Medicine

דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

Published: January 13, 2018 doi: 10.3791/56712

Kerstin Hadamek^1,2, Angelika Keller^1,2, Antje Gohla^1,2

¹Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, ²Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

Summary

אנו מתארים הנועד במבחנה דגם chorioallantoic מצורף, בשלב הראשון של היווצרות השליה. הפרוטוקול מדגים התרבות לנתיחה, explant של allantoides מאתר על קיבוע α4β1 אינטגרין. קובץ מצורף allantois מוערך ברמה המיקרוסקופית בנקודות זמן שנקבע מראש.

Abstract

השליה היא חיונית עבור הצמיחה וההתפתחות של עוברי יונקים. מסיבה זו, רבים שינויים גנטיים ועלבונות סביר גם סביבתי זה להפריע התפתחות השליה או לפונקציה יכול לגרום לאבדן הריון מוקדם בעכברים ובבני אדם. למרות זאת, פשוט במבחנה מבחני על המסך עבור תופעות אפשריות על היווצרות השליה חסרים. כאן, אנו מתמקדים מידול הצעד הראשון וקריטיים היווצרות השליה, אשר מורכב הקובץ המצורף של allantois chorion. אנו מתארים שיטה להעריך במהירות את הקובץ המצורף של explants allantoic על α4β1 קיבוע אינטגרין, המשמש מצע chorio-מימטי. גישה זו במבחנה מאפשרת הערכה איכותית של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובים בנקודות זמן שונות ברציפות. הפרוטוקול עשוי לשמש כדי לחקור את ההשפעה של העכבר יישוב מוטציות, סמים או גורמים סביבתיים שונים, אשר קושרו הריון סיבוכים או אובדן העובר על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

Introduction

השליה היא הכרחית לצמיחה עובריים ופיתוח בסביבת הרחם. היא מהווה את הממשק חמצן, מטבוליט של exchange התזונתי בין מחזור הדם העוברי, אימהית, גם פונקציות כמו איבר האנדוקרינית ו. כל עלבון אנדוגני או אקסוגני זה פוגע פיתוח היפרדות יכול להוביל פיגור גדילה תוך רחמי, אובדן עוברית או סיבוכים בהריון, בעכברים והן בני אדם¹. בעוד המספר של העכבר יישוב מוטציות הגורמות פיזיולוגיה היפרדות חריג ממשיך לגדול², עם אחרים 219 שמפורט כרגע באתר מידענות הגנום העכבר (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), שרבים פנוטיפים אלה אינם מובנים היטב מנקודת מבט מכניסטית. בנוסף שינויים גנטיים, מולקולה קטנה סמים, נוגדנים חד-שבטיים, רעלים, פתוגנים, מטבוליטים עודף או סוכנים סביבתיים שונים עלול להשפיע על התפתחות השליה, הפונקציה³^,⁴^,⁵ ^, ⁶ ^, ⁷. ובכל זאת, פשוט במבחנה assays מודל שלבים קריטיים בפיתוח השליה נדירים.

פיתוח היפרדות מאתר תופעל ב- midgestation מוקדם, כאשר allantois (מבשר התפתחותית של הטבור) מתגלה מהקצה האחורי של העובר ניצן שגדל לעבר chorion⁸. Chorioadhesive תאים בשכבה החיצונית של ניצן allantoic לתווך את הקובץ המצורף, הפצת allantois על פני השטח של chorion (chorioallantoic "פיוז'ן"). Chorion לאחר מכן מתקפל לתוך villi בו להערכת של allantois גדל כדי ליצור את המבוך, השכבה הפנימית היפרדות איפה מזינים וחמצן מוחלפים בין דם אימהי צמוד juxtaposed sinusoids וכלי עובריים⁹ ^,¹⁰.

הקובץ המצורף של allantois chorion השלב הראשוני וקריטיים אינפורמציה במבוך, פגמים בתהליך זה הם בין הגורמים הנפוצים ביותר lethality עובריים midgestation¹. למרות מספר מוטציות העכבר תוארו שבו המצורף chorioallantoic נכשל להופיע¹⁰, מסד הנתונים MGI כיום רשימות 108 מוטציות העכבר המאופיינת על ידי היתוך chorioallantoic חריג (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), האינטראקציה המערכת בין תא דם אדהזיה מולקולה-1 (VCAM-1, לידי ביטוי את והמזודרם allantoic) לבין אינטגרין α4β1 (לידי ביטוי את mesothelium כוריוני, אשר נגזר והמזודרם extraembryonic) שנראה הכרחי עבור הקובץ המצורף chorioallantoic ופיוז'ן¹¹^,¹²^,¹³. נוגדן כולה-הר פראי-סוג העובר הראו כי VCAM-1 מבוטא בתוך דיסטלי לשני-שליש הקנה allantoic ביום כ עובריים (E) 7.5¹³ (שלב somite 1-4), כי הביטוי שלה נותרת גבוהה במהלך המצורף chorioallantoic - פיוז'ן¹¹^,¹². כשל מהתופעה allantoic chorion מזוהה בדרך כלל על ידי ניתוח היסטולוגית של הרחם ניצנים. אולם, גדלים allantois הן מבחינה פיזיולוגית מאוד משתנה בין ובתוך אפילו המלטות של אותו שלב התפתחותי¹⁴, allantois יכולה רק לצרף chorion מתי זה הגיע בגודל מספיק ליצור מגע גופני. המשקף השתנות טבעי, מצורף chorioallantoic לוקח מקום מתישהו בין ~ E 8.0 ו- E 9.0 בתוך הרחם, הערכה סטטיסטית אמין של תהליך זה על ידי היסטולוגיה היא לפיכך תלויים הניתוח של מספר גדול של conceptuses להשיג מספיק דגימות בשלב ההתפתחותי המתאים.

כאן, אנו מתארים שיטה להערכת המצורף allantoic לשעבר עם רחם זה פחות תלויים בגודל allantois. נדגים את הקרע של העכבר עוברי, allantoides שלהם מ- uteri של עכברים בהריון ~ 8 ימים פוסט coitum (dpc; dpc 0.5 מייעד את הגילוי של פקק הנרתיק), ואת התרבות עוקבות של allantois explants על α4β1 קיבוע אינטגרינים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה, פונקציונלי של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובות במקביל, בנקודות זמן שונות רצופים. ניתן להשתמש בפרוטוקול למסך על ההשפעות של מוטציות יישוב, סמים או גורמים סביבתיים שונים על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

העכבר הרבייה אושרה על-ידי Regierung Unterfranken ולאחר כל הבדיקות בוצעו בהתאמה קפדנית עם האיחוד האירופי וגרמנית כל החוקים והתקנות החלים לגבי טיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. ציפוי של Microtiter צלחות עם אינטגרין α4β1 לתרבות Explant של הרחם לשעבר Allantois

לשקם את אינטגרין α4β1 מאתר lyophilized-µg/mL 200 בתוך סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לדלל את ריכוז הסופי של µg/mL 10 ב ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS. פיפטה 20 µL/טוב של הפתרון אינטגרין α4β1 מדולל לתוך המספר הנדרש של בארות של צלחת microtiter (1 allantois טוב).
הערה: למנוע את היווצרות בועות אוויר בעת ציפוי הבארות של צלחת microtiter.
דגירה הלוחות microtiter עבור 60 דקות ב 37 ° C על-ידי הצבתם חממה תרביות רקמה humidified.
בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע עם פיפטה. השתמש יניקה עדינה, שיפוע הבסיס כדי להימנע מלגעת התחתון טוב עם קצה פיפטה. לשטוף בארות פעמיים על-ידי הוספת µL 50 ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני כמו של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
שלב קריטי: בלוק ללא תשלום מחייב אתרים על-ידי הוספת µL 50/טוב של 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA) / DMEM דגירה עבור ≥ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified.
הערה: Allantois explants יכול לצרף משטחים שונים בנוכחות סרום. לכן חיוני כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים, לאחר ציפוי הבארות עם אינטגרין, לפני הוספת את allantois גזור עבור explant תרבות סרום המכיל בינוני (ראה שלב 4.4).
שמור הבארות מצופה הפתרון חסימה ב 37 ° C עד הצורך בשלב 4.4.

2. הרחם דיסקציה של עכבר בהריון-Dpc 8

הערה: להפחית את שיעורי ההריון חיובי-false לפי משקל-רווח-אפליה-¹⁵.

להקריב את העכבר על-ידי נקע בצוואר הרחם. לחטא את המעיל באזור הבטן על ידי התזה עם אתנול 70% (v/v).
הערה: ללבוש כפפות בעת טיפול עכברים. המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה מונע זיהום כימי של allantois, אשר עלולים להפריע allantois המצורף.
פתח בעור בטן על ידי ביצוע חתך קטן בקו האמצע עם מספריים. להשתמש האצבעות בכפפה כדי להחזיק את העור מעל ומתחת החתך, להפריד את העור לכיוון החזה ועל הזנב של העכבר.
לתפוס את הצפק עם מלקחיים. עם היד השנייה, לעשות חתך בצורת V מ קדמי לכיוון ישבנה באמצעות מספריים, והזז את הרקמה כדי לחשוף את חלל הבטן. השתמש המלקחיים לדחוף את המעיים לצד אחד על מנת לקבל גישה אל הרחם.
אתר כששתי הקרניים הרחם. להחזיק את צוואר הרחם (מקטע סימטרית) עם מלקחיים וחותכים את הרצועות עם מספריים משובחים. ואז ניתוק שתי קרניים הרחם באמצעות ניתוק של oviducts עם מספריים.
להשתמש מלקחיים כדי להעביר את הרחם לתוך צלחת סטרילי 10 ס מ המכיל סטרילי, PBS בטמפרטורת החדר (RT). להסיר את רקמת שומן, כלי הדם והעצבים המקיפים את הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ו/או מספריים (איור 1 א').

3. העובר לנתיחה

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת stereomicroscope מאובזר עם טווח זום 8:1.

הפרד את העוברים על ידי חיתוך בין האתרים השרשה עם מספריים. רירית הרחם שרירים של בלוטות הרחם עם מלקחיים ומשוך בנפרד כדי לחשוף את רותמי (איור 1B).
באמצעות מלקחיים, להעביר את בלוטות הרחם לתוך תבשיל 10 ס מ חדש המכיל סטרילי, RT PBS.
לתקן את רותמי סביב העובר עם קצות המלקחיים.
אעשה חתך בצד anti-mesometrial של רותמי עם מלקחיים בסדר (איור 1C), לקלף את רותמי עם מלקחיים לחשוף את העובר (איור 1D).
הערה: mesometrial בציצית רותמי הוא מאוד vascularized והוא יכול להיות רחב בבסיסו יותר החלק anti-mesometrial, אשר מכיל את העובר ומופיע חיוורת.
לנתח את העובר עם מלקחיים (איור 1E, F).
באמצעות מיקרו-כף, להעביר את העובר לתוך טיפה של PBS סטרילי הכלול תבשיל סטרילי 3.5 ס"מ.
להעביר את העובר לתוך טיפת PBS ב- 3.5 ס"מ את אותה המנה באמצעות מיקרו-כף טרי, לנתח את העובר של שק החלמון באמצעות מלקחיים (איור 1 ג'י, H).
לחלופין, אם יש צורך (למשל, עבור genotyping על ידי תגובת שרשרת של פולימראז), להעביר שק החלמון לתוך צינור סטרילי על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך טיפ גדול דיזה 200 µL פיפטה. חנות ב-20 ° C.
הערה: רקמת אימהי (קרי, שק החלמון הקודקוד כולל הממברנה של רייכהרט והחרוט ectoplacental) עשויים לזהם את ההכנה שק החלמון עשוי להוביל לתוצאות genotyping מוטעים. הסרת רקמות אלו הוא הקל ביותר לפני הקרע העובר מן שק החלמון.

4. allantois לנתיחה והתרבות לשעבר עם רחם על קיבוע α4β1 אינטגרין

חותכים את allantois מאתר הבזליים ההכנסה שלו בקצה האחורי של העובר באמצעות מלקחיים בסדר (איור 1 H).
לחלופין, אם נדרשת היערכות התפתחותית, לספור זוגות somite של העובר על ידי בדיקה חזותית באמצעות מיקרוסקופ מצויד אופטיקה חדות שלב ו 5 × ויעד × 10.
הערה: ניתן להרחיב את העובר עם מלקחיים כדי להקל על ספירת somite. קובץ מצורף chorioallantoic ופיוז'ן להתרחש בין E 9.0 E 8.0 העוברים עם ≥ 6 somite זוגות. המפנה מתחיל העוברים עם 6-8 somite זוגות.
פיפטה 40 µL/טוב של DMEM בתוספת 10% (v/v) בסרום שור עוברית-גלוטמין, אנטיביוטיקה על המספר הנדרש של microtiter מצופים מראש צלחת וולס (ראה סעיף 1).
לאסוף את allantois צפים על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך דיזה גדול של קצה פיפטה 200 µL. העברת allantois 1/טוב.
דגירה של allantoides על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) עבור למשל, 6, 12 ו- 24 שעות ביממה. על מנת למנוע הפרעה עם קובץ מצורף allantois, אל תזיז את הצלחות microtiter בין נקודות זמן אלה.
בכל נקודה בזמן, ציון allantois מצורף (לדוגמה, allantois אין קובץ מצורף/צף; allantois באופן חלקי או מלא מצורף; מלא התפשטות allantois) באמצעות מיקרוסקופ מצויד שלב חדות או דיפרנציאלית אופטיקה חדות הפרעות, 5 × או 10 × אובייקטיבי (איור 2).
הערה: נציג דוגמאות allantoides מבודדים לחלוטין המצורפת טרי מוצגות באיור2. Ex עם רחם, בקצה הדיסטלי של allantoides מבודד wildtype C57BL/6J עכברים מייחסת בתוך 4-6 שעות (זה מכונה החלקי של allantois), והוא מלא מצורף של allantois שלמה הושג בתוך ~ 12 שעות של תרבות. מאת ה' 18-24, explant שיטוח, הניח צורה מעגלית (המכונה כמו במלואם התפשטו allantois) עם CD31-חיוביות וסקולרית פלקסוס⁹^,¹⁶.

5. כתמים מאשרות Allantois Explanted על CD31 סמן התא אנדותל

האחות המדיום תרבות של מלא התפשטות explants ולתקן את התאים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS.
הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות ומשקפי מגן בטיחות כדי למנוע העור, קשר עין.
תקופת דגירה של 10 דקות-RT, ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
Permeabilize התאים לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 0.1% (v/v) בסרום עז נורמלי טריטון X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (וי/v) ב- PBS למשך 30 דקות בשטיפת RT. פעמיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS ו להסיר את המדיום הכביסה על ידי יניקה עדינה.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות למשך הלילה בשלב זה.
כתם תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים נגד ראשי-CD31 מדולל 1:50 ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS בן לילה ב 4 º C. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
לזהות נוגדנים העיקרי המאוגד על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים אנטי חולדה עם התווית fluorescently עז משני 1:200 מדולל ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS עבור h 1 RT. הגן על צלחות microtiter מן האור על ידי גלישת בנייר אלומיניום או על-ידי הצבת בחדר חשוך. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
להטביע תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של הרכבה בינונית. תקופת דגירה של ~ 1 h ב- RT עד המדיום הרכבה התחזק. חנות צלחות microtiter ב RT או ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
תמונה מקלעת כלי הדם של allantois explants תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם × 5 או 10 × אובייקטיבית, מסנני קרינה פלואורסצנטית מתאימים.
הערה: להחליפן בתמונות של מקלעת כלי הדם CD31-חיוביים של allantois התפשטה לגמרי מוצגות באיור3. סמנים אחרים עבור מקלעת כלי הדם, כגון נוגדנים מכוונת נגד Flk-1, טיסה, העניבה-1 או 2 העניבה יכול לשמש היטב¹⁶.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד, explant allantoides מאתר ex-vivo, ומפרט את ההערכה איכותי של הקובץ המצורף allantois α4β1 אינטגרין, תהליך קריטי במהלך ויוו chorioallantoic פיוז'ן. התוצאות נציג באיור איור 1A–H מדגימים את השלבים רצופים של בידוד allantois החל מהרחם בהריון. אימהית רקמות המקיפים את הקרניים הרחם, כגון רקמת שומן וכלי (איור 1 א') מוסרות, העוברים הם גזור מן רירית הרחם אופנה הדרגתיים לאחר פתיחת את השכבה שרירי הרחם (איור 1B- E). לאחר מכן, מוסרות רקמות אימהי אחרות כגון שק החלמון הקודקוד והחרוט ectoplacental (איור 1E, F). איור 1 ג'י - H מראה כי הטכניקה כוללת ניתוח allantois extraembryonic מן שק החלמון, השתייכות extraembryonic ו- vascularized מאוד. לפיכך, allantoides מבודדים לפי פרוטוקול זה הינם בעיקר ללא זיהום אימהי או עובריים (תוספת) ברקמות חוץ allantois.

איור 2 מדגים כי הגודל והצורה של allantoides מעוברים טריים ביתור בהמלטה בודד אחד יכול להשתנות במידה ניכרת¹⁴. Allantoides של העוברים wildtype C57BL/6J גזור-E 8.5 היה מורפולוגיה מוארך של 74% מהמקרים (45 של העוברים שנותחה 61), כפי שמוצג באיור 2 ו- H איור 1. עם זאת, ב- 15% (9/61) של העוברים, allantoides היו קטנים יותר במידה ניכרת, יותר מעוגל (ראה התייחסות¹⁴) ו- 11% (7/61) של העוברים עדיין לא גיבש allantois גלוי על ביצוע ניתוח. למרות הטרוגנית צורות וגדלים בנקודת זמן ההתחלה של allantois explant התרבות (איור 2, לוחות –h), allantois מצורף, התפשטות מלאה על קיבוע α4β1 אינטגרין נצפתה בתוך 12 שעות בכל של allantoides טרי מבודד 54 גזור מעוברים של המלטות שבעה. למרות זאת, צורות וגדלים של explants לאחר 12 שעות של תרבות היו מעט הטרוגנית (איור 2), המשקף את allantoic מורפולוגיות שונות בנקודת ההתחלה של וזמינותו.

איור 3 מראה של immunocytochemical מכתים עבור תאי אנדותל CD31-חיוביות allantoides מצורף במלואו לאחר 24 שעות של התרבות explant, אשר מאשר explants היה פירט מקלעת וסקולרית ובשלב זה הזמן ', כמו הצפוי⁹ ^, ¹⁶. תרבויות allantois חסיד כזה יכול לשמש כדי ללמוד היווצרות כלי דם במבחנה⁹. לפיכך, explants allantois של מתודולוגיה הציג תשואות כי ניתן בקלות בתרבית ex-vivo, גשר עם קודם לכן פרסם מחקרים ניסיוניים⁹^,¹⁶.

הפרוטוקול קובע את המסגרת המבדק מבוסס מיקרוסקופיה של קובץ מצורף allantois בנקודות זמן מוגדרים מראש, כגון לאחר 12 שעות או 24 שעות של תרבות explant. ניתן להעריך את התוצאות באופן איכותי (מצורף חלקי/מלא או מלא, הפצת בנקודת זמן נתון – כן/לא). כיוון explant אותו יכולה להיות שוב ושוב דמיינו הבקיע, ניתוח זה משקף שמאפייני הפרט allantois explant תרבויות לאורך זמן. בנוסף, היווצרות מקלעת כלי הדם בקבוע, מיטה explants יכול להיות מוערך (איור 3).

איור 1: נציג נכנס דיסקציה allantois. (A) פירוט תצוגה של קרן הרחם מבודד. ניצנים הרחם המכיל את העוברים שסומנו על-ידי כוכבים; רקמת שומן, בכלי הדם המקיפים את הצופר הרחם נראים מצד שמאל. (B) מבט רותמי (רירית הרחם) לאחר הסרת השכבה השרירי של הרחם. Vascularized מאוד, mesometrial בציצית רותמי מכוון שמאלה, החלק אנטי-mesometrial (מסומן עם כוכב) המכיל את העובר מכוון ימינה. (C) צד הצג של הקוטב ביתור anti-mesometrial של רותמי (מסומן עם כוכב). החץ מציין את מיקומו של העובר. מבט מלמעלה (D) של conceptus (חץ) מוקף שק החלמון הקודקוד לאחר הסרת חלקי רותמי שמסביב. (E, F) נציג נופי והשלבים ב. הקרע של העובר (חץ). החץ מצביע על שק החלמון. ב- (E), קונוס ectoplacental (epc) מוצגת בצד הימין. (G) חיתוך חלקי של העובר (חץ) מתוך שק החלמון (חץ). Allantois מסומן עם כוכב אדום. (H) מבודד העובר (חץ) עם allantois (הכוכב האדום). המיקום שבו allantois יהיה לחתוך מאתר הבזליים ההכנסה שלו בקצה האחורי של העובר הוא מסומן קו אדום שבור. התמונות צולמו ב- stereomicroscope עם טווח זום 8:1. כל סולם ברים הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הטרוגניות הצורות והגדלים של allantoides. 8 allantoides (–h) היו מבודדים מעוברים של המלטה אחת אחת. השאיר לוח, allantoides מיד לאחר ניתוח (0 h). לוח הנכון, allantoides אותו לאחר 12 שעות של תרבות explant. Explants מחוברים בחוזקה, התפשטו התאים mesenchymal. Explants מוקפים בעיגול לדמיין explant גדלים. התמונות צולמו על מיקרוסקופ מצויד אופטיקה חדות שלב ו 5 × (פאנל שמאלי) או מטרה 10 × (לוח נכון). כל קווי מידה הם 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: היווצרות כלי דם מקלעת בתרבויות explant allantois. Allantoides היו גזור, explanted על α4β1 קיבוע אינטגרין כמפורט בפרוטוקול הנוכחי. Explants היו תרבותי במשך 24 שעות ביממה, תאי אנדותל כלי הדם מקלעת היו מוכתמים באמצעות נוגדנים anti-CD31 הראשית ומתויגים fluorescently נוגדנים משניים. תאי אנדותל מופיעים בצבע ירוק. התמונה העליונה מציגה את מקלעת כלי הדם כולו באזור המרכזי explant allantois ייצוגית. התמונה צולמה במיקרוסקופ מצוידים אופטיקה פלורסצנטיות, מטרה 5 ×. סולם בר, 500 מיקרומטר. הלוחות התחתון שני הם תמונות הגדלה גבוהה יותר של עוד explant allantois גזור ותרבותית תחת באותם התנאים. ניתן לראות מבנים כלי דמוי ותאי אנדותל בודדים. התמונות צולמו על מיקרוסקופ קונפוקלי; גודל ברים, 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בנוכחות סרום, המהווה מקור עשיר של מולקולות פרו-דבק מטריצה חוץ-תאית כגון fibronectin, allantois explants ייצמד בקלות שונים פלסטיק, זכוכית או מסנן משטחים⁹^,¹⁶. לפיכך, אם מטרת וזמינותו שבוצעו היא לחקור באופן ספציפי את האפקט של שינוי גנטי או כל טיפול אחר על הקובץ המצורף allantois מתאושש α4β1, זה קריטי כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים (למשל, עם סרום שור אלבומין) לאחר ציפוי המשטחים עם אינטגרין ולפני המקננת עם סרום המכיל מדיה.

החזקה הראשונית של allantois explants כדי α4β1 קיבוע אינטגרין הוא מאוד רגיש לתנועה, הלוחות תרביות רקמה יש לכן להשאיר ללא הפרעה במשך פרק זמן שנקבע מראש (למשל, במשך 12 שעות) לפני הניקוד allantois קובץ מצורף. שימו לב כי הזמן הנדרש עבור קשר יציב למבנה עם המצע עשוי להשתנות המתח שנותחה העכבר או את הריכוז של אינטגרין קיבוע α4β1.

הדרישה של המערכת VCAM-1/α4β1-אינטראקציה מוצלחת היתוך chorioallantoic היא הוקמה בחוזקה¹¹^,¹²^,¹³. בנוסף, מטריצה חוץ-תאית מולקולות כגון fibronectin, collagens ומולקולות אחרות עניין יכול להיות גם. מרותק למיטה, השתמשו בשם דיאלקטריים "chorio-מימטי".

קובץ מצורף chorioallantoic תלויה המערכת האינטראקציה בין VCAM-1 וα4β1 אינטגרין השותף שלה מחייב. בתוך הרחם, מצורף chorioallantoic ו היתוך הבאים יכולה להתרחש רק כאשר allantois האריך מספיק כדי להפוך קשר עם chorion. לאור ההשתנות פיזיולוגיים בגדלים allantois בשלב התפתחותי מסוים, קובץ מצורף chorioallantoic פיוז'ן מתקיימים מתישהו בין E 8.0 E 9.0 (טווח, E 9.25 7.5-E)¹⁴^,¹⁶. להציג שיטות במיוחד לימוד תהליך ארעי allantois מהתופעה ה שליה צלחת בתוך הרחם העכבר החי אינם זמינים. במקום זאת, ניתוחים מתמקדים בעיקר על הקביעה מפרך של פיוז'ן chorioallantoic על ידי הערכה היסטולוגית של למשל, allantoic מתפשט על פני השטח של chorion ופיתוח של השכבה המבוך-יחיד, שנקבע מראש זמן הצבע¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶. ניתוח זה קצה לא יכול להפלות בין פגמים במיוחד בשל החזקה לקוי של allantois chorion ואפקטים תלויי-chorion, והוא מוגבל על-ידי ההשתנות הגלום בשלבים התפתחותיים העובר, allantoic גודל. כפי שפורט תחת נציג תוצאות, ההשתנות פיזיולוגיים בגדלים allantois עלול לגרום עיכוב היחסי פיוז'ן chorioallantoic ב ~ 26% של C57BL/6J wildtype עוברי. מבחינה סטטיסטית, כמעט שתיים תוך 7 עכברים בהריון ולכן היה שהקריבה עצמה מוקדם מדי (61 העוברים מ 7 המלטות, גודל המלטה הממוצע 8.7), אשר מיתרגם בצורך של משמעותית לגידול העודף ללימודי ורחבה. מעניין, ניסויים המיקרוכירורגית נחשפו chorion זה, כבר המוסמכת להתמזג עם allantois בשלב 1 של זוג somite, ומוצגים כי allantois פיוז'ן מקסימלי מתוקף העוברים עם 3-5-somite-זוגות-¹⁴. לפיכך, תאים chorioadhesive של allantois הם בנוי באופן פונקציונלי המוסמכת לפני ההחזקה בפועל chorioallantoic vivo בתוך. הניתוח לשעבר עם רחם מהתופעה allantois ליגנדים קיבוע, כפי שהוצג כאן, לכן יחסית ללא תלות בגודל נתון allantois. ומכאן, אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה עוקף פגמים allantois התארכות, מתמקד בשלב הבא היווצרות השליה, קרי, chorioallantois המצורף. גישה זו עשוי לשמש ובכך להבחין בין פגמים התארכות allantois chorioallantois המצורף מוטציות גנטיות העכבר.

לעומת השיטה המסורתית של שאיפה allantois מנקודה ההחזקה שלה העובר באמצעות פיפטה בפה¹⁶, בפרוטוקול הנוכחי משתמשת בגישה חיתוך ידני, allantois לאחר מכן מתבצע באמצעות טיפים פיפטה דיזה גדול . יתרון חשוב של allantois השאיפה היא כי בשיטה זו מונע הטיפול ברקמה ישירה. חיתוך בהם ומתמרנים את allantois עלול לגרום נזק תאי chorioadhesive נדן החיצוניים של mesothelium allantoic. ובכל זאת, חותכים את allantois עם מלקחיים בהצלחה שימש בעבר בתרבויות ex-vivo של רקמות pre-placental¹⁷, את קינטיקה של allantoic explant המצורף, המורפולוגיה של התרבויות explant המתואר המחקר הנוכחי דומים שהתפרסמו נתונים בהתבסס על בידוד allantois על ידי השאיפה¹⁶. ממצאים אלה מראים כי chorioadhesive תאים נשמרים חסרונך על חיתוך ידנית allantois, כי בידול explant לא מוטרד בגסות, כפי שצוין על ידי היווצרות של endothelia CD31-חיוביות. ישיר חיתוך allantois גם מציעה את האפשרות לנתח רק את העליון שני שליש allantois המבטאים VCAM-1¹³, ומבטיחה זה פחות זיהום עם שק חלמון-derived תאים, אשר ייתכן ייחתך בבסיס של allantois לאחר השאיפה allantois¹⁸.

Ex הרחם הניתוח של allantoic explant הדבקה על הנשיכה, α4β1 רקומביננטי אינטגרין מספק של הבדיקה איכותי של צעד אחד חשוב, הראשונית הנדרשת עבור פיוז'ן chorioallantoic, דהיינו, יחסי הגומלין בין המערכת בין VCAM-1 לידי ביטוי allantois, α4β1 אינטגרין לשפות אחרות של mesothelium כוריוני, שהוא נגזרת של והמזודרם extraembryonic. אף על פי כן, למרות מולקולות אדהזיה שני אלה מזוהים עיקרון שחקנים in היתוך chorioallantoic, ~ 50 אחוז העוברים עם homozygous knockout מוטציות בגן אינטגרין VCAM-1 או α4 עוברים פיוז'ן chorioallantoic ויוו¹¹ ^,¹²^,¹³. בגלל זה penetrance לא שלם, שמחוץ השיטה המתוארת בפרוטוקול הנוכחי לא ניתן מספיק לשלול דרישה עבור אלה מולקולות אדהזיה שני דגמים גנטיים עם כישלון של פיוז'ן chorioallantoic.

בתנאים פיזיולוגיים, α4β1 אינטגרינים מוטבעות קרום הפלזמה של trophoblasts כוריוני, משולבים לרשת של חלבונים מבניים איתות לשתף פעולה כדי לווסת את הידבקות תאים תאים (ו מטריצה תא) ¹⁹. כמו עם רוב במבחנה הרדוקציוניסטית, המורכבות של הממשק איגוד VCAM-1 שליה היא רק המודל במידה מוגבלת מאוד של אינטגרין קיבוע α4β1. מלבד חוסר פוטנציאלי של תשומות מבנית או איתות חשוב אחרים שמקורם את chorion שלמות במערכת זו, סביר כי רק שבריר של אינטגרינים זה הם ותשמרו על משטח קשיח מימדי קיימים ב- active, קונפורמציה איגוד המוסמכים, 'פתח'.

השיטה הציג קירוב צעד של allantois chorion הקובץ המצורף מוקדם והפצת, ואת יכולה גם דוח על התפתחות מקלעת כלי הדם allantoic בשילוב עם הניתוח של היווצרות כלי⁹. עם זאת, הגישה הנוכחית לא דגם את הפלישה chorion על ידי הלבלוב אנגיוגנזה מתווכת על ידי תאי אנדותל allantoic, ואינם משקפים מורפוגנזה מסעף מאת chorion, אשר הוא תהליך חיוני עבור פיוז'ן chorioallantoic ו ההתפתחות הבאים של המבוך היפרדות¹⁰.

באמצעות שלב חדות או מיקרוסקופ התערבות דיפרנציאלית בשילוב (דו-) אוטומטית וניתוח תמונות, השיטה שהוצגו יכול להיות מיושם במסכים ורחבה לניתוח הראשוני של עיכוב או שנכשל המצורף allantoic חוץ גופית בתוך. בנוסף הניתוח של העכבר מוטציות, השיטה עשוי להיות עניין למסך את ההשפעות של תרופות, פתוגנים, מטבוליטים או סוכנים סביבתיים על קובץ מצורף allantoic.

במוטציות רבות העכבר, מצורף chorioallantoic נכשלת להתרחש, למרות את allantois, את chorion מופיעים שפיתחתי בדרך כלל. יתר על כן, מוטציות להציג קובץ מצורף chorioallantoic פגמים בדרך כלל להציג penetrance לא שלם¹^,²^,¹⁰. זה יהיה חשוב לחקור אם אלו גנים שונים פונקציונלית מאוד להשפיע על מסלולים מולקולריים משותף ו/או תהליכים תאיים. הדמיה חיה של explants allantois נגזר מוטציות העכבר יש פוטנציאל התירי מנגנונים אלה. לדוגמה, בתאי נדן החיצוני של allantois גזור יכול להיקרא עם צבעי פלורסנט חיוני (כגון DiI או דיו lipophilic carbocyanine המשדרים¹⁶^,¹⁸) התמונה אדהזיה והפצת אירועים, או לעקוב אחר תא הגירה בזמן אמת. בנוסף, כתבים פלורסנט זה לדמיין את החלבונים שלד התא או אדהזיה עשויה להיות אינפורמטיבי.

לאחרונה, מערכת תרבות משותפת שמחוץ allantoides מאתר קובץ מצורף מראש, chorions שתיארנו, גישה זו שימש בהצלחה לחקור את האירועים המתרחשים לאחר מצורף chorioallantoic, כגון שכבה המבוך היווצרות¹⁷. הניתוח של allantois יעילות המצורף על קיבוע chorions מבודד שונים (למשל, מהונדסים גנטית) מודלים העכבר עשוי להניב תובנות חדשות שחקנים מולקולרית מסלולים המפקחים על השלבים המוקדמים בהתפתחות מאתר השליה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי SFB688 פתוח דויטשה (ל א).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca²⁺ and Mg²⁺.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO₃ but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.