산발적 neurodegeneration의 일반적인 원인에 대 한 그리고 PARK8 FPD6,,78.
LRRK2 신 부유한 반복 도메인, 복잡 한 단백질 (ROC) 도메인, ROC (오호) 도메인, 떠들고/트레오닌 단백질 키 니 아 제 도메인 및 WD40 반복 도메인9의 C-터미널의 GTP 바인딩 Ras 구성 된 큰 단백질 (2,527 아미노산) 이다. 8 FPD 돌연변이 찾을 이러한 기능 도메인; N1437H 그리고 R1441C/G/H/S ROC 도메인, 오호 도메인, G2019S 및 I2020T 키 도메인에서 Y1699C. 가정 했다 이후로 PD 환자10,,1112에 돌연변이 발견 가장 자주, G2019S 돌연변이 체 외에서2-3 배13LRRK2의 키 니 아 제 활동 증가, LRRK2 substrate(s)의 인 산화의 비정상적인 증가 신경에 독성입니다. 그러나, 그것은 되었습니다 하지 순수 관련 LRRK2 기판의 인 산화 환자 파생된 샘플에서 평가 하는 방법의 부족으로 인해 가족/산발적 PD 환자에서 변경 여부를 공부 하.
단백질 인 산화는 일반적으로 immunoblotting 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 특히 대량 spectrometric 분석 하거나 단백질의 phosphorylated 상태를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그러나, 전 전략 때로는 적용할 수 없습니다 인 산화 특정 항 체를 만드는 어려움 때문에. 방사성 인산 염 세포의 신진 대사 라벨 인 산화 특정 항 체는 쉽게 사용할 수 때 인 산화의 생리 적 수준 검사 다른 옵션입니다. 그러나, 그것은 많은 양의 방사성 물질을 필요로 하 고 따라서 radioprotection14에 대 한 몇 가지 특수 장비를 포함 한다. 대량 spectrometric 분석은 더 민감한이 토론 방법에 비해 고 단백질 인 산화 분석에서 대중적 되었다. 그러나, 샘플 준비 시간 이다-소모, 그리고 비싼 악기는 분석을 위해 필요 합니다.
직접적인 생리 기판 LRRK2 대규모 phosphoproteomic 분석15의 결과에 따라 Rab10와 Rab8를 포함 하 여 랩 GTPase 가족의 부분 집합 최근에 알려졌다. 우리는 다음 Rab10 인 산화 FPD 돌연변이 마우스16를 쫓 고의 폐와 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 의해 증가 되었다 설명 했다. 이 보고서에서 우리는 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)을 선택-P 태그 분자는 SDS 페이지 젤 (P 태그 SDS 페이지) 검색 Rab10 인 산화의 내 생 수준으로 공동 polymerized 메서드를 기반으로 때문에 phosphorylated Rab10에 대 한 특정 높게 과민 한 항 체는 여전히 부족 했다. 우리는 총 Rab8에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체의 가난한 선택으로 인해 생 Rab8의 인 산화를 감지 하지 못했습니다. 따라서, 우리는 Rab10 인 산화에 집중 하기로 결정 했다. LRRK2는 Thr73 높은 보존 "스위치" II 영역의 중간 위치에서 Rab10를 phosphorylates. Rab 단백질 중 인 산화 위치의 높은 보존 별개 Rab 단백질을 인식 하는 phosphospecific 항 체 확인 하기 어려운 이유 중 하나를 수 있습니다.
LRRK2에 의해 Rab8A의 인 산화 Rabin8, 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF) GTP15바인딩된 GDP를 교환 하 여 Rab8A를 활성화의 바인딩을 억제. Rab10 및 Rab8A LRRK2에 의해의 인 산화는 또한 GDP 분리 억제제 (GDIs),이 Rab 단백질의 활성화에 필수적인 막15에서 GDP 바인딩된 Rab 단백질을 추출 하 여 바인딩을 억제. 그 랩으로 LRRK2 단백질의 인 산화에서에서 그들을 방지 활성화는 정확한 분자 메커니즘 및 생리 적인 결과 인 산화의 불분명 남아 있지만 가정은 했다.
P 태그 SDS 페이지 기노시타 외. 2006 년에 발명 했다:이 방법에서는, 아크릴은 covalently와 결합 하 여 P 태그, 캡처 SDS 페이지에 copolymerized 높은 선호도와 인산 염 분자 젤17. SDS 페이지 젤에서 P 태그 분자는 선택적으로 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체, 때문에 P 태그 SDS 페이지 phosphorylated 아닌 것 들 로부터 phosphorylated 단백질을 분리할 수 있습니다 (그림 1). 관심의 단백질은 여러 잔류물에 phosphorylated, 차동 phosphorylated 모양에 해당 하는 밴드의 사다리 관찰 됩니다. Rab10의 경우 우리는 Rab10 Thr73에만 phosphorylated는 나타내는 하나만 이동된 밴드를 관찰 합니다. 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting P 태그 SDS 페이지의 주요 장점은 phosphorylated Rab10 immunoblotting 비 인 산화 특정 항 체 (즉, 인식 총 Rab10)와 의해 검출 될 수 있다 세포 막에 전송 되 고, 후는 일반적으로 더 민감한, 구체적이 고 사용할 수 있는 상업/학술 소스에서. P 태그 SDS 페이지를 사용 하 여의 또 다른 장점은 이다 그 하나 얻을 수 있다 인 산화를의 산출할의 대략적인 추정 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting 또는 방사성을 가진 세포의 신진 대사 라벨는 불가능 인산 염입니다.
저렴 한 P 태그 아크릴 및 그것에 관련 된 몇 가지 사소한 수정 사용 떨어져 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 검출에 대 한 현재 메서드 immunoblotting의 일반 프로토콜을 다음과 같습니다.따라서, 간단 하 고 쉽게 실행 immunoblotting은 평소 연습, 순화 된 단백질, 세포 lysates 조직 homogenates를 포함 하는 샘플의 어떤 종류와 어떤 실험실에서 이어야 한다.
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Protocol
1. P-태그 SDS-페이지에 대 한 샘플 준비
- 제거 있는 세포는 흡입을 사용 하 여 재배는 10 cm에서에서 미디어를 삭제와 셀 셀 레이어를 방해 하지 않도록 하는 접시의 측면에 처음 추가 DPBS 여 Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 염 (DPBS)을 씻어 하 고 수동으로 다시 요리를 바위 그리고 앞뒤로 여러 번.
- 제거 하 고 DPBS는 흡입을 사용 하 여 삭제 하 고 0.25% (w/v) trypsin DPBS에 희석의 2 개 mL를 추가 셀 레이어 커버에 요리를 부드럽게 바위. 요리는 CO2 배양 기 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO2) 5 분 동안 넣어.
- 분리 된 셀 헤어 일회용 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting 후 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 현미경18에서 hematocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 측정.
- 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 하는 2.5 × 105 셀/ml Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM)와 셀을 희석. 6 잘 플레이트의 각 음에 희석된 셀 서 스 펜 션의 2 개 mL (5 × 105 셀)를 추가 합니다.
- CO2 인큐베이터 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO2)에서 하룻밤 세포 성장.
- Transfection HEK293 세포로
참고: 생 Rab10의 인 산화 하는 경우 검사, 1.7 단계를 진행 합니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 플라스 미드는 요청 시 저자에서 얻어질 수 있다. 간략 한 정보에 대 한 재료의 표 및 그림 s 1 의 DNA 시퀀스를 참조 하십시오.- Aliquot 200 µ L DMEM의 1.5 mL 튜브에.
- 각 튜브를 인코딩 하 Rab10 및 1.066 µ g (5.33 µ g/mL의 최종 농도)는 플라스 미드 인코딩 3 ×의 플래그 LRRK2 500 µ g/mL 플라스 미드 주식에서 플라스 미드의 두 0.266 µ g (1.33 µ g/mL의 최종 농도)를 추가 합니다. 다음 polyethyleneimine (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0에에서 녹아 있는)의 1 mg/mL 해결책의 4 µ L을 추가 하 고 즉시 혼합 솔루션 5 vortexing s.
- 튜브 10 분 동안 실내 온도에 서 서 하 고 잘 사용 하 여는 micropipette dropwise 한 튜브의 내용을 추가 하자. 부드럽게 및 수동으로 바위 문화 접시 앞뒤로 여러 번 잘 걸쳐 균등 하 게 확산 transfection 혼합물 수 있도록.
- 또 다른 24-36 h는 CO2 배양 기 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO2)에 대 한 성장 하는 세포를 하자.
- 내 생 Rab10의 인 산화 하는 경우 검사, 세포를 lysing 전에 셀 1 h LRRK2 억제제 없이 처리 합니다.
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10mm에에서 억제제를 용 해 하 여 LRRK2 억제제의 재고 솔루션을 준비 합니다. MLi-2와 GSK2578215A, 매우 구체적이 고 강력한 LRRK2 억제제를 사용 하는 것이 좋습니다. -80 ° c.에 재고 솔루션 저장
- DMSO와 재고 솔루션을 diluting 하 여 작업 주식은 억제제의 준비: MLi-2 생 및 overexpressed LRRK2 위한 10 µ M 및 30 µ M를 각각 준비. GSK2578215A를 위한 준비 1 밀리미터와 3 밀리미터 생 및 overexpressed LRRK2, 각각.
- 잘 사용 하는 micropipette의 중간 MLi-2 또는 GSK2578215A의 일의 2 µ L을 추가 하 고 부드럽게 잘 걸쳐 균등 하 게 확산 억제제를 접시 수동으로 앞뒤로 여러 번 바위.
- 단계 1.8.3에서에서 억제제를 비슷한 방식으로 부정적인 컨트롤을 다른 영역 DMSO의 2 µ L 추가 합니다.
- 인큐베이터에 다시 접시를 넣고 1 시간에 대 한 셀을 문화.
- 셀 lyse
- 얼음에 배양 배지를 넣어. 제거 하 고 미디어를 삭제. 첫 번째 추가 2 mL 셀을 방해 하지 않도록 하는 접시의 측면에 DPBS 레이어를 수동으로 바위 요리 앞뒤로 여러 번 하 여 세포를 씻어.
- 제거 하 고 삭제는 DPBS 세포의 용 해 버퍼의 셀 100 µ L에 추가 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르, 1mm EGTA (에틸렌 글리콜-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic 산), 1 m m 나트륨 orthovanadate, 50 m m 나트륨 불 화물, 10 m m β-glycerophosphate, 5 mM 나트륨 파이 인산, 0.1 µ g/mL microcystin LR, 270 m m 자당, 프로 테아 제 억제 물 칵테일).
- 얼음에 번호판 기울기와 수집 가능한 lysate 많은 셀을 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 다쳤어요. Lysates (미리 얼음에 냉장) 1.5 mL 튜브에는 micropipette를 사용 하 여 수집 합니다.
주의: Microcystin LR 치명적일 수 있습니다 삼 켜 또는 피부에 접촉 하는 경우.
- 완전 한 세포에 대 일 분 동안 얼음에 서 관을 보자. 원심 분리 (20000 × g, 4 ° C에서 10 분)에 의해 세포 lysates를 명확히 하 고 미리 얼음에 냉장 새로운 1.5 mL 튜브에는 supernatants 전송.
- Bradford 분석 실험에 의해 허가 lysates의 단백질 농도 (µ g / µ L)를 측정 합니다.
- 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 및 1 mg/mL) 증류수와 재고 솔루션을 diluting 하 여. 20-fold에 의해 허가 세포 lysates 희석 된 증류수.
- 3 중에서 96 잘 접시에 lysate BSA 기준, 빈 (증류수), 그리고 각 희석된 셀의 5 µ L/잘 넣어.
- 12 채널 micropipette를 사용 하 여 Bradford 분석 결과 시 약의 150 µ L/잘 추가 하 고 5 분 동안 실내 온도에 서 서 접시를 보자.
- 595에서 흡 광도 측정 플레이트 리더와 BSA 기준 비교에 nm.
- SDS 페이지에 대 한 샘플의 100 µ L를 준비 합니다. 샘플의 단백질 농도 overexpressed HA-Rab10 대 한 µ 1 µ g/L 이며 생 Rab10에 대 한 µ 2 µ g/L.
- 단계의 1.11.4 정량된 농도 사용 하 여 볼륨 (µ L) 100 µ g (overexpressed HA-Rab10)에 해당 하는 세포 lysates의 200 µ g (생 Rab10) 나누어 계산 (100 µ g 또는 200 µ g) 단백질 양 (µ lysates의 단백질 농도 의해 g / µ l)입니다.
- 실 온에서 보관 하는 새로운 1.5 mL 튜브에 4 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼 (62.5 m m Tris HCl, pH 6.8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) 글리세롤, 0.02% (w/v) bromophenol 블루, 4% (v/v) β-mercaptoethanol)의 25 µ L를 추가 합니다.
- 튜브 5 vortexing에 의해 혼합 셀 각 lysates의 계산된 볼륨 추가 실 온에서 s.
- 5 vortexing에 의해 세포의 용 해 버퍼와 혼합 100 µ L을 총 볼륨을가지고 실 온에서 s.
- MnCl2 chelating 에이전트를 풀기 위해 10mm로 보충. 500 mM MnCl2의 1 µ L를 추가 합니다. 5 vortexing에 의해 혼합 실 온에서 s.
참고: 샘플 포함 된 MnCl2 정상적인 SDS 페이지에 적합 한 않을 수 있습니다.
2. 주조 젤 P 태그 SDS-페이지에 대 한
참고: 젤은 젤을 실행 같은 날에 제출 되어야 합니다. 젤은 주변 조명 조건 하에서 할 수 있다.
- 메탄올의 100 µ L로 분말/고체 P 태그 아크릴의 10 mg을 먼저 용 해 하 여 5 mM P 태그 아크릴 재고 솔루션을 준비 하 고 두 배 증류수를 추가 하 여 3.3 mL를가지고.
참고: P 태그 아크릴은 빛에 민감한. 준비 된 솔루션 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에 저장 합니다. - 70% 에탄올을 분사 하 고 종이 타월로 닦아 하 여 깨끗 한 모두 평범 하 고 노치 접시. 젤 접시를 조립 한다. 이 특정 프로토콜에 사용 되는 젤 번호판의 크기는 80 또는 100 m m 폭 100 m m 여 긴. 깨끗 한 실리콘 스페이서 일반 사이 넣고 노치 판과 조립된 판 바인더 클립 고정 됩니다.
참고: 일반적인 SDS-PAGE를 위해 일 하는 젤 격판덮개의 모든 종류를 사용할 수 있습니다. - 빗을 넣어 수 사용 (17-잘 플라스틱 빗) 조립된 젤 접시와 젤 격판덮개 우물의 바닥의 위치에 마크에 영구 표시와 함께.
- 10% 아크릴 아 미드 젤 혼합물의 10 mL를 준비 (10% (w/v) 아크릴 (acrylamide:bis-아크릴 = 29: 1), 375 mM Tris HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) SDS) 15 mL 튜브에.
참고: 최적의 농도의 아크릴 아 미드 사용 시 약에 따라 달라질 수 있습니다. Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 persulfate (AP)는이 시점에서 추가 되어야 합니다. - 추가 5 m m P-태그 아크릴의 100 µ L 1 M MnCl2 솔루션의 10 µ L 50 µ M, 100 µ M의 최종 농도에서 각각.
참고: P 태그 아크릴 및 MnCl2 의 최적 농도 또한 사용 시 약에 따라 달라질 수 있습니다. - 0.15% (v/v)의 최종 농도에 젤 혼합물에 TEMED의 15 µ L 10% (w/v) APS 0.05% (w/v)의 최종 농도에 다음 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 즉시 높이로 즉 2mm 아래 위치 표시 단계 2.3에서에서 조립된 판으로 5 s와 부에 대 한 튜브를 소용돌이로 잘 섞는다.
- 부드럽게 2-프로 판 올 젤을 분리의 상단을 평평 하 게 젤 솔루션에 레이어.
- 젤 상 온에서 30 분 동안 서 보자. 빛 으로부터 젤을 보호 하기 위해 필요는 없습니다.
참고: 그것은 차가운 실내 온도에서 설정 하는 젤에 대 한 더 오래 걸릴 수 있습니다. APS와 TEMED 추가 하기 전에 젤 혼합 기체 제거에이 단계를 가속화 하는 데 도움이 됩니다. 이 위해 젤 혼합물은 흡입에 연결 된 100-200 mL 삼각 플라스 크에 준비 될 수 있습니다. 10 분 솔루션 드 - 종이 수건으로 흡수 하 여 레이어 2-프로 판 올을 제거 합니다.
- 증류수 세척 병에서와 공간을 작성 하 여는 젤의 최고의 공간을 세척 하 고 물에서 분 지에 붓는 의해 무시. 반복 3 회 세척 합니다.
- 잔여 수는 젤의 최고의 공간에 남아 있는 종이 수건으로 흡수 하 여 제거 합니다.
- 3 mL 4% 아크릴 아 미드 젤 혼합물의 준비 (4% (w/v) 아크릴 (a: crylamide:bis-아크릴 = 29: 1), 125 mM Tris HCl (pH 6.8), 0.1% (w/v) SDS) 15 mL 튜브에.
참고: 겹침 젤 혼합물에 P 태그 아크릴 또는 MnCl2 솔루션을 추가 하지 마십시오. - TEMED의 7.5 µ L와 10% (w/v) APS 0.25% (v/v) 및 0.08% (w/v)의 최종 농도 24 µ L를 각각 추가 합니다. 부드럽게 5 s를 분리 젤 위에 혼합물을 부 어 관을 소용돌이 의해 잘 혼합. 바로 적절 한 빗 (예를 들어 샘플의 최대 25 µ L를 수용 하는 17-잘 플라스틱 빗)을 넣어.
- 젤 상 온에서 30 분 동안 서 보자. 빛 으로부터 젤을 보호 하기 위해 필요는 없습니다. 겹쳐 쌓이는 젤 설정 후 추가 스토리지 없이 그들을 실행 합니다.
3. SDS-페이지 및 Immunoblotting
- 젤에서 빗을 제거 합니다. 다음은 젤에서 실리콘 스페이서 그리고 클립을 제거 합니다.
- 젤 탱크에 casted 젤을 넣고 바인더 클립 클램핑 하 여 탱크에 젤을 수정.
- 아래는 젤의 상단에서 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1% (w/v) SDS)를 부 어. 제거 젤을 5 mL 주사기 및 바늘 21 G를 사용 하 여 실행 중인 버퍼 플러시에 의해의 깨끗 한 우물
- 주사기에 부착 된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 젤의 하단 공간에서 공기 방울을 제거 합니다. 구부러진된 바늘을 하려면 수동으로 구부려 21 G 바늘 바늘 중간 그래서는 팁과 바늘의 각도가 30-45 °.
- 명확한 예제를 실 온에서 1 분 동안 20000 × g에서 MnCl2 의 추가 의해 발생 하는 침전 물 아래로 회전 합니다.
- 내 인 성 Rab10에 overexpressed Rab10과 30 µ g 단백질의 인 산화를 탐지 하기 위한 10 µ g 단백질을 로드 합니다.
참고: 그것은 로드 모든 우물에 샘플의 동일한 볼륨에 중요 한입니다. 빈 레인 1 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼와 함께 로드 합니다. 샘플 포함 MnCl2, MnCl2 의 동일한 농도 더미 샘플에 추가. - 잘 분자량 표시 (MWM)와 함께 로드 해야 또한 보완 될 1 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼 로드 샘플의 볼륨은 모든 우물에 동일.
참고: 다시, 샘플 MnCl2를 포함 하는 경우 추가 MnCl2 의 동일한 농도 MWM에. 또한, EDTA 무료 MWM 사용할 수 있습니다. - 염료 전면 분리 젤으로 교차 때까지 (약 30 분) 스태킹에 대 한 50 V에서 젤을 실행 합니다.
- 후 샘플 스택 변경 전압 120 V 분리 염료 전면은 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 (약 50 및 80 분 80, 100 m m에 대 한 긴 젤, 각각).
참고:는 MWM의 마이그레이션 패턴 정상적인 SDS 페이지 젤에 다른 것으로 예상 된다. 그것은 P 태그 SDS 페이지 젤에 단백질의 분자량을 계산 사용할 수 없습니다 하지만 P 태그 젤의 재현성을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 을 참조 하십시오. - 워시는 젤에서 MnCl2 를 제거 하 젤.
- 버퍼 (48 m m Tris, 39mm 글리신, 20% (v/v) 메탄올) 포함 10 mM EDTA와 0.05% (w/v) SDS 컨테이너 (예를 들어, 대형 보트 무게)으로 전송 하 거 라.
참고: 각 세척에 대 한 신선한 버퍼를 사용 합니다.
- 전송 위한 스폰지 패드에 필터 종이 (10 x 7 cm)를 배치 합니다. 필터 종이에 젤을 놓습니다. 필터 종이 젤 사이 아무 기포는 다는 것을 확인 하십시오.
- 막 (10 x 7 cm) 젤에 넣고 젤과 막 사이 공기 거품 없는 있는지 확인 하십시오.
- 다른 필터 종이 (10 x 7 cm)에 막 넣고, 다시, 멤브레인 및 필터 종이 사이 아무 기포는 다는 것을 확인.
- 필터 종이에 또 다른 스폰지 패드를 넣어. 멤브레인/필터 종이의 스택의 전송 위한 카세트에 넣어.
- 막이 젤 하 고 긍정적으로 위탁된 한 양극 사이 전송 탱크에 카세트를 넣어.
- 전원 공급 장치에 탱크를 연결 하 고 얼음 처럼 차가운 물으로 채워진 상자 발포 스 티 렌에에서는 탱크를 넣어. 100 V 180 분에서 시작 합니다.
참고: P 태그 SDS 페이지 젤에서 단백질의 양도 일반 SDS 페이지 젤에서 그만큼 효율적으로 하지 않습니다 이후 장기간된 전송 필요 하다. 효율적인 냉각 전송 중 젤 녹는 피하기 위해 필수적입니다.
- 핀셋을 사용 하 여 젤에서 멤브레인을 제거 하 고 플라스틱 용기에 세포 막에 옮겨진된 단백질 얼룩 Ponceau S 솔루션 (0.1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) 초 산)에 막 담가. 솔루션의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.
- 수동으로 락 하 여 실 온에서 1 분 동안 막 품 어.
참고: 밴드의 사다리 각 레인에 표시 될 것입니다. - 핀셋으로 얼룩 솔루션에서 멤브레인을 선택 하 고 밴드의 사다리에 샘플 로드 어디 모든 레인에 균일 한 패턴 및 강도 있는지.
- 확인 후는 얼룩, 얼룩 솔루션을 제거 하 고 TBST 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate)를 추가 합니다. 버퍼의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.
참고: Ponceau S 솔루션 수 및 여러 번 다시 사용. - 아니 보이는 밴드는 세포 막에 남아 때까지 실 온에서 락 통 (~ 60 rpm)에 TBST에 막 바위.
- 5 분에 대 한 신선한 TBST 가진 세척 단계를 반복 합니다.
참고: 노출 시간 ECL 솔루션 및 화학의 감지에 사용 하는 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.
- 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라를 장착 하는 영상에는 영상에 연결 된 컴퓨터 설정. 영상에 대 한 제어 소프트웨어를 시작 합니다. CCD 카메라의 온도-25 ° c.에 도달 될 때까지 기다립니다
- 벤치에 확산 플라스틱 랩에 한 막 ECL 솔루션의 1 mL를 넣어.
- ECL 솔루션에는 막 젤 사이드-업을 넣고 신속 하 게 뒤집어 그것은 그렇게 막의 양쪽 모두는 솔루션 입힌 다.
- 멤브레인을 선택 하 고 5 종이 타월 막 터치의 한쪽에 놓아 그것을 드레인 s.
- 분명 영화 (예를 들어, 분명 종이 주머니) 사이 막 넣어.
참고: 플라스틱 랩 포장은 막에 대 한 권장 하지 않습니다. 분명 영화는 막 배치를 위해 사용 가능한 고르지 못한 백그라운드를 피하기 위해 눈에 보이는 주름 없이 평면 있이 필요가 있다. - 막 검은 쟁반에 놓습니다. 영상에 트레이 넣어 고 문을 닫습니다.
- 제어 소프트웨어의 창에 "초점" 버튼을 클릭 합니다. 막 올바르게 배치 됩니다 확인 하십시오. "반환" 버튼을 클릭 합니다.
- "노출 유형"에 대 한 "전체"를 선택 합니다. "노출 시간"에 대 한 "수동"을 선택 하 고 노출 시간을 1로 설정 s.
- "감도/해상도"에 대 한 "높음"을 선택 합니다. "디지털화 이미지 추가" 상태로 둡니다. 이미지를 "시작" 버튼을 클릭 합니다.
- TIFF 파일로 컴퓨터에 디스플레이에 나타난 이미지를 저장 합니다.
- 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150에서 노출 시간으로 촬영 이미지를 반복 s 최대 180 s. 마지막 이미지를 찍을 때 디지털 이미지, 막의 화학 하지를 동시에 촬영 수 있습니다 그래서 "디지털화 이미지 추가"를 확인 합니다.
- 관심의 밴드에서 가장 큰 동적 범위와 saturating 픽셀 (빨간색으로 표시) 없이 이미지를 선택 합니다.
참고: 기존의 x 선 필름 또한 탐지19에 대 한 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
Overexpression 시스템: 하-Rab10 3의 인 산화 × 플래그 LRRK2 HEK293에 셀:
HEK293 세포 0.266 µ g의 HA Rab10 야생-타입 및 1.066 µ g 3 × 플래그 LRRK2 (야생-타입, 니 비활성 돌연변이 (K1906M), 또는 FPD 돌연변이)와 페 했다. Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 immunoblotting 안티를 사용 하 여 다음에 의해 시험 되었다-하 항 체 (그림 2). 10 µ g 단백질의 포함 된 50 µ M P 태그 아크릴 100 µ M MnCl210% 젤 (80 x 100 x 1 m m)에 실행 되었다. P-태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출 시간이 10 s 표준 ECL 솔루션을 사용 하 여. LRRK2 Rab10와의 공동 overexpression에 P 태그 젤 밴드 변화 발생 (상단 패널에 열린 원으로 표시, 차선 2와 4를 비교 하 여). 반면, 니 비활성 돌연변이와 공동 식 (K1906M) LRRK2 Rab10의 이동성을 변경 하려면 실패 (비교 레인 4와 5), 밴드 LRRK2 키 니 아 제 활동 때문입니다 나타냅니다. 밴드 shift는 모든 FPD 돌연변이 (레인 4와 6-13 비교) 이전 보고서15계약에 의해 증가 되었다.
LRRK2 경작된 한 세포에 의해 Rab10의 인 산화 내 생 시스템::
마우스 스위스 3T3 흰둥이 배아 섬유 아 세포 세포 또는 1 h (그림 3A)에 대 한 1 µ M의 최종 농도에 LRRK2 억제제 (GSK2578215A)20 없이 치료 했다. 인간의 폐 암 A549 세포 치료와 함께 또는 없이 10의 최종 농도에 다른 LRRK2 억제제 (MLi-2)21 1 h (그림 3B) nM. 내 생 LRRK2 여 생 Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 뒤에 안티-Rab10 항 체와 immunoblotting에 의해 시험 되었다. 30 µ g 단백질의 10% 젤 (100 x 100 x 1 m m 알 비 노 스위스 3T3 세포)와 80 m m A549 세포 포함 50 µ M P 태그 아크릴 및 100 µ M MnCl2에서 실행 했다. 그림 3A 와 그림 3B 에서 P 태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출을 3 분 되었고 90 s, 각각. 해당 phosphorylated 생 Rab10 하 밴드 변화 관찰 되었다 GSK2578215A 또는 MLi-2 셀의 처리에 따라 사라진는 P 태그 젤 (상단 패널; 비교 레인 1-2 및 3-4에 열린 원으로 표시)에. LRRK2 억제제의 효능 immunoblotting 안티 pSer935 LRRK2 항 체 (아래에서 세 번째 패널), 셀22LRRK2 억제의 잘 설립 된 판독은을 사용 하 여 유효성을 검사 했다.
그림 1입니다. P-태그 SDS-페이지의 도식 묘사. Phosphorylated (빨간색 원)와 비 phosphorylated (파란색 동그라미) 단백질 (예, Rab10)의 혼합물을 실행 하면 젤을 통해 P 태그 아크릴은 공동 polymerized 유일한 phosphorylated 단백질의 이동성 때문에 강한 억제 (화살표를 깨진) P 태그 분자와 phosphorylated 단백질의 상호 작용. Rab10 Rab10는 LRRK2 단일 잔류물 Thr73에에 phosphorylated 됩니다, 이후 두 밴드 실행: 최고 밴드 phosphorylated Rab10 나타내고 하단 밴드 phosphorylated 비 Rab10. 셀 LRRK2 억제제로 치료는, 상위 밴드를 사라지게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. P-태그 오의 대표적인 결과: overexpression 시스템. 상단 패널 표시 안티를 사용 하 여 P-태그 오-하 항 체, phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10으로 표시 됩니다 (○) 열고, 동그라미 (●)를 각각 폐쇄. P-태그 오 점 아래에 표시 된 패널은 안티를 사용 하 여 정상적인 SDS 페이지 젤에 immunoblots-하, 안티, 안티-α-tubulin, 깃발과 안티 GAPDH 항 체. 하 오와 플래그 오 하-Rab10 및 3xFLAG-LRRK2 overexpression를 각각 보장에 대 한 표시 됩니다. Α-tubulin 그리고 GAPDH도 말 동등한 로드를 보장에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. P-태그 오의 대표적인 결과: 내 인 성 시스템. 두 셀 라인, 즉 (A) 알 비 노 스위스 3T3 세포 및 (B) A549 세포, 사용 되었다. 두 인물에서 가기 패널 P 태그 지우고 안티-Rab10 항 체, phosphorylated 및 비 phosphorylated 생 Rab10 오픈 (○)로 표시 되어 및 폐쇄 (●) 원형, 각각을 사용 하 여 보여줍니다. P-태그 오 점 아래 패널 안티 Rab10, 안티 pSer935 LRRK2, 안티-LRRK2, 및 안티-α-tubulin 항 체를 사용 하 여 정상적인 SDS 페이지 젤에 immunoblots 있습니다. Rab10와 LRRK2 샘플, 사이 생 Rab10 고 LRRK2 비슷한 표현을 각각 보장에 대 한 표시 됩니다. PSer935 LRRK2 오 점 보장에 대 한 표시는 그 GSK2578215A (A)와 MLi-2 (B) 예상 대로 작동. Α-tubulin 오 점 동등한 로드를 보장에 대 한 표시 됩니다. 고분자 중량 표시와 함께 겹쳐 P 태그도 말의 이미지는 그림 S4에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S1입니다. 플라스 미드의 DNA 시퀀스. 하 하-Rab10/pcDNA5 FRT와 3 × 플래그-LRRK2/p3 × 플래그-CMV-10의 인코딩 플라스 미드의 DNA 시퀀스. 이 프로토콜에 사용 되는 모든 플라스 미드 요청 시 저자에서 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림의 S2 P-태그 SDS 페이지의 최적화의 예. 그림 3A 에서 사용 되는 샘플의 동일한 집합 P 태그 SDS 페이지를 최적화 하는 데 사용 되었다. 그림에서와 같이 4 개의 다른 조건은 테스트 되었습니다. Phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10에 해당 하는 밴드 견고 하 고 파선 선 사각형을 각각 강조 표시 됩니다.이 실험을 바탕으로, 10% 아크릴, 50 µ M P 태그 아크릴, 100 µ M MnCl2 와 조건 두 젤 중간 찾기 두 밴드의 최고의 분리를 했다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림의 S3 분자량 마커의 마이그레이션 패턴의 비교. 일반 SDS 페이지 젤 (왼쪽된 패널) 또는 P 태그 SDS 페이지 젤 (중간 패널), 분자량 마커 (MWM) 실행 하 고는 젤은 스테인드 Coomassie 얼룩에 의해. 오른쪽 패널에 phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 위치를 표시 하려면 가운데 패널으로 동일한 P 태그 SDS 페이지 젤 그림 2 (4, 5 레인)에서 사용 하는 샘플의 immunoblot을 보여줍니다. 화살촉은 immunoblot의 오른쪽에 P 태그 SDS 페이지 젤에 MWM 중 하나의 위치를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S4입니다. P-태그 SDS 페이지 젤에 분자량 마커의 위치. 그림 3A 와 그림 3B 에 사용 하는 세포 막의 디지털된 이미지 (A)로 표시 되 고(B), 각각. 그림 3 에 표시 된 immunoblots 분자량 마커 (MWM)의 상대 위치를 겹쳐 있다. MWM는 세포 막에 잘 전송 하지 않았다 하지만 그림 S3 에 마커 (화살촉) 희미하게 그러나 지속적으로 관찰 되었다. MWM의 위치는 점선으로 표시 됩니다. 참고는 MWM 및 관심의 차선 사이 숫자에 없는 차선 밖으로 교차. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리 감지 LRRK2 P 태그 방법론에 따라 내 생 수준에 의해 인 산화 Rab10 손쉬운 강력한 방법을 설명 합니다. Phosphorylated Rab10에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체 overexpressed 단백질15만으로 작동을 하기 때문에 P 태그 SDS 페이지를 활용 하 여 현재 메서드 Rab10 인 산화의 내 생 수준을 평가 하는 유일한 방법입니다. 또한, 현재 메서드는 셀에 Rab10 인 산화의 산출할 추정 수 있습니다. P 태그 방법론 인 단백질에 일반적으로 적용할 수 있기 때문에, 현재 프로토콜 "프로토 타입" 다른 인 단백질 유사한 방법 수립에 대 한 수 있습니다.
프로토콜에 중요 한 단계는 주조 젤과 샘플의 준비. P 태그 아크릴 상대적으로 사진 정한 시 약 이며 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체 하는 능력은 4 ° c.에 장기 저장 후 손실 때로는 연구원 P 태그 아크릴 빛에 노출 되지 않도록 모든 주의 해야한다. 또한, P 태그 분자 복합 인산 염을 잡으려고 미네소타2 + 이온을 형성 해야 합니다. 따라서, 샘플에는 상용 SDS 페이지 샘플 버퍼의 일반적인 구성 요소를 같은 EDTA, chelating 에이전트 없어야 합니다. 클래식 Laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 P 태그 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다.
또 다른 중요 한 포인트 아크릴 아 미드, P-태그 아크릴 및 분리 젤 혼합물 (그림 S2)에서 MnCl2 의 농도 철저 하 게 최적화 하는 것입니다. Phosphorylated 및 비 phosphorylated 밴드의 이동 거리는 시 약 사용 (많은, 순 결, 등)에 따라 달라 집니다 그리고 조합에서 여러 다른 농도 테스트 하 여 적절 한 농도의 최적화 필수 (예를 들어, P 태그 아크릴 (25, 50, 75 µ M), MnCl2 (1:2 또는 1:3 어 금 니 비율을 P 태그 아크릴), 그리고 아크릴 (7.5, 10, 12.5%)). Phosphorylated 및 비 phosphorylated 밴드는 젤의 중간에 나타나야 하 고 잘 서로에서 분리. 최적화 과정에 대 한 이동된 밴드는 쉽게 감지 하기 때문에 overexpressed Rab10를 사용 하는 것이 좋습니다. 저자는이 프로토콜에 대 한 제어 샘플을 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜을 일으킬 수 있는 가장 큰 혼란 중 일반 및 P 태그 SDS 페이지 젤은 MWM의 마이그레이션 패턴의 차이 때문에 있을 것입니다. 일반 및 P 태그 SDS 페이지 젤 (모두 10%), MWM의 마이그레이션 패턴은 크게 다른 그림 s 3에서 같이, 그리고 하나의 P 태그 SDS 페이지 젤에 단백질의 분자량을 계산는 MWM를 사용할 수 없습니다. 그러나, P 태그 SDS 페이지 젤에는 MWM 중 서 젤 ( 그림 S3에 화살촉), 젤 (참조 그림 S4) 중 일관 되 게 관찰 되는 중간에 여. 항상이 MWM phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 밴드 사이 마이그레이션합니다. 따라서,이 마커는 P 태그 SDS 페이지 랜드마크 phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 밴드 볼 수의 거친 감각을가지고 서 뿐만 아니라 전송 되기 전에 작동을 위해 뿐만 아니라 유용 합니다.
Immunoblots 밴드의 검출, 우리는 냉각된 CCD 카메라를 장착 하는 영상 사용 ( 재료의 표참조) 또한 기존의 x 선으로 개발 시스템, 필름과 두 시스템 잘 작동을 발견. 경작된 한 세포에 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지, 그것은 내 생 LRRK2, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (중 기본 교양 또는 셀 라인 (불후의 명작 등의 높은 식 수치가 셀 라인을 사용 하는 데 필요한 3T3 스위스 알 비 노, 등))과 인간의 폐 암 파생 A549 세포. 마우스 조직 인 산화 Rab10의 생 레벨의 검출, 폐16을 사용 하는 것이 좋습니다.
Rab10 인 산화의 정량 보다 평소 immunoblotting 아니다. Rab10 인 산화의 산출할 ( 그림3에서 참조)로 매우 낮은 경우 비 phosphorylated 밴드 (폐쇄 원형으로 표시)의 강도 경향이 채도 수준의 위까지 산출할의 정확한 결정 불가능 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 질적 추정 아직도 가능 하다 어떤 경우에, 현재 메서드를 사용 하지 않고 얻을 하지 않습니다. 이후 생 Rab10의 인 산화의 검출에는 장기간된 노출 필요 합니다, 거기 경향이 P 태그에 몇 가지 일반적인 밴드 오도 불구 하 고이 프로토콜에 사용 되는 안티-Rab10 항 체는 정상적인 사용에 대 한 상당히 깨끗 한 immunoblots 제공 . 일반적인 밴드에 phosphorylated 단백질 구별, phosphorylated 밴드, 하지만 하지 일반 밴드, 사라지게 한다는 억제제 치료 컨트롤 사용 하 여 중요 하다. LRRK2 phosphorylates Rab8 Rab1015, 외 고 우리는 성공적으로 적용 현재 프로토콜 Rab8A에 뿐만 아니라 (데이터 표시 되지 않음). 현재 프로토콜 사용 될 검사 어떤 단백질의 인 산화 단백질이 큰 경우 기술적인 문제가 있을 수도 있지만 (> 100 kDa) 또는 곱하기 phosphorylated. Rab10는 작은 단백질 (25 kDa) 때문에 홀로 LRRK2에 의해 Thr73에 phosphorylated, P 태그 SDS 페이지의 결과입니다 간단한 하나의 이동된 밴드 관찰.
가까운 미래에, 그것은 양적 평가로 뿐만 아니라 PD 환자에 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 변화를 평가 하는 높은 처리량 방법에 환자에서 파생 된 샘플의 LRRK2의 키 니 아 제 활동을 감지 하는 방법은 설정에 중요 한 것 효과 약물의 LRRK2에 임상 시험. 이후 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 생 LRRK223, PBMCs의 상대적으로 높은 수준 또는 더 고립 된 혈액 세포 인 산화 Rab10 내 생에 대 한 테스트 가치가 있을 것입니다. 현재 메서드는 뿐만 아니라 신호 전달 경로는 LRRK2의 기본적인 생물학 조사에 도움이 될 하지만 또한 취득 한 기본-의 증거-개념 환자 파생 된 샘플에는 샘플 같은 대규모 연구에서 분석 하는 것입니다 결정에 도움이.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 친절 하 게 제공 하는 인코딩 3xFLAG LRRK2 WT 및 돌연변이 플라스 미드에 대 한 박사 타 케시 Iwatsubo (동경, 일본) 감사 합니다. 우리는 또한 친절 하 게 제공 MLi-2와 HA Rab10 인코딩 플라스 미드에 대 한 박사 다리오 Alessi (던 디 대학, 영국) 감사 합니다. 이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 JP17K08265 (병사는)에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
