Summary
נוגדן מבוססי תרופות מהפכה לטיפול במחלות דלקתיות. בנוסף יש השפעה ישירה על מטרות מוגדרות, נוגדנים ניתן להפעיל מקרופאגים להיות אנטי דלקתיות. פרוטוקול זה מתאר איך אנטי דלקתיות מקרופאג ההפעלה יכולה להיות המוערך במבחנה, באמצעות העכבר מח עצם, מאקרופאגים ויוו, באמצעות מקרופאגים הצפק.
Abstract
המקרופאגים הם phagocytic תאים חיסוניים מולדת, אשר ליזום תגובות חיסוניות פתוגנים ולתרום פיצוי ריפוי ורקמות. מקרופאגים חשובים באותה מידה ביטול תגובות דלקתיות. הראינו כי מקרופאגים מגורה עם עירוי אימונוגלובולינים (IVIg) ניתן לייצר כמויות גבוהות של ציטוקין דלקתי, אינטרלויקין 10 (IL-10), רמות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים בתגובה lipopolysaccharides חיידקי ( LPS). IVIg היא שנוגדנים ערכיות, בעיקר בנוגדנים Gs (IgGs), איחדו בין הפלזמה של יותר מ-1,000 תורמים דם. הוא משמש כדי להשלים נוגדנים אצל חולים עם ליקויים החיסונית או לדכא את תגובות מערכת החיסון אצל חולים עם תנאים אוטואימוניות או דלקתיות. רמיקייד, נוגדן אלפא (TNFα) גורם טיפולי אנטי הגידול נמק, גם הוכח להפעלת מקרופאגים לייצר IL-10 בתגובה לגירויים דלקתיות. IVIg, תכשירים אחרים נוגדן מבוססי יכול להיבדק כדי לקבוע והשפעותיהם על מקרופאג ההפעלה. מאמר זה מתאר שיטות נגזרת, גירוי של הערכה של מקרופאגים מח עצם מאתר מופעל ע י נוגדנים במבחנה ומקרופגים הצפק מאתר מופעל עם נוגדנים בתוך vivo. לבסוף, נדגים את השימוש סופג המערבי כדי לקבוע את התרומה של תא מסוים מסלולי לפעילות אנטי דלקתיות מקרופאג איתות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש עם עכברים מהונדסים, כדי לקבוע את ההשפעה של protein(s) ספציפי על הפעלת מקרופאג אנטי דלקתיות. טכניקות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך אם תכשירים ספציפיים רשאית לפעול על-ידי שינוי מקרופאגים למצב IL-10-הפקת הפעלה אנטי דלקתי אשר מפחית את תגובות דלקתיות בתוך vivo. זה יכול לספק מידע על עצמו את התפקיד של הפעלת מקרופאג ביעילותם של תכשירים במהלך המחלה במודלים עכברים, ומספקים תובנה מנגנון חדש פוטנציאלי פעולה אצל אנשים. לעומת זאת, זה ייתכן מתריעים מפני השימוש ביולוגיים מבוססי נוגדן ספציפי לטיפול במחלות זיהומיות, במיוחד אם מקרופאגים לשחק תפקיד חשוב בהגנה מארח נגד הזיהום הזה.
Introduction
המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת, אשר ממלאים תפקידים מרובים בהתגובה החיסונית זיהום או פגיעה. מקרופאגים אחראים ייזום תגובה חיסונית זיהום או רקמת נזק, לעצור את התגובה דלקתית, וקידום של תגובת ריפוי1. דוגמאות של ההפעלה הטובה ביותר למד מקרופאג שלושת המצבים הם: 1) מקרופאגים שטופלו באינטרפרון גמא (IFNγ) ואת ליפופוליסכריד חיידקי (LPS), המיועד מ' (IFNγ + LPS), אשר תורמים התגובה דלקתית; 2) מקרופאגים מגורה עם אינטרלוקין 4 (IL-4), M(IL-4), בהם יש קשר עם תגובת ריפוי; 3) מקרופאגים מגורה עם מכלולי המערכת החיסונית (IC) ו LPS, מ' (IC + LPS), אשר יש את היכולת לבטל את2,של תגובה דלקתית3. M (IC + LPS) נבדל M(IL-4) פצע ריפוי מקרופאגים, שאינם מבטאים את האנזים arginase (Arg-1) או FIZZ14. הסמן הטוב ביותר של מקרופאגים אנטי דלקתיות אלה הוא הייצור שלהם ציטוקין5. מקרופאגים תפקידים מרובים בשמירה על הבריאות, אבל גם לתרום סרטן3ומחלות דלקתיות. מסיבה זו, המקרופאגים הם מטרה טיפולית מפתח לטיפול במגוון רחב של מחלות. חשוב לחקור את ההשפעות של נוגדנים על מצב ההפעלה שלהם לפתח מקרופאג מבוססי טיפולים למחלה.
המוקד של מאמר זה הוא על השימוש של מח העצם מאתר נגזר מקרופאגים (BMDMs) ו מקרופאגים הצפק כדי לבחון את ההשפעה של תרופות נוגדנים על תגובות דלקתיות חוץ גופית בתוך ועל ויוו. לאחרונה, היו מספר מחקרים המראים את ההשפעות של נוגדנים על מקרופאג הפעלה6,7,8. מקרופאגים מופעל במשותף עם מכלולים חיסוניים, אשר הם נוגדנים ומורכבת עם אנטיגן, ו LPS, גירוי דלקתי בדרך כלל, לייצר רמות גבוהות מאוד של ציטוקין דלקתי, IL-10, רמות נמוכות מאוד של ציטוקינים פרו-דלקתיים. אינטרלוקין 12 (IL-12)9. בנוסף, רמיקייד, של נוגדנים חד שבטיים כנגד TNFα, נמצאה לעבודה, בין השאר, על ידי גרימת מקרופאגים אנטי דלקתיות שלו שבר crystallizable (Fc) אזור7. דיווחנו כי IVIg + LPS זירוז הפעלה מקרופאג אנטי דלקתי הדומה ל- M (IC + LPS), שבו שיתוף מגורה מקרופאגים לייצר כמויות גדולות של IL-10, כמויות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים יחידה משנית אינטרלוקין 12 או 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) ו- TNF8. IVIg היא תרופה מורכבת נוגדנים polyclonal, בעיקר IgG, אשר יש כבר איחדו מהדם של תורמים יותר מ-1,00010. היא משמשת לטיפול במגוון רחב של מחלות חיסוניות, כגון אידיופטית היווצרות קרישי דם, פולינוירופתיה של המיאלין כרונית, אך את מנגנון הפעולה אינה לגמרי מובן11. השפעת סמים נוגדן מבוסס על הפעלת מקרופאג יכול להידרש באמצעות השיטות המתוארות במסמך זה.
ניתן לבדוק זאת ההשפעות של תכשירים ספציפיים על הפעלת macrophage BMDMs, המקרופאגים הצפק. באמצעות מקורות אלה מקרופאג מאפשרת הערכה של ראשי תאים. בדיקה ראשונית של נוגדנים על תאים בתרבית הראשי דורש פחות זמן והשקעה כספית מאשר דגמים אחרים במחלה זמן רב ויקר. על ידי הזרקת תרופה לתוך יישום עכבר בריא ויוו, ואת לבודד את התאים וניתוח אותם ex-vivo, ניתן לקבוע אם מחקרים הם מוצדקת כדי להעריך אם טיפול עם תרופות/מוצרים ביולוגיים משפיע על ההפעלה מקרופאג במודלים של המחלה.
מחקרים מעטים בוחן את ההשפעה של טיפולים ביולוגיים על מקרופאג הפעלה חוץ גופית בתוך ו ויוו ישירות, טכניקות שלנו לספק יתרון על טכניקות חלופיות. טכניקות הנוכחי כוללות השפעות תרופות וחיסונים בדיקה על מעורבות לתאים אוכלוסיות במבחנה, כגון השפעת רמיקייד תגובת לימפוציטים מעורבת (MLR) או IVIg על אנושי מקרופאגים בתאים תאי דם היקפיים, איפה האפקט לא ניתן לייחס ל-7,סוג תא מסוים12. באמצעות BMDMs ו מקרופאגים הצפק יש יתרון על פני שימוש שורות תאים, כגון תאים RAW264.7, אשר אינם מייצרים את ציטוקינים פרו-דלקתיים, IL-12, בתגובה LPS8,13. בדיקת השפעת סם נוגדן מבוסס על מקרופאג תגובות שמחוץ יתרונות בגלל תגובות ציטוקין ניתן לייחס ישירות מקרופאגים, יותר מאשר מסיקים מקרופאג תגובות על ידי מדידת רמות ציטוקינים סרום14 . BMDMs ו מקרופאגים הצפק יכולים להיות נגזר, מבודד עכברים מהונדסים כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של חלבון מקרופאג אנטי דלקתיות הפעלה. לדוגמה, השתמשנו Il10 לקויה(- / -) BMDMs כדי להדגים כי IVIg-induced הפחתה של ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים תלויה חלקית IL-108. מנגנון הפעולה של התרופה יכול ייחקרו באמצעות סופג המערבי, בו ניתן לקבוע את התפקיד של חלבונים ספציפיים ואירועים איתות. ניתן לבצע תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) BMDMs או מקרופאגים הצפק כדי להציג דפוסים של ביטוי גנים כתוצאה מהפעלה נוגדן. מודלים המחלה בעכברים יכול לספק מידע על יעילות פוטנציאל של נוגדן מבוססי טיפולים ביולוגיים במודלים למחלות מעי דלקתיות, דלקת מפרקים שגרונית מחלות סרטן15,16, 17. אולם, מהטכניקות שתוארו כאן יספק מידע על מנגנון הפעולה של תכשירים אלה על-ידי קביעת אם הם זירוז פעילות מקרופאג אנטי דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת בריטיש קולומביה.
1. מח עצם מקרופאג נגזרת והפעלה עם נוגדנים
- לבצע המתת חסד באמצעות חנק2 CO.
- עכבר למקום בלשכת הגיוס. המתת חסד העכבר עם הרדמה איזופלוריין 5%, עבור s 60-90, עד משותק ונושמת עמוק ולאט.
- לבטל את איזופלוריין הרדמה ולפקח על 6-8 L/דקה של CO2 עד העכבר הפסיקה לנשום. יוצאים עכבר עם CO2 לפחות עוד 5 דק. ודא כי קיים כבר לא דופק או נשימה. לבצע תאמת צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
הערה: 8-12 שבועות עכברים הישן לספק את התשואה הגבוהה ביותר של מקרופאגים.
- לרסס העכבר רגליים עם 70% אתנול, להלביש אותם עם הידיים והרגליים הנמתחת במצב פרקדן מעל לוח מוקצף. עם מספריים, מלקחיים להחזיק את העור, עושים חתך רדוד (0.2 ס מ) כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל אחת הרגליים האחוריות.
הערה: לבצע הליך זה ומניפולציות תרביות רקמה כל כיסוי סטרילי. - חיתוך השריר לחשיפה tibias ועצמות ירך. הסר את tibias ואת עצמות הירך, על ידי חיתוך עצם של השרירים מתחת מפרק הירך מעל הקרסוליים. לקצץ כמה שיותר שרירים ככל האפשר.
- לרסס עצמות עם 70% אתנול ולהמתין 1 דקות עד להתאדות, ולאחר מכן למקם אותם בצלחת טוב 6 של עצם בינוני סומק (של Iscove שונה בינוני של Dulbecco (IMDM), 10% סרום שור עוברית (FBS)).
- חתוך את קצות העצמות על ידי חיתוך 0.1 ס מ של עצם הקרסול, העליון של עצם הירך, כך חלל העצם נחשפת. ודא מח העצם הוא גלוי מחט בקוטר 26 ניתן למקם בחלל העצם.
- חותכים את העצמות, השרירים כדי להפריד את tibias ואת עצמות הירך של המפרקים בברך. הכנס של מחט בקוטר 26 המצורפת מזרק 10 מ"ל לתוך החלל. לרוקן את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל 5 מ של העצם מיושרות בינוני. ריקון שני tibias ועצמות ירך שני, מעכבר אחד, לתוך כל שפופרת 50 מ.
- Pipette למעלה ולמטה כמה פעמים או מערבולת את מח העצם במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים. מחרוזות של מח צריך להיות שבור לתוך קטן (פחות מ- 0.5 מ"מ) כתמים של מח. למלא צינור חרוטי כדי 50 מ עם עצם מיושרות בינוני. פיפטה התוכן של הצינור חרוט 75 ס מ2 רקמות בתרבות הבקבוק ובא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לשעה.
הערה: בוגרת מקרופאגים ותאים mesenchymal יהיה חסיד אל הבקבוק ולא ימחקו, בעוד hematopoietic המוצא לאגס הרצוי להישאר ההשעיה. - Pipette של המדיום עם אבות hematopoietic לתוך צינור חרוטי 50 מ. Centrifuge הצינור ב g 300 x בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של המושבה מקרופאג גירוי בינוני תרבות פקטור (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ננוגרם למ"ל MCSF, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין ו 150 μM monothioglycerol (mtg ב)).
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer18. הוסף בינוני resuspend לתאים ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל, 1.5 x 107 תאים/הבקבוק ב 30 מ של בינוני, ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות. פיפטה 30 מ של ההשעיה לתוך בקבוקון תרביות רקמה מטופלים חדשים 75 ס מ2 .
- ביום 4 וביום 7 אחרי תרבות ראשונית בשלב 1.9, ודא כי התאים הם מחסידי קנים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ניגודיות שלב הפוכה. למחוק את המדיום המכילות את התאים הלא-חסיד. לשטוף את התאים עם IMDM פעם אחת, להוסיף 30 מ של MCSF תרבות בינוני.
- כאשר התאים הם בוגרים ביום 10 (> 95% חיובי F4/80 ו- Mac-1), לוודא שוב התאים הם מחסידי במקצת.
- צלחת תאים עבור stimulations, המדיום תרבות להסיר הבקבוקון ולהוסיף 8 מ ל אנזים חינם, מבוסס-EDTA תא דיסוציאציה מאגר (טבלה של חומרים). דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- לגרד תאים בעדינות, עם כמות קטנה של לחץ, באמצעות המגרד של התא סטרילי. בדוק במיקרוסקופ זה התאים יש מנותקת השטח את הבקבוק. פיפטה הפומבית תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את הבקבוק 3 פעמים עם 5 מ של IMDM, בריכה הפתרון שטיפה עם התאים נבצרו. צנטריפוגה תאים ב g x 300 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של MCSF מדיום תרבות למחזור חרוט 50 מ. ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer18. Resuspend תאים על ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל וצלחת μL 100 של התא השעיה (1 x 105 תאים/טוב) לכל טוב של 96-ובכן רקמות תרבות מטופלים, צלחת התחתון שטוח.
הערה: עצמות של עכבר אחד יפיק מספיק תאים 100-וולס. אם רצונך בכך, באפשרותך מצופה 1 מ"ל של תאים בצלחת 6-טוב (תרביות רקמה, שטוח מטופל למטה). מספר גדול יותר של תאים (1 x 106 תאים) עשויה להיות שימושית עבור ניתוחים תספיג חלבון. - לאחר חסיד, לעורר כפילויות או שהפקידים בארות כל אחד עם 10 ננוגרם למ"ל של LPS ב IMDM, 30 מ"ג/מ"ל של IVIg, או IVIg + LPS. מינונים של LPS או IVIg, יכול להיות טיטרציה כדי למטב את התגובות. השאר כפולים או triplicate בארות כפקדי unstimulated. תקופת דגירה אותם של 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
הערה: תאים מצופים מחדש צריך לדבוק תרביות רקמה בארות בתוך 1 h. - לאסוף תא supernatants מכל קידוח לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.7 בודדים ולהסיר כל חלקיקי מאת ספינינג ב g x 10,000 למשך 5 דקות.
- הסר את התא supernatant, להימנע מהפרעה בגדר. למקם את התא מובהר supernatant בשפופרת microcentrifuge סטרילי.
הערה: תא supernatants שניתן לבדיקה ציטוקינים, IL-10 של ציטוקין יחידה משנית, IL-12 / 23p 40, על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C לטווח ארוך. בצע אליסה פרוטוקול זמינים מסחרית קיט (טבלה של חומרים). ציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים יכולים להיות לבדיקה, כגון IL-6 ו- TNF, כפי שהם מופחתים גם על ידי טיפול משותף עם IVIg + גירוי LPS בהשוואה גירוי עם תקליטונים בלבד. לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים טכניקות כגון סופג המערבי או כמותית פולימראז תגובת שרשרת (Q-PCR) 19,20.
2. מאתגר עכברים In Vivo עם IVIg קצירת מקרופאגים הצפק
- שוקלים כל עכבר.
הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של IVIg נדרש.
הערה: בצע את ההליך בשכונה סטרילי.
הערה: המקום את המחט בקפידה העכבר כך שאתה לא מזריק PBS לתוך האיברים, אך במקום זאת, לחלל הצפק.
הערה: עבור כל 5 מ של נוזל מוזרק, כ 3.75 מ ל ניתן לשחזר.
הערה: לאחר הזריקה האחרונה, זה עשוי להיות קל יותר לחלץ את הנוזלים מן הצדדים רחוק שמאלה וימינה של העכבר, שבו מצטבר נוזל. האיברים תגרום פחות הפרעות עם מחט בעמדה זו.
הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק. התשואה טיפוסי הוא 5 x 105 - עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/עכבר עכבר C57BL/6 פראי סוג.
אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק כדי להסיר אותם, באמצעות המאגר פירוק של תאי הדם האדומים 1 x על פי הוראות היצרן.
הערה: ייתכן צורך בריכה תאים מן העכבר אחד או יותר עבור ניסוי אם משתמש triplicate בארות או ממריצים titrating. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך. יהיו מספיק תאים עבור 5 בארות, או 1 בניסוי כפולות, עם מנה אחת של LPS.
הערה: לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים לכל טכניקות כגון תספיג או ה-PCR.
3. מאתגר עכברים in Vivo עם IVIg + LPS קצירת מקרופאגים הצפק
- שוקלים כל עכבר. חישוב הנפח של IVIg (ריכוז מניות 100 מ"ג/מ"ל) הדרושים כדי לספק מנה הסופי של 2.5 g/ק ג משקל גוף. לחשב את הסכום של LPS (ריכוז מניות μg/מ ב- IMDM) הדרוש כדי לספק מנה הסופי של 0.2 μg/גרם משקל.
הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של פתרון מניות IVIg, μL 40 של פתרון 100 μg/mL של LPS נדרש. - לצייר את הכמות הנדרשת של IVIg ולהערכת LPS לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד 26 סטרילי המחט. עבור בקרת עכברים אשר לא יקבל IVIg, להחליף אמצעי מקביל של IVIg PBS סטרילי pH 7.4.
- עורפה העכבר עם יד אחת על-ידי תופס את עורה באחור של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה ממושכת שלה הזנב והרגליים האחוריות עם האצבעות הנותרות. להטות את הגוף שלו לכיוון האדמה.
- מקום המחט בזווית של 30-40 מעלות ביחס הבטן של העכבר, ברביע התחתון הנכון, מסגרת משופעת, ו להוסיף 1.5 ס מ. הכנס IVIg + LPS, או PBS + LPS, intraperitoneally כמו צעד 2.4.
- לאחר 1h, לקצור מקרופאגים הצפק על-ידי ביצוע השלבים 2.5-2.10.
- ספין תאים למטה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר 1 מ"ל של נוזל שטיפת התאושש להשתמש עבור IL-10 וניתוחים IL-12 / 23p 40 מאת אליסה לפי הוראות היצרן או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס במשך שניתוח.
הערה: כדי להבטיח השוואה מדויקת בין הטיפולים לניתוח ציטוקין נוזל שטיפה, לבצע flushs מ של חלל הצפק 4 פעמים עבור אמצעי אחסון הסופי של 15 מ"ל. לא כל נוזל יחולץ מתוך כל סומק. - כמו צעד 2.11, resuspend ולספור מקרופאגים קיימא.
הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק.
אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק לפי הנחיות היצרן כדי להסיר אותם, כמו שלב 2.11.
הערה: יתכן לתאים הבריכה הכרחי מכל עכבר אחד או יותר עבור ניסוי. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך.
הערה: דגימות עשוי להיות שימוש באופן מיידי או קפוא, מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקין מאת אליסה.
הערה: ניתן להכין תאים עבור טכניקות כגון תספיג או PCR, צעדים 1.16-1.17, 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאתר עצם מח נגזר מקרופאגים יכול להיות מחונן מ מבשרי תא hematopoietic ב aspirates מח עצם מח עצם aspirates איחדו בין עצמות הירך tibias של עכבר C57BL/6 אחד בדרך כלל תשואה 10 מקרופאגים מח עצם נגזר7 , הפיכתם מקור נוח של מקרופאגים לניסויים. BMDMs יכול לשמש כדי לבדוק תגובות סמים נוגדן מבוסס כאשר לערער עם גירוי דלקתי של במבחנה. איור 1 מציג את המותג IVIg, Gammunex (GX), + LPS מגביר את הייצור של ציטוקין דלקתי, IL-10, 7-fold לעומת LPS גירוי לבד (איור 1א') וכן מפחית את הייצור של IL-12/23 p 40 (איור 1 B). איור 1 מדגים גם תכשירים שונים IVIg לבצע בצורה שונה. למרות ההכנות שונים שלושה של IVIg מסוגלים להקטין את IL-12 / 23p 40 באופן משמעותי (איור 1B), Octagam (ו) ו- Gammagard נוזלי (GL), מגדילה באופן משמעותי ייצור IL-10 בתגובה LPS (איור 1 A)-OG ו GL מסוגלים להפחית באופן משמעותי את ייצור IL-12/23 p 40 בתגובה LPS, אך במידה פחותה יותר מאשר GX. תוצאות אלו מדגימים נוגדן משפיעה על מח העצם נגזר מקרופאג הפעלה, כי קיימים הבדלים בין ההכנות מאותה תרופה. זה יכול לגרום לשינויים בתגובות.
BMDMs יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות מכניסטית של IVIg, על-ידי סופג המערבי. מקרופאגים מופעל עם IC + LPS הגדילו זירחון של kinases חלבון (מפה) mitogen מופעל, p38 ו Erk1/2, אשר אחראים על ייצור מוגבר של IL-1021. תוצאות באיור 2 מראות תספיג טיפוסי לאתר מפה קינאז ההפעלה הכרחית לייצור IL-10 על ידי מקרופאגים הנמצאים unstimulated, או להיות מגורה עם התקליטים, IVIg, או IVIg + LPS. IVIg גירוי לבד או IVIg + LPS שיתוף גירוי מוגבר הפעלה של kinases המפה, Erk1/2, עם זרחון קודמות וממושכת בהשוואה לזה עם תקליטונים בלבד. הפעלה של p38 התרחש קודם לכן מקרופאגים מגורה עם IVIg + LPS בהשוואה לאלו מגורה עם תקליטונים בלבד. תוצאות אלו מראות כי שיטות, כמו סופג המערבי, יכול לשמש להצגת התא איתות ההשפעות של הנוגדן בסמים על BMDMs. בנוסף ייצור ציטוקינים, להפעלת קינאז מפה ניתן להראות שאירעה הפעלה מקרופאג אנטי דלקתיות.
בוגר, מקרופאגים תושב רקמות ניתן גם מבודד עכברים כדי להעריך את התגובות IVIg 5.0 x 105 - 1.0 x 106 מקרופאגים הצפק ניתן לבודד של עכבר אחד C57BL/6 בריאים. איור 3, מקרופאגים הצפק של עכברים הזריק IVIg לא משמעותית להגביר את IL-10 ייצור בהיעדר גירוי במבחנה, בהשוואה ל- PBS מוזרק עכברים. כאשר מזריקים מקרופאגים הצפק של IVIg עכברים מומרץ עם LPS ex-vivo, שהם מייצרים 6-fold יותר IL-10 מאשר עכברים הזריק PBS. הם לא, לעומת זאת, לייצר כמויות לזיהוי של IL-12 / 23p 40 אחרי גירוי עם LPS ex-vivo. תוצאות אלו מדגימים כי תופעות נוגדנים יכול להיבדק על מקרופאגים על ידי הזרקת ה סמים ויוו culturing תאים לשעבר vivo בשיטה זו.
מקרופאג התגובות נוגדנים, גירויים דלקתיות ניתן המוערך ב vivo. ייצור ציטוקינים יכול להידרש בנוזל שטיפה, ב supernatants מ ex-vivo מגורה מקרופאגים הצפק. איור 4 מראה ציטוקין דלקתי IL-10 הוא גדל בנוזל שטיפה (איור 4א), תאים הצפק (איור 4B) ו מקרופאגים הצפק (איור 4C) כאשר עכברים מאותגרים עם IVIg + LPS בהשוואה ל- PBS + LPS. הייצור של יחידת משנה ציטוקינים פרו-דלקתיים, IL-12 / 23p 40, פוחת באופן משמעותי מקרופאגים הצפק תרבותי, אך לא נוזל שטיפה. שיטה זו מאפשרת בחינת ההשפעה של סם נוגדן על תגובות דלקתיות ויוו וכן vivo לשעבר.
איור 1 : ייצור מקרופאג IL-10, IL-12 / 23p 40 בתגובה לגירוי שיתוף עם מותגים שונים של IVIg ו LPS. MCSF C57BL/6 מח עצם נגזר מקרופאגים היו גם unstimulated (ג), או גירוי עם LPS (10 ng/mL), IVIg (30 מ"ג/מ"ל), או IVIg + LPS. נבדקו שלושה מותגים שונים של IVIg: Gammunex (GX), Gammagard נוזלי (GL) ו Octagam (OG). מקרופאג supernatants היו נאספים 24 שעות לאחר גירוי, מובהר על ידי צנטריפוגה. ELISAs עבור IL-10 (א) ו- IL-12/23 p 40 (B) בוצעו. הם נתונים עבור מקרופאגים מ- n = 3 ניסויים עצמאית, עם תאים 1 עכבר בודדות לכל ניסוי, עם ELISAs לבדיקה של כפילויות. הנתונים הם אמצעי ± SD. *P < 0.05, * * P < 0.001, * * *P < 0.0001 להשוואה בין גירוי LPS IVIg + גירוי שיתוף LPS. בכיוון אחד השונות (ANOVA) עם הבדיקה שלאחר של Tukey להשוואות מרובות שימשו ניתוחים סטטיסטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תספיג ניתוח של הפעלת קינאז מפה ב- IVIg מופעל מקרופאגים. MCSF נגזר מח עצם מקרופאגים היו unstimulated או מגורה עם LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 מ"ג/מ"ל), או GX IVIg + LPS; עבור lysates התא כולו 0, 10, 40 או 120 דקות (1.0 x מקרופאגים6 10/ליין...) היו נתונים dodecyl נתרן גופרתי-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) והמערבית סופג עם נוגדנים ספציפיים פוספו עבור p38, חוץ-תאית קינאז מוסדר אות (Erk1/2), כמו גם גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH), כמו פקד הטעינה. התוצאות המוצגות הן נציג של n = 3 ניסויים עצמאית, עם תאים 1 עכבר בודדות לכל ניסוי.Densitometry pp38, רמות החלבון pErk1/2, מנורמל ל GAPDH, בממוצע של ניסויים עצמאית 3 מוצגים להלן כל הלהקה. דמות זו שונתה ואחKozicky8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ייצור IL-10 על ידי מקרופאגים של עכברים הם אתגר IVIg vivo ב. בן שבוע 8 C57BL/6 העכברים ניתנו PBS סטרילי (בקרת הזרקה) או GX IVIg (2.5 g/kg) intraperitoneally. לאחר 1 h, עכברים היו מורדמים, lavages הצפק בוצעו. מקרופאגים פריטוניאלית היו מבודדים שהקטע הדבקות. מקרופאגים היו גם unstimulated (ג), או גירוי עם LPS (10 ng/mL). תא supernatants היו קוצרים, צוה לאחר 24 שעות ELISAs IL-10. הם נתונים מ- n = 5 עכברים בודדים לכל קבוצה ביצע ניסויים עצמאית 3, עם ELISAs לבדיקה של כפילויות. הנתונים הם אמצעי ± SD. * P < 0.01 ו NS = לא משמעותי. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות של אנובה דו-כיווני של Sidak posttest להשוואות מרובות. דמות זו שונתה ואחKozicky8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ייצור IL-10, IL-12 / 23p 40 מ עכברים הם אתגר IVIg + LPS ויוו. בן שבוע 8 C57BL/6 עכברים הוזרקו intraperitoneally או PBS + LPS (משקל הגוף µg 0.2/g), כפקד; או GX IVIg (2.5 גרם/ק"ג משקל גוף) + LPS (משקל הגוף µg 0.2/g). לאחר 1 h, עכברים היו מורדמים, lavages הצפק בוצעו. (א) Clarified שטיפה נוזל, (B) מובהר supernatants ממוזגים מתאי הצפק במהלך צעד הדבקות מקרופאג 1 h, (ג) מובהר 24 שעות supernatants הצפק מקרופאג (מ'φ) היו לבדיקה עבור IL-10 ו- IL-12 / 23p 40 מאת אליסה. הנתונים הם אמצעי ± SD עבור n = 5 עכברים בניסויים עצמאית 3, עם ELISAs לבדיקה של כפילויות. P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001 ו NS = לא משמעותי. עכברים מוזרק עם PBS + LPS הושוו לעכברים הזריק IVIg + LPS באמצעות למבחן t של סטודנט. דמות זו שונתה ואחKozicky8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מקרופאג הפעלה הברית תפקיד חשוב הן רקמה הומאוסטזיס ומחלות22. מקרופאגים יכולים להיות ברורים כמו גם חופפים הברית הפעלה, בהתאם רמזים שלהם microenvironment3. . יש להם תפקידים ברורים בכל שלבי התגובה דלקתיות: ההגנה נגד פתוגנים, פצע ריפוי ורקמות פיצוי, ויש גם מצב הפעלה אנטי דלקתי מובהק כי חשוב לכבות את התגובה דלקתית2 . מקרופאג אנטי דלקתיות ההפעלה דורשת שני גירויים חיצוניים עבור מקרופאגים לייצר כמויות גבוהות של ציטוקין דלקתי, IL-10, כמויות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-1223. אות אחת נובע נוגדנים מתנהג דרך רצפטורים גמא Fc, ואת האות השנייה הוא הפרו דלקתיים גירוי, כגון תקליטונים או IFNγ24,25. סרום מכלולי המערכת החיסונית, אנטי-TNFα נוגדנים, כל התגלו כדי לגרום למצב הפעלה אנטי דלקתיות IL-10-produing גבוהה מקרופאגים8,23,25,26. הקבוצה שלנו פרסם בעבר מח עצם מאתר נגזר מקרופאגים וזה ממריצים עם IVIg הצפק המקרופאגים גם לייצר כמויות גבוהות של IL-10 ומעט לא הפרו דלקתיים IL-12 / 23p-40 בתגובה LPS8. מצאנו גם כי ציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים, TNF ו- IL-6 גם מופחתים על ידי IVIg מח עצם נגזר מקרופאגים8. ניתן להחיל בשיטות המתוארות כאן כדי לבדוק תגובות לסמים אחרים נוגדן מבוסס עכבר BMDMs, המקרופאגים הצפק חוץ גופית בתוך ואת ויוו.
ישנם שלבים קריטיים רבים בדיקות נוגדן מבוססי הרפוי על מח העצם העכבר ו מקרופאגים הצפק. שמירה על עקרות חשוב עבור כל פרוטוקול. אם מקרופאג תרבויות מזוהמים עם מיקרואורגניזמים מן האוויר, פרווה, או צואה של עכברים, המקרופאגים יגיב לגירויים אלו על ידי ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים. מבצע כל הניסויים אבטחה ארון, ריסוס העכבר בנדיבות עם אתנול ו הבטחת תקינות המעי במהלך ריקונים הצפק חיוניים. הנוגדן חייב להישמר גם סטרילי ומאוחסן לפי הוראות היצרן. זה לא יכול לשמש אם זה מזוהמים, שפג תוקפו או עכורים. עכירות יקטין את האפקטיביות של התרופה, יכול להתרחש אם התרופה אינה מאוחסנת בטמפרטורה נכונה או אוחסן זמן רב מדי. IVIg יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C, להשתמש רק לפני תאריך התפוגה מתמלאת, מאז רמות ייצור IL-10 יכולים להיות מושפעים. לחלופין, ראינו כי זה יכול להיות קפוא ב-20 ° C עם אין השפעה על תגובות. מגרשים של IVIg להוביל תוצאות ניסוי דומה, ואילו סוגים שונים של IVIg המותג ההכנות, כמו באיור 1, יכול לגרום תגובות שונות אצל מקרופאגים. אתרי שולטת, כגון unstimulated תאים, ותאים מגורה עם נוגדן לבד, חייבים להיכלל ניסוי כדי לשלול הזיהום של מקרופאגים או התרופה.
מספר שינויים יכול להתבצע על פרוטוקולים אלה כדי להתאים אישית ניסוי. במדינה שאינה דלקתית, זה יכול להיות קשה לבודד מספיק מקרופאגים הצפק לניסויים גדולים. מקרופאגים הצפק יכולים להיות שהפיק הזרקה בקרום הבטן של thioglycollate (TG). מתרחשת תגובה חיסונית, אחרי ארבעה ימים, מקרופאגים הצפק elicited יכול להיות שנקטפו27. Macrophages מגויס עשוי להיות פחות בוגר, אינם מייצגים תושב תאים, כאשר השתמשנו כאן, אשר הם שיקולים חשובים. TG-elicited macrophages עלול גם הפנימו אגר מ מרק TG, אשר עשוי להיות סיבוך, במיוחד אם עושים ניסויים על phagocytosis27. עכברים מרקע גנטי שונה, C57BL/6 או BALB/c, יכול לשמש גם עבור ניסויים, עשוי להיבחר כדי לבחון את ההשפעה של נוגדנים על התגובות מקרופאג ייבחנו במודלים המחלה הדורשים רקע גנטי מסוים. בנוסף, ניתן להשתמש עכברים מהונדסים, כגון עכברים- / - Il10, כדי להעריך את הפונקציה של חלבונים ספציפיים של מנגנון הפעולה של התרופה, כפי שעשינו עבודה שלנו8. גירויים דלקתיים שונים יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעה של נוגדנים על מקרופאג ההפעלה. IFNγ, מארח נגזר אגרה כמו אגוניסטים לקולטן (TLR) (למשל חומצה היאלורונית), שימשו כדי להפעיל את IL-10-הפקת מקרופאגים25,28. שיקול חשוב הוא המינון של הנוגדן. המינון צריך להיות, טיטרציה כדי לקבל את המינון האופטימלי בתרבות, בניסויים על בעלי חיים, כפי שזה יהיה שונה בין נוגדנים, כמו גם ספקים. המינון נבחר גם לשקף את המינון ניתנה לבני אדם, יהיה שונה בין תרופות. IVIg ניתנת כטיפול אנטי דלקתיות במינונים גבוהים (25-35 מ"ג/מ"ל או 2 g/ק ג משקל גוף), אשר משקף את המנות titrated בשימוש אלה הפרוטוקולים29,30.
השימוש של מח עצם ו מקרופאגים הצפק יש מגבלות. למרות שיפור לעומת קווי macrophage התא, העכבר BMDMs הם תאים עדיין באופן מלאכותי נגזר מן hematopoietic סימנים מקדימים. בדיקת תגובות מערכת החיסון של מקרופאגים במבחנה היא צעד חשוב כדי הבנה נוגדן תגובות, אבל ויוו הניסויים יש לבצע גם כן. הזרקת גירויים ויוו ואחריו culturing תאים vivo לשעבר, יכול לספק מידע נוסף עבור מחקרים עתידיים לחקור אם נוגדן מבוססי תרופות יכול גם להפעיל אנטי דלקתיות מקרופאגים במצב המחלה. לא ניתן להסיק מסקנות על מה מתרחשת אצל אנשים מקבלים נוגדן מבוססי תרופות/מוצרים ביולוגיים ניסויים אלה. מחקרים מעטים פורסמו כדי להעריך את ההשפעות של IVIg על האדם מונוציט נגזר מקרופאגים חוץ גופית בתוך. צמצום מספר של IL-6 בהפקת ומונוציטים אנושיים במבחנה דווחו, כאשר IVIg מגורה במשותף עם LPS בהשוואה גירוי עם LPS לבד12. IVIg מפחית TNFα, ייצור IL-6 אחרי גירוי עם procalcitonin (PCT)-אנוש THP-1 monocytic תאים31.
הפרוטוקולים בתוך הנייר הזה יש יתרונות על פני שיטות קיימות. מח עצם נגזר מקרופאגים, מקרופאגים הצפק הם תאים הראשי, מבודד ישירות מן העכברים, במקום להיות מונצחים שורות תאים.שורות תאים מקרופאג דמוי העכבר, כגון תאים RAW264.7, אינם מייצרים את ציטוקינים פרו-דלקתיים, IL-12, בתגובה LPS, וזו ציטוקין חשוב זה מוסדר על ידי IL-10 זה מופק בתגובה IVIg8,13. בדיקות של סמים ויוו עם LPS מאפשרת בחינה של השפעת הסם על הסביבה הצפק המקומית באמצעות ניתוח של נוזל שטיפה, תאים הצפק, באופן ספציפי, הצפק מקרופאגים. זה לטווח קצר, מודל פשוט שיכול לספק מידע חשוב כדי להצדיק הבחינה של השפעת שאינם ספציפיים נוגדנים על הפעלת מקרופאג במודלים של בעלי חיים ארוכים יותר ויקרות יותר של המחלה. יש לו יתרון על פני דגמים endotoxemia שבו המדד ניסיוני הוא לעתים קרובות רק הישרדות העכבר או ציטוקינים סרום14. שיעורי ההישרדות סרום ציטוקינים הם אמצעי חשוב של התגובה החיסונית, אך הם אינם מראים התרומה כי מקרופאגים יכול לקבל באופן ספציפי. בידוד culturing את המקרופאגים הצפק של ניסוי אתגר מצביע השפעה ישירה וניתנת למדידה נוגדן הרפוי שיכולה להכיל על תפקוד מקרופאג.
שיטות אלה יש שימושים בדיקות ועיצוב טיפולים ביולוגיים. השימוש של נוגדנים הרפוי גדל באופן דרמטי בשנים האחרונות. עם זאת, אלה טיפולים יכול להיות השפעות לא ידוע נוספים על מקרופאגים יכול לזהות את החלק Fc של הנוגדן ושינוי ייצורם ציטוקין. נוגדן אנטי-TNFα, רמיקייד, הוכח לגרום IL-10, לדכא את תא T התפשטות דרך החלק קבוצת הכדורגל שלה, זה הוצע כאחד שלה מנגנוני פעולה7,15,26. באמצעות דגמים גנטיים, חלבונים ספציפיים יכולים להיות מעורבים המנגנון של מה תרופות אלה משפיעות על הפעלת מקרופאג. ניתן לשנות סוגי נוגדנים IgG וההכנות של נוגדנים לשנות איך מקרופאגים מושפעים תרופות/מוצרים ביולוגיים. הנתונים שלנו מצביע על הכנת ו/או אחסון של נוגדן אותו (IVIg) יכולים להשפיע את השפעותיו על מקרופאג ההפעלה. השיטות בתוך מאמר זה יכול לשמש כדי לעצב טיפולים שאין תופעות אלה, אשר עשוי להיות קריטי כדי לשמור על immunosurveillance במהלך טיפולים בסרטן, איפה מקרופאגים אנטי דלקתיות עשוי לקדם את התקדמות הגידול. טכניקות אלה יכולים לשמש גם לתכנן ולהעריך את התרופות יש תופעות אלה, אם רצוי. לדוגמה, זה יכול להיות מועיל להפחית תגובות דלקתיות מקרופאג וליצור אנטי דלקתיות מקרופאגים IL-10-בהפקת ' כדי לשפר את הטיפול במחלות מעי דלקתיות או דלקת מפרקים שגרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
L.K. היא זוכת פרס studentship בוגר אוניברסיטת בריטיש קולומביה מלגת 4 שנים (4YF). L.M.S. הוא הנמען של אגודה הקנדי של גסטרואנטרולוגיה / קרוהן, קוליטיס קנדה / ניו CIHR שכר חוקר פרס הוא מלומד הביו-רפואית של קרן מייקל סמית למחקר בריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרוייקט משירותי הדם הקנדי, בשיתוף עם קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X.
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
