Descrevemos um ensaio em vitro de fixação corioalantoicas de modelo, o primeiro passo na formação da placenta. O protocolo demonstra a cultura de dissecção e explante de murino allantoides em imobilizado α4β1 integrina. Acessório de alantoide é avaliado microscopicamente em pontos de tempo pré-determinado.
A placenta é essencial para o crescimento e o desenvolvimento de embriões de mamíferos. Por este motivo, inúmeras alterações genéticas e insultos ambientais também prováveis que perturbam o desenvolvimento da placenta ou função podem causar perda de gravidez precoce em ratos e seres humanos. No entanto, simples em vitro ensaios para a tela para potenciais efeitos sobre a formação da placenta são escassos. Aqui, focalizamos o primeiro e fundamental passo na formação da placenta, que consiste de penhora do alantoide com o cório de modelagem. Nós descrevemos um método para avaliar rapidamente o acessório de explantes alantoico na imobilizado α4β1 integrina, que serve como substrato cório-mimética. Esta abordagem in vitro permite uma avaliação qualitativa do acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em pontos diferentes vez consecutiva. O protocolo pode ser usado para investigar o efeito de mutações específicas do mouse, drogas ou vários fatores ambientais que têm sido associados a complicações na gravidez ou perda fetal no alantoide acessório ex vivo.
A placenta é indispensável para o crescimento embrionário e desenvolvimento no ambiente uterino. Constitui a interface para o oxigênio, metabólito e troca de nutrientes entre a circulação fetal e materna e também funções como órgão endócrino e imunológico. Qualquer insulto endógeno ou exógeno que prejudica o desenvolvimento da placenta pode levar a retardo de crescimento intra-uterino, perda fetal ou complicações na gravidez, tanto em ratos e em seres humanos1. Enquanto o número de mutações específicas do mouse que causam fisiologia placentária anormal continua a aumentar2, com 219 genótipos atualmente listados no site da informática do genoma do rato (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), muitos destes fenótipos não são bem compreendidos, do ponto de vista mecanicista. Além de alterações genéticas, drogas pequena molécula, anticorpos monoclonais, toxinas, agentes patogénicos, metabolitos em excesso ou vários agentes ambientais podem afetar desenvolvimento de placenta e função3,4,5 , 6 , 7. ainda, simples em vitro ensaios que passos críticos do modelo em desenvolvimento de placenta são escassos.
Desenvolvimento placentário murino é iniciado no início midgestation, quando o alantoide (o precursor do desenvolvimento do cordão umbilical) emerge da extremidade posterior do embrião como um broto que cresce em direção do córion8. Chorioadhesive células na camada exterior do bud alantoico mediam o apego e a difusão do alantoide na superfície do cório (corioalantoicas “fusão”). O córion dobra-se posteriormente em vilosidades no qual vasculatura do alantoide cresce para formar o labirinto, a camada interna da placenta onde nutrientes e oxigênio são trocados entre o sangue materno intimamente justapostos sinusoides e vasos embrionários9 ,10.
O anexo do alantoide para córion é o passo inicial e fundamental na formação do labirinto, e defeitos neste processo estão entre as causas mais comuns de letalidade embrionária em midgestation1. Embora um número de mutantes de rato tem sido descrito onde corioalantoicas ceda a ocorrer10, e o banco de dados do MGI atualmente lista 108 mutantes de rato que caracterizam-se por fusão corioalantoicas anormal (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), a interação intercelular entre as células vasculares adesão molécula-1 (VCAM-1, expressado na mesoderme alantoico) e α4β1 integrina (expressado no mesotélio gonadotrofina coriônica, que é derivado do mesoderma extraembryonic) parece ser indispensável para a ligação corioalantoicas e fusão11,12,13. Coloração imuno-histoquímica de todo-monte selvagem-tipo embriões tem mostrado que o VCAM-1 é expresso dentro os dois terços distais do caule alantoico no dia aproximadamente embrionário (E) 7,513 (palco do somite 1-4), e que sua expressão permanece elevada durante corioalantoicas anexo e – fusão11,12. Falha de alantoico apego ao córion normalmente é detectada por análise histológica de botões do útero. No entanto, alantoide tamanhos são fisiologicamente altamente variáveis entre e mesmo dentro de ninhadas do mesmo grau de desenvolvimento14, e o alantoide só pode anexar o córion quando atingiu um tamanho suficiente para fazer contato físico. Reflectindo esta variabilidade natural, anexo corioalantoicas ocorre em algum momento entre ~ E 8.0 E 9.0 e no uteroe uma avaliação estatisticamente confiável deste processo pela histologia depende, portanto, a análise de um grande número de conceptuses para obter suficiente amostras na fase do desenvolvimento apropriado.
Aqui, descrevemos um método para avaliar fixação alantoico ex utero que é menos dependente do tamanho do alantoide. Demonstramos a dissecação de embriões do rato e seus allantoides desde o útero de ratos grávidas ~ 8 dias post coitum (dpc; dpc 0.5 designa a detecção de um tampão vaginal), e a cultura subsequente do alantoide explants na α4β1 imobilizado integrinas. Este método permite uma avaliação rápida, funcional de acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em paralelo e em pontos diferentes de tempo sucessivos. O protocolo pode ser usado para tela para efeitos de diversos fatores ambientais, drogas ou mutações específicas no alantoide acessório ex vivo.
Na presença de soro, que é uma fonte rica de moléculas pro-adesivo da matriz extracelular como a fibronectina, explantes alantoide prontamente irão anexar vários plástico, vidro ou superfícies de filtro9,16. Assim, se o objectivo do ensaio realizado é especificamente investigar o efeito de uma modificação genética ou qualquer outro tratamento no acessório alantoide para imobilizado α4β1, é fundamental para bloquear sites de ligação não-específi…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (para A.G.).
C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic. |
10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
a4b1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
a-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |