Summary
يصف لنا فحص في المختبر لنموذج مرفق تشوريوالانتويك، الخطوة الأولى في تكوين المشيمة. البروتوكول يوضح ثقافة تشريح و explant مورين اللانتويديس على إنتغرين α4β1 المعطل تداولها. يتم تقييم مرفق allantois مجهريا في نقاط زمنية محددة سلفا.
Abstract
المشيمة أمر ضروري لنمو وتطور أجنة الثدييات. ولهذا السبب، العديد من التعديلات الوراثية والشتائم البيئية كما يحتمل أن تخل التنمية المشيمة أو وظيفة يمكن أن يسبب فقدان الحمل المبكر في الفئران والبشر. ومع ذلك، تفتقر إلى فحوصات بسيطة في المختبر الشاشة للآثار المحتملة على تكوين المشيمة. هنا، نحن نركز على النمذجة الخطوة الأولى والحاسمة في تكوين المشيمة، والذي يتألف من إرفاق اللانتويس للمشيمة. يصف لنا طريقة لتقييم سرعة إلحاق explants الانتويك في إنتغرين α4β1 المعطل تداولها، هو بمثابة ركيزة كوريو mimetic. ويمكن هذا النهج في المختبر تقييم نوعي للمرفق وينتشر سلوك explants allantois متعددة في نقاط زمنية مختلفة على التوالي. وقد يمكن استخدام البروتوكول للتحقيق في تأثير الطفرات الماوس المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة التي تم ربطها إلى مضاعفات الحمل أو فقدان الجنين على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.
Introduction
المشيمة أمر لا غنى عنه للنمو الجنينية والتنمية في بيئة الرحم. وهو يشكل واجهة للأكسجين المستقلب وتبادل المغذيات بين الجنين والأم الدورة الدموية، وأيضا وظائف كجهاز الغدد الصماء والمناعية. أي إهانة الذاتية أو الخارجية التي يعوق التنمية المشيمة يؤدي إلى تأخر النمو داخل الرحم، وفقدان الجنين، أو مضاعفات الحمل، في الفئران والبشر1. في حين لا يزال عدد الطفرات الماوس المستهدفة التي تسبب فسيولوجيا المشيمة غير طبيعي لزيادة2، مع الأنماط الجينية 219 المدرجة حاليا على الموقع الشبكي للمعلوماتية الجينوم الماوس (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/ MP:0010038)، العديد من هذه تعمل ليست مفهومة جيدا من وجهة نظر آليا. بالإضافة إلى التعديلات الوراثية، المخدرات جزيء صغير، والأجسام المضادة، السموم، مسببات الأمراض، والايضات الزائدة، أو مختلف العوامل البيئية قد تؤثر على وضع المشيمة والدالة3،،من45 , 6 , 7-بعد، بسيطة في المختبر فحوصات أن نموذج الخطوات الحاسمة في تطور المشيمة شحيحة.
التنمية المشيمية مورين هو بدأت في وقت مبكر ميدجيستيشن، عندما اللانتويس (سلف الإنمائية الحبل السري) ينبثق من نهاية الخلفي للجنين برعم أن ينمو نحو المشيمة8. التوسط تشوريواديسيفي الخلايا في الطبقة الخارجية من المهد الانتويك المرفق ونشر اللانتويس على سطح المشيمة (تشوريوالانتويك "الانصهار"). يطوي المشيمة فيما بعد إلى الزوائد التي ينمو المفرج اللانتويس شكل المتاهة، الطبقة المشيمية الداخلية حيث يتم تبادل المواد الغذائية والأكسجين بين دم الأم عن كثب محاذياً الكبدية والأوعية الجنينية9 ،10.
إرفاق اللانتويس للمشيمة هو الخطوة الأولى والحاسمة في تشكيل المتاهة، والعيوب في هذه العملية من بين الأسباب الأكثر شيوعاً للفتك الجنينية في ميدجيستيشن1. على الرغم من أن عددا من طفرات الماوس قد وصف مرفق تشوريوالانتويك فشل تحدث10، حيث يسرد قاعدة يتجاوزون حاليا 108 طفرات الماوس التي تتميز بها الشاذ الانصهار تشوريوالانتويك (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824)، التفاعل بين الخلايا بين الخلية والأوعية الدموية التصاق جزيء-1 (VCAM-1، أعرب عن ميسوديرم الانتويك) وانتغرين α4β1 (المعبر عنها في mesothelium المشيمة، المستمدة من اكسترامبريونيك mesoderm) يبدو أنه لا غنى عنه للحجز تشوريوالانتويك والانصهار11،،من1213. المناعي تلطيخ جبل كل البرية من نوع الأجنة قد أظهرت أعرب VCAM-1 داخل ثلثي القاصي من ساق الانتويك في اليوم تقريبا الجنينية (ه) 7.513 (المرحلة سميط 1-4)، وأن التعبير عن ما زال مرتفعا أثناء الحجز تشوريوالانتويك-والانصهار11،12. عادة يتم الكشف عن فشل مرفق الانتويك للمشيمة بتحاليل نسيجية من براعم الرحم. ومع ذلك، أحجام allantois متغير فسيولوجيا عاليا في بين وحتى داخل ليتر من نفس المرحلة الإنمائية14، وفقط إرفاق allantois للمشيمة عندما قد بلغ حجم كافية لجعل الاتصال الجسدي. يعكس هذا التغير الطبيعي، مرفق تشوريوالانتويك يأخذ مكان في وقت ما بين ~ ه 8.0 و E 9.0 في الرحم، وتقييم موثوق بها إحصائيا لهذه العملية عن طريق الأنسجة فتعتمد على تحليل عدد كبير من كونسيبتوسيس للحصول على عينات كافية في المرحلة التنموية المناسبة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب تقييم مرفق الانتويك خارج الرحم أقل اعتماداً على حجم اللانتويس. نظهر تشريح الأجنة الماوس وما اللانتويديس من يشكل الفئران الحوامل ~ 8 أيام ما بعد كويتوم (dpc؛ dpc 0.5 يعين الكشف عن المكونات المهبلي)، وثقافة اللاحقة من اللانتويس اكسبلانتس في α4β1 المعطل تداولها إينتيجرينس. هذا الأسلوب يتيح إجراء تقييم سريع الفنية المرفق وينتشر سلوك متعددة allantois explants بالتوازي وعند نقاط زمنية متتالية مختلفة. يمكن استخدام البروتوكول إلى الشاشة لآثار الطفرات المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر تربية الماوس اونترفرانكين ريجيرونج، وأجريت جميع التحاليل طبقاً للقوانين المعمول بها في كل من ألمانيا والاتحاد الأوروبي، والأنظمة المتعلقة برعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1-طلاء Microtiter لوحات مع إنتغرين α4β1 للثقافة Explant Allantois الرحم السابقين
- إعادة تشكيل إنتغرين α4β1 مورين المجففة بالتبريد في 200 ميكروغرام/مل في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). تمييع لتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل في حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني. ماصة 20 ميليلتر/بئر الحل إنتغرين α4β1 المخفف إلى العدد المطلوب من الآبار للوحة ميكروتيتير (allantois 1/جيد).
ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء عند طلاء آبار لوحة ميكروتيتير. - احتضان لوحات ميكروتيتير لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية بوضعها في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد.
- عناية نضح المادة طافية مع ماصة. استخدام الشفط لطيف وانحدر اللوحة تجنب لمس أسفل جيدا مع طرف ماصة. غسل الآبار مرتين بإضافة 50 ميليلتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) الثقافة المتوسطة مثل النسر المتوسطة تعديل (دميم 's دولبيكو)، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
- الخطوة الحاسمة: كتلة مواقع الربط مجاناً عن طريق إضافة من 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) 50 ميليلتر/جيدا/دميم واحتضانها ل ≥ 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية عن طريق وضع لوحات microtiter في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد.
ملاحظة: يمكنك إرفاق Allantois explants الأسطح المختلفة حضور المصل. ولذلك، يتحتم على منع المواقع غير محددة ملزمة، بعد طلاء explant الآبار مع إنتغرين، وقبل إضافة allantois تشريح للثقافة في المحتوية على مصل المتوسطة (راجع الخطوة 4، 4). - إبقاء الآبار المغلفة في عرقلة الحل في 37 درجة مئوية حتى حاجة في الخطوة 4، 4.
2-الرحم تسلخ من ماوس حوامل في Dpc 8
ملاحظة: تقليل معدلات الحمل إيجابية كاذبة بالوزن مكسب التمييز15.
- التضحية الماوس بخلع عنق الرحم. تطهير المعطف في منطقة البطن برش عليه مع الإيثانول 70% (v/v).
ملاحظة: ارتداء قفازات عند التعامل مع الفئران. القتل الرحيم بخلع عنق الرحم دون المسكنات يمنع التلوث الكيميائي allantois، التي قد تتداخل مع مرفق اللانتويس. - فتح الجلد البطن بإجراء شق صغير في خط الوسط مع المقص. استخدام أصابع القفاز للاحتفاظ بأعلى وأسفل الشق الجلد، وسحب الجلد بعيداً صوب الصدر وذيل الماوس.
- فهم الصفاق بالملقط. ناحية أخرى، جعل شق على شكل V من الأمامي نحو الخلفي باستخدام مقص ونقل الأنسجة بعيداً لفضح تجويف البطن. استخدام الملقط دفع الأمعاء إلى جانب واحد من أجل الوصول إلى الرحم.
- قم بتحديد موقع قرنان الرحم. عقد عنق الرحم (الجزء والذيلية) مع الملقط وقطع الأربطة مع مقص جيد. ثم فصل كل ابواق الرحم بجب أوفيدوكتس مع المقص.
- استخدام الملقط لنقل الرحم إلى 10 سم معقمة تحتوي على طبق العقيمة، درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني. إزالة الأنسجة الدهنية، والأوعية والأعصاب المحيطة بقرون الرحم مع الملقط غرامة و/أو المقص (الشكل 1A).
3. تشريح الجنين
ملاحظة: الخطوات التالية تحت ستيريوميكروسكوبي مجهزة بمجموعة تكبير 8:1.
- فصل الأجنة بقطع ما بين المواقع غرس مع المقص. فهم بطانة الرحم العضلية براعم الرحم مع الملقط وتسحبه بعيداً لفضح أوروبية (الشكل 1B).
- استخدام الملقط، نقل براعم الرحم إلى طبق 10 سم جديدة تتضمن العقيمة، "الرايت برنامج تلفزيوني".
- إصلاح أوروبية حول الجنين مع نصائح الملقط.
- جعل شق الجانب ميسوميتريال المضادة لاوروبية مع غرامة الملقط (الشكل 1)، وقشر أوروبية بعيداً مع الملقط لفضح الجنين (الشكل 1).
ملاحظة: القطب ميسوميتريال من أوروبية هو فاسكولاريزيد جداً ويمكن أن تكون أوسع في قاعدتها من الجزء ميسوميتريال المضادة، التي تحتوي على الجنين ويظهر اشحب. - تشريح الجنين بالملقط (الشكل 1E، F).
- باستخدام ملعقة صغيرة-، نقل الجنين إلى قطره PBS العقيمة الواردة في صحن معقم 3.5 سم.
- نقل الجنين إلى قطره جديدة من برنامج تلفزيوني في نفس الطبق 3.5 سم باستخدام ملعقة صغيرة-، وتشريح الجنين من كيس ألمح باستخدام الملقط (الشكل 1، ح).
- بشكل اختياري، إذا لزم الأمر (مثلاً، للتنميط بتفاعل البوليميراز المتسلسل)، نقل كيس ألمح في أنبوب عقيم يسفط مع ~ 5 ميليلتر PBS في تلميح ماصة فوهة كبيرة 200 ميليلتر. مخزن في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: الأم الأنسجة (أي، كيس الصفار الجدارية بما في ذلك الغشاء رايشرت والمخروط اكتوبلاسينتال) التي قد تلوث كيس الصفار الإعداد يؤدي إلى نتائج خاطئة التنميط. إزالة هذه الأنسجة أسهل قبل تشريح الجنين من كيس ألمح.
4-allantois التشريح والثقافة الرحم السابقين في إنتغرين α4β1 المعطل تداولها
- قص اللانتويس من موقع الإدراج القاعدية في نهاية مؤخرة الجنين باستخدام الملقط غرامة (الشكل 1 ح).
- بشكل اختياري، إذا كان التدريج التنموية المطلوبة، عد أزواج سميط للجنين بالفحص البصري باستخدام مجهر مجهزة مع مرحلة التباين البصريات و 5 × 10 × الهدف.
ملاحظة: يمكن أن تمدد الجنين بالملقط لتسهيل عد سميط. مرفق تشوريوالانتويك والانصهار يحدث بين ه 8.0 و E 9.0 في الأجنة مع أزواج سميط 6 ≥. ويبدأ تحول في الأجنة مع أزواج سميط 6-8. - ماصة 40 ميكروليتر/بئر دميم وتستكمل مع المصل البقري الجنين 10% (v/v)، ولام الجلوتامين، والمضادات الحيوية في العدد المطلوب من الآبار لوحة microtiter المغلفة مسبقاً (انظر الفرع 1).
- جمع allantois العائمة التي يسفط مع ~ 5 ميليلتر PBS إلى فوهة كبيرة من طرف ماصة 200 ميليلتر. نقل allantois 1/جيدا.
- احتضان اللانتويديس بوضع لوحات microtiter في حاضنة استنبات الأنسجة هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO2) على سبيل المثال، 6 و 12 و 24 ساعة. من أجل منع التدخل مع مرفق allantois، لا تقم بتحريك لوحات ميكروتيتير بين هذه النقاط الزمنية.
- في كل مرة نقطة، نقاط مرفق اللانتويس (مثلاً، لا allantois العائمة/مرفق allantois المرفقة جزئيا أو كلياً؛ تماما انتشار allantois) استخدام مجهر مجهزة بمرحلة التباين أو فرق التدخل التباين البصريات و 5 × أو 10 × الهدف (الشكل 2).
ملاحظة: تظهر أمثلة تمثيلية اللانتويديس طازجة معزولة وتعلق تماما في الشكل 2. خارج الرحم، تعلق طرف القاصي اللانتويديس المعزولة من الفئران C57BL/6J wildtype ضمن ح 4-6 (هذا هو المشار إليها كمرفق جزئية allantois)، ومرفق كامل من اللانتويس كاملة ويتحقق داخل ~ ح 12 من الثقافة. ح 18-24، explant قد سويت بالأرض ويفترض شكل دائري (المشار إليها على أكمل وجه انتشار allantois) مع9،CD31-إيجابية ضفيرة وعائية16.
5-توكيدي تلطيخ من اللانتويس اكسبلانتيد ل CD31 ماركر خلية غشائي
- نضح وسيلة الثقافة تماما انتشار explants وإصلاح الخلايا بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 4% (w/v) بارافورمالدهيد/برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: بارافورمالدهيد السامة. ارتداء قفازات ونظارات واقية لتجنب الاتصال بالعين والجلد. - احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت، ثم نضح المادة طافية. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
- بيرميبيليزي الخلايا ومنع المواقع غير محددة ملزمة بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا من 0.1% (v/v) مصل الماعز العادي X-100/0.1% تريتون (w/v) BSA/10% (v/v) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في غسل الرايت مرتين بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً بين عشية وضحاها في هذه المرحلة. - وصمة عار في الخلايا بإضافة 20 ميليلتر/جيدا من الأجسام المضادة CD31 المضادة الأساسي المخفف 01:50 في 0.1% (w/v) جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
- الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بإضافة 20 ميليلتر/جيدا من الماعز الثانوي المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة الفئران المخفف 1: 200 في 0.1% (w/v) جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 1 في حماية الرايت microtiter لوحات من الضوء بالالتفاف في رقائق الألومنيوم أو بواسطة وضع في غرفة مظلمة. أغسل ثلاث مرات بإضافة 40 ميكروليتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني، وإزالة المتوسطة الغسيل بالشفط لطيف.
- تضمين الخلايا بإضافة 20 ميليلتر/البئر متوسطة المتصاعدة. احتضانها ل ~ ح 1 على RT حتى قد وطدت المتوسطة المتصاعدة. تخزين لوحات microtiter RT أو 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
- صورة ضفيرة الأوعية الدموية اللانتويس اكسبلانتس تحت مجهر fluorescence مجهزة × 5 أو 10 × الهدف ومرشحات مناسبة الأسفار.
ملاحظة: تظهر الصور التمثيلية لضفيرة الأوعية الدموية CD31 إيجابية من اللانتويس انتشار تماما في الشكل 3. علامات أخرى لضفيرة الأوعية الدموية، مثل الأجسام المضادة الموجهة ضد فلك-1، أنطوني، التعادل-1 أو 2 التعادل يمكن استخدامها ك جيدا16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول وصف أسلوب لعزل و explant اللانتويديس مورين السابقين فيفو، وتفاصيل التقييم النوعي لمرفق allantois إنتغرين α4β1، وهي عملية حاسمة خلال في فيفو تشوريوالانتويك الانصهار. تدل نتائج الممثل هو مبين في الشكل 1 ألف–ح الخطوات المتعاقبة من العزلة allantois بدءاً من الرحم الحامل. تتم إزالة الأنسجة الأم التي تحيط بقرون الرحم، مثل الأنسجة الدهنية والسفن (الشكل 1A)، ويتم تشريح الأجنة من بطانة الرحم بشكل تدريجي بعد فتح طبقة الرحم العضلية (الشكل 1B- ه). وبعد ذلك، تتم إزالة الأنسجة الأمهات الأخرى مثل كيس ألمح الجدارية والمخروط اكتوبلاسينتال (الشكل 1E، F). الشكل 1 - ح يظهر أن التقنية تضم تشريح اللانتويس اكسترامبريونيك بعيداً عن كيس ألمح، الأنسجة اكسترامبريونيك وشدة فاسكولاريزيد آخر. وهكذا، اللانتويديس معزولة ووفقا لهذا البروتوكول خالية إلى حد كبير من تلويث أنسجة الأم أو الجنين (إضافية) خلاف اللانتويس.
الشكل 2 يوضح أن حجم وشكل من اللانتويديس من أجنة طازجة تشريح في القمامة واحد واحد يمكن أن تختلف إلى حد كبير14. اللانتويديس C57BL/6J wildtype الأجنة تشريح في 8.5 ه كان مورفولوجيا ممدود في 74 في المائة من الحالات (45 أجنة تم تحليلها 61)، كما هو مبين في الشكل 2 و الشكل 1 ح. بيد أنه في 15% (9/61) من الأجنة، اللانتويديس كانت أصغر حجماً ملحوظا وأكثر تنوعاً (انظر المرجع14) و 11% (7/61) من الأجنة لم لم يشكل allantois مرئية في وقت تشريح. على الرغم من الأشكال غير متجانسة والأحجام في الوقت نقطة انطلاق allantois explant الثقافة (الشكل 2، لوحات –ح)، مرفق allantois، ولوحظ انتشار كامل على إنتغرين α4β1 المعطل تداولها ضمن ح 12 في جميع من اللانتويديس طازجة معزولة 54 تشريح من الأجنة من سبعة ليتر. ومع ذلك، كانت الأشكال والأحجام من اكسبلانتس بعد 12 ساعة ثقافة غير متجانسة إلى حد ما (الشكل 2)، يعكس مورفولوجيس الانتويك مختلفة في نقطة انطلاق المقايسة.
ويبين الشكل 3 immunocytochemical تلطيخ لخلايا بطانية CD31 الإيجابية في اللانتويديس المرفق تماما بعد 24 ساعة ثقافة اكسبلانت، والذي يؤكد أن اكسبلانتس وضعت ضفيرة الأوعية الدموية بواسطة هذه النقطة الزمنية، ك المتوقع9 , 16-يمكن استخدام مثل هذه الثقافات allantois ملتصقة بدراسة تشكيل الأوعية الدموية في المختبر9. ومن ثم، explants allantois غلة المنهجية المقدمة التي يمكن بسهولة مثقف السابقين فيفو، بالاتفاق مع سبق نشر الدراسات التجريبية9،16.
يحدد البروتوكول إطار للتقييم القائم على الفحص المجهري لمرفق allantois عند نقطة زمنية محددة مسبقاً، مثل بعد 12 ساعة أو 24 ساعة للثقافة اكسبلانت. ويمكن تقييم النتائج بطريقة نوعية (مرفق كامل الجزئي أو الكامل نشر في نقطة زمنية معينة – نعم/لا). حيث يمكن تصور explant نفسها مرارا وتكرارا وسجل، يعكس هذا التحليل خصائص فردية allantois explant الثقافات على مر الزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون تشكيل ضفيرة الأوعية الدموية في اكسبلانتس الثابتة والملون المقررة (الشكل 3).
رقم 1: الخطوات الممثل في تشريح اللانتويس. عرض التفاصيل (A) من القرن الرحم المعزولة. يتم وضع علامة براعم الرحم التي تحتوي على الأجنة بالنجوم؛ وتعتبر الأنسجة الدهنية والأوعية المحيطة بالقرن الأفريقي الرحم على الجانب الأيسر. (ب) عرض من أوروبية (بطانة الرحم) بعد إزالة الطبقة العضلية من الرحم. Vascularized عاليا، القطب ميسوميتريال من أوروبية تتجه إلى اليسار، الجزء ميسوميتريال المضادة (ملحوظ مع نجمة) يحتوي على الجنين تتجه إلى اليمين. (ج) الجانب عرض للقطب ميسوميتريال مكافحة تشريح أوروبية (ملحوظ مع نجمة). يشير السهم إلى مكان الجنين. (د) عرض أعلى من المستكن (السهم) محاطة بكيس ألمح الجدارية بعد الإزالة الجزئية لاوروبية المحيطة بها. (ه، و) وجهات نظر الممثل الخطوات اللاحقة في تشريح الجنين (السهم). ويشير رأس السهم إلى كيس ألمح. (ه)، في المخروط اكتوبلاسينتال (epc) مرئياً على الحق. (ز) التشريح الجزئي للجنين (السهم) من كيس ألمح (رؤوس الأسهم). يتم وضع علامة اللانتويس مع نجمة حمراء. (ح) المعزولة الجنين (السهم) مع اللانتويس (النجم الأحمر). تتم الإشارة إلى موقف حيث ستخفض اللانتويس من موقع الإدراج القاعدية في نهاية مؤخرة الجنين مع خط أحمر مكسورة. صور أخذت في ستيريوميكروسكوبي مع مجموعة تكبير 8:1. هي كافة أشرطة مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الأشكال غير متجانسة والأحجام من اللانتويديس- ثمانية اللانتويديس (–ح) تم عزل من أجنة القمامة واحدة واحدة. غادر الفريق، اللانتويديس فورا بعد تشريح (ح 0). اللوحة اليمنى، اللانتويديس نفسه بعد 12 ساعة ثقافة اكسبلانت. Explants مرفقة بشدة، وقد انتشرت الخلايا الوسيطة. هي دائريا explants لتصور أحجام explant. صور أخذت في مجهر مجهزة بمرحلة التباين البصريات و 5 × (اللوحة اليمنى) أو هدفا 10 × (اللوحة اليمنى). كل مقياس الحانات هي 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تكوين الضفيرة الوعائية في الثقافات explant اللانتويس- تم تشريح اللانتويديس واكسبلانتيد على إنتغرين α4β1 المعطل تداولها كما هو موضح في هذا البروتوكول. كانت مثقف explants عن 24 ساعة، وكانت ملطخة خلايا بطانية في ضفيرة الأوعية الدموية باستخدام الأجسام المضادة CD31 المضادة الأولية والمسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة الثانوية. خلايا بطانية تظهر باللون الأخضر. وتوضح الصورة العليا الضفيرة الوعائية كامل في المنطقة الوسطى من explant allantois الممثل. واتخذت الصورة في مجهر مزودة ببصريات الأسفار وهدف 5 ×. مقياس بار، 500 ميكرومتر. فريقي أقل هي أعلى الصور التكبير من آخر allantois explant تشريح ومثقف في نفس الظروف. يمكن رؤية الهياكل الشبيهة بالسفينة وخلايا بطانية الفردية. صور أخذت في مجهر [كنفوكل]؛ تغيير حجم أشرطة، 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حضور المصل، ومصدر غنى لجزيئات لاصقة المؤيدة المصفوفة خارج الخلية مثل فيبرونيكتين، سوف نعلق allantois explants سهولة إلى مختلف من البلاستيك، الزجاج، أو تصفية السطوح9،16. وهكذا، إذا يهدف تحليل أجرى للتحقيق على وجه التحديد أثر التعديل الوراثي أو أي معاملة أخرى في مرفق allantois معطلة α4β1، أنها حاسمة لمنع مواقع الربط غير محددة (مثلاً، مع المصل البقري ألبومين) بعد طلاء السطوح مع إنتغرين وقبل تفرخ مع المحتوية على مصل وسائط الإعلام.
ملحق الأولية من allantois explants إنتغرين α4β1 المعطل تداولها حساس جداً للحركة، ولوحات زراعة الأنسجة ولذا ينبغي أن يترك دون عائق لفترة زمنية محددة مسبقاً (مثلاً، عن ح 12) قبل التسجيل اللانتويس مرفق. ملاحظة أن الوقت المطلوب للاتصال مستقرة تشكيل مع الركيزة قد تختلف تبعاً لسلالة الماوس تم تحليلها أو تركيز إنتغرين α4β1 المعطل تداولها.
والاشتراط بين الخلايا VCAM-1/α4β1-التفاعل للانصهار تشوريوالانتويك الناجح هو راسخة11،،من1213. وباﻹضافة إلى ذلك، جزيئات المصفوفة خارج الخلية مثل فيبرونيكتين، كولاجينس والجزيئات الأخرى التي تهم يمكن أيضا المعطل تداولها واستخدامها كركائز "كوريو-ميميتيك".
مرفق تشوريوالانتويك فيعتمد على التفاعل بين الخلايا بين VCAM-1 و α4β1 إنتغرين الشريك ملزم به. في الرحمومرفق تشوريوالانتويك والانصهار اللاحقة يمكن أن تحدث فقط عند allantois وسعت بما فيه الكفاية لجعل الاتصال مع المشيمة. ونظرا للتغيرات الفسيولوجية في أحجام allantois في مرحلة إنمائية خاصة، مرفق تشوريوالانتويك والانصهار تجري في وقت ما بين ه 8.0 و 9.0 E (النطاق، ه 9.25 7.5-E)14،16. أساليب للدراسة على وجه التحديد عملية عابرة من مرفق allantois لوحة المشيمة في الرحم في الماوس المعيشة ليست متاحة في الوقت الحاضر. بدلاً من ذلك، معظمها هي ركزت التحليلات عزم شاقة للانصهار تشوريوالانتويك بتقييم النسيجي مثلاً، الانتويك ينتشر على سطح المشيمة ووضع طبقة متاهة في واحدة، تحدد مسبقاً نقطة الساعة11،12،،من1316. هذا التحليل نقطة النهاية لا تميز بين العيوب التي هي على وجه التحديد سبب مرفق البصر من اللانتويس إلى المشيمة والمشيمة-تعتمد على الآثار، وهو محدود بتقلب المتأصلة في مراحل نمو الجنين والانتويك الأحجام. كما نوقش في إطار نتائج الممثل، التغيرات الفسيولوجية في أحجام allantois قد يؤدي تأخر نسبي في الانصهار تشوريوالانتويك في ~ 26% أجنة wildtype C57BL/6J. من الناحية الإحصائية، تقريبا سنتين في سبع الفئران الحوامل ولذلك كان يضحي جداً (61 الأجنة في وقت مبكر من سبعة ليتر، القمامة متوسط الحجم 8.7)، الذي يترجم إلى ضرورة كبيرة في تربية الزائدة لدراسات أوسع نطاقا. من المثير للاهتمام، قد كشفت تجارب ميكروسورجيكال أن المشيمة الفعل المختصة تلتحم مع اللانتويس في مرحلة زوج سميط 1، وأن اللانتويس المعارض القدرة القصوى الانصهار في الأجنة مع 3-5 أزواج سميط14. وبالتالي فخلايا تشوريواديسيفي من اللانتويس المشكلة ووظيفيا المختصة قبل مرفق تشوريوالانتويك الفعلية في فيفو. التحليل السابقين الرحم مرفق allantois يغاندس المعطل تداولها، كما عرضت هنا، فمستقلة نسبيا من حجم معين اللانتويس. ومن ثم فهو ميزة واحدة لهذا الأسلوب أن يتجاوز العيوب في استطالة allantois، ويركز على الخطوة التالية في تكوين المشيمة، أي، مرفق تشوريوالانتويس. وبالتالي يمكن استخدام هذا النهج للتمييز بين العيوب في استطالة اللانتويس ومرفق تشوريوالانتويس في طفرات وراثية الماوس.
وعلى النقيض من الطريقة التقليدية لتطلع اللانتويس من نقطة مرفق للجنين باستخدام ماصة فم16، البروتوكول الحالي يستخدم نهج قطع يدوي، و allantois تتم في وقت لاحق استخدام تلميحات ماصة الفوهة الكبيرة . ميزة هامة من تطلع اللانتويس أن هذا الأسلوب يتجنب التعامل مع الأنسجة مباشرة. قطع والتلاعب في اللانتويس قد تلف الخلايا تشوريواديسيفي في الغلاف الخارجي ل mesothelium الانتويك. ومع ذلك، قطع في اللانتويس مع الملقط قد استخدمت بنجاح قبل في ثقافات السابقين فيفو الأنسجة بريبلاسينتال17، والحركية مرفق explant الانتويك ومورفولوجية ثقافات explant الموصوفة في الدراسة الحالية مشابهة للبيانات المنشورة استناداً إلى العزلة اللانتويس بتطلع16. وتوحي هذه النتائج أن الخلايا تشوريواديسيفي يتم الحفاظ عليها جيدا بما فيه الكفاية على القطع اليدوي اللانتويس، ولا هو قلق هذا التمايز explant صارخ، كما هو مبين بتشكيل الجهاز CD31--الإيجابية. المباشر قطع allantois كما يتيح إمكانية لتشريح فقط العلوي ثلثي allantois التي تعبر عن VCAM-113، وهو يضمن أقل تلوث مع الخلايا المستمدة من كيس ألمح، والتي قد يتم اقتطاعها بعيداً عن القاعدة اللانتويس بعد اللانتويس تطلع18.
التحليل خارج الرحم للالتصاق اكسبلانت الانتويك معطلة، يوفر إنتغرين α4β1 المؤتلف قراءات نوعي لخطوة أولية هامة، وما مطلوب للانصهار تشوريوالانتويك، أي، والتفاعل بين الخلايا بين VCAM-1 وأعرب على اللانتويس والمترجمة إنتغرين α4β1 mesothelium المشيمة، المستمد من اكسترامبريونيك mesoderm. ومع ذلك، وعلى الرغم من أن تعتبر هذه الجزيئات انضمام هذين اللاعبين المبدأ في الانصهار تشوريوالانتويك، ~ 50% أجنة مع الطفرات متماثل بالضربة القاضية في إنتغرين VCAM-1 أو α4 الخضوع للانصهار تشوريوالانتويك في فيفو11 ،،من1213. بسبب هذا penetrance غير مكتملة، قد لا يكفي لاستبعاد شرط لهذه الجزيئات التصاق اثنين في النماذج الوراثية مع عدم الانصهار تشوريوالانتويك السابقين فيفو الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول.
تحت الظروف الفسيولوجية، إينتيجرينس α4β1 المضمنة في غشاء البلازما trophoblasts المشيمة، وأدرجت في شبكة معقدة من البروتينات الهيكلية وإرسال الإشارات التي تتعاون لتنظيم التصاق خلية خلية (وخلية المصفوفة) 19-كما مع معظم اختزالية في المختبر النهج، الطابع المعقد لواجهة ربط VCAM-1 المشيمة فقط على غرار بقدر محدود جداً من إنتغرين α4β1 المعطل تداولها. إلى جانب احتمال الافتقار إلى المدخلات الهيكلية أو إرسال الإشارات الهامة الأخرى المستمدة من المشيمة سليمة في هذا النظام، فمن المرجح أن جزءا فقط من إينتيجرينس التي هي معطلة على سطح جامد وثنائي الأبعاد موجودة في النشط، تشكيل المختصة ملزمة، "فتح".
طريقة عرض تقرب المرفق المبكر ونشر خطوة اللانتويس للمشيمة، ويمكن أيضا تقرير عن تنمية ضفيرة الأوعية الدموية الانتويك عندما جنبا إلى جنب مع تحليل السفينة تشكيل9. ومع ذلك، النهج الحالي ليس نموذجا غزو المشيمة تنتشر الأوعية توسط الانتويك خلايا بطانية، كما أنه لا يعكس morphogenesis المتفرعة من المشيمة، وعملية أساسية للانصهار تشوريوالانتويك و التطور اللاحق ل متاهة المشيمية10.
استخدام التباين المرحلة أو مجهرية التدخل التفاضلية جنبا إلى جنب مع (شبه-) الآلي تحليل الصور، يمكن تطبيق طريقة عرض في الشاشات الأكبر حجماً للتحليلات الأولية لمرفق الانتويك تأخر أو فشل في المختبر. بالإضافة إلى تحليل طفرات الماوس، قد يكون الأسلوب للفائدة الشاشة بآثار المخدرات ومسببات الأمراض ونواتج الأيض، أو العوامل البيئية على مرفق الانتويك.
في طفرات الماوس العديدة، يفشل مرفق تشوريوالانتويك تحدث، على الرغم من أن تظهر اللانتويس والمشيمة قد وضعت عادة. وعلاوة على ذلك، عرض المسوخ التي تظهر العيوب مرفق تشوريوالانتويك عادة penetrance غير مكتملة1،2،10. سيكون من المهم للتحقيق في ما إذا كانت هذه الجينات مختلفة وظيفيا على ما يبدو جداً أثر المسارات الجزيئية المشتركة و/أو العمليات الخلوية. تصوير مباشر من explants allantois المستمدة من طفرات الماوس لديه القدرة على توضيح هذه الآليات. على سبيل المثال، المسماة الخلايا الموجودة في الغلاف الخارجي ل allantois تشريح مع الأصباغ الفلورية الحيوية (مثل دي أو ديو كاربوسيانيني محبتين تتبع،من1618) إلى صورة التصاق ونشر الأحداث، أو لتعقب خلية الهجرة في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، قد يثبت الفلورسنت الصحفيين أن تصور البروتينات سيتوسكيليتون أو الانضمام أن تكون مفيدة.
في الآونة الأخيرة، قد وصف نظام ثقافة المشاركين السابقين فيفو لمرفق ما قبل مورين اللانتويديس وتشوريونس، واستخدمت هذا النهج بنجاح للتحقيق في الأحداث التي تحدث بعد الإلحاق تشوريوالانتويك، مثل طبقة متاهة تشكيل17. تحليل كفاءة مرفق اللانتويس على تشوريونس المعطل تداولها معزولة عن مختلف (مثلاً، المعدلة وراثيا) نماذج الفأر قد تسفر عن رؤى جديدة في اللاعبين الجزيئية والمسارات التي تحكم خطوات مبكرة في التنمية مورين المشيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل SFB688 الأوقيانوغرافية ألماني (إلى جي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| 70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
| Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
| Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
| Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic. |
| 10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
| 3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
| Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
| α4β1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
| para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
| α-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
| Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
| Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
| M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
| DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
| Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |
References
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
- Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160 (2016).
- Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
- Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
- Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
- Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
- Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
- Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
- Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
- Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
- Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
- Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
- Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
- Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
- Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
- Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
- Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).
