Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.
Chromatine verspreiding technieken hebben wijd gebruikt om te beoordelen van de dynamische lokalisatie van verschillende eiwitten tijdens geslachtscel, met name voor de spermatogenese. Deze technieken kunnen voor visualisatie van eiwitten en DNA lokalisatie patronen tijdens Meiotische evenementen zoals homologe chromosomen in paren rangschikken, synapsis en DNA-reparatie. Terwijl een aantal protocollen zijn beschreven in de literatuur, zijn algemene chromatine verspreiding technieken met behulp van zoogdieren profase eicellen beperkt en moeilijk te wijten aan de timing van meiose Inleiding in de foetale eierstokken. In vergelijking, kunnen de profase spermatocyten worden verzameld van jonge mannelijke muizen met een hogere opbrengst zonder de behoefte aan microdissection. Het is echter moeilijk te verkrijgen van een zuivere gesynchroniseerde bevolking van cellen in specifieke stadia als gevolg van de heterogeniteit van Meiotische en post Meiotische geslachtscellen populaties in de jeugd- en volwassen testis. Voor de latere fases van de meiose is het voordelig om te beoordelen van oöcyten ondergaan meiose I (MI) of meiose II (MII), omdat groepen van rijpe eicellen kunnen worden verzameld van volwassen vrouwelijke muizen en gestimuleerd om te hervatten meiose in cultuur. Hier, methoden voor Meiotische chromatine verspreid preparaten met behulp van oöcyten ontleed van foetale, Neonatale en volwassen eierstokken worden beschreven met begeleidende video demonstraties. Chromosoom missegregation gebeurtenissen in zoogdieren eicellen zijn frequent, met name tijdens MI. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te beoordelen en karakteriseren van de effecten van verschillende mutaties of milieu posities tijdens de verschillende fasen van de oögenese. Aangezien er duidelijke verschillen zijn tussen de oögenese en spermatogenese, zijn de technieken beschreven binnen onschatbare waarde voor het vergroten van ons begrip van zoogdieren ooegenese en de seksueel dimorphic kenmerken van chromosoom en eiwit dynamiek tijdens de meiose .
Tijdens de spermatogenese, zijn grote halfsynchrone golven van Meiotische kiemcellen snel en voortdurend bijgevuld in de testis bij het begin van de puberteit en volwassenheid1. In tegenstelling tot mannen, wordt meiose bij vrouwtjes geïnitieerd uitsluitend tijdens de foetale ontwikkeling. Na geboorte, eicellen blijven gearresteerd in een fase van de langdurige dictyate van de profase I met een intact germinal Vesikel (GV; nucleaire envelop) tot de puberteit. Bij het begin van de puberteit, een subset van eicellen worden cyclisch geselecteerd om het ondergaan van de groei en rijping, markering van de inleiding van Meiotische hervatting. Meiotische hervatting in volgroeide eicellen manifesteert zich door het verdwijnen van de GV in een proces dat bekend staat als germinal vesikel verdeling (GVBD). De oöcyt ondergaat vervolgens chromosoom condensatie en segregatie, gevolgd door polar lichaam extrusie. Eicellen op de progressie naar MII worden gearresteerd en worden gestimuleerd om te voltooien van de tweede en laatste Meiotische divisie alleen na de bevruchting.
Vrouwelijke vruchtbaarheid is sterk afhankelijk van het succes van Meiotische profase ik progressie. Sleutel tot dit is vorming van een fysieke koppeling tussen homologe chromosomen, bekend als de chiasmata, die wordt gemedieerd door reparatie van geïnduceerde DNA dubbele strand einden (DSBs) via crossover recombinatie2. Dit proces vindt plaats binnen de context van een dynamische eiwitrijke steiger bekend als het synaptonemal-complex (SC) die tussen homologe chromosomen vormt om hun synapsis3. De SC is een rits-achtige tripartiete structuur die bestaat uit twee parallelle laterale elementen met elkaar verbonden door regio Midden eiwitten die in het bezit van homologen samen gedurende de lopende DNA-herstel. Voorafgaand aan de synapsis vormen voorlopers van de laterale elementen, axiale elementen, genoemd tussen zuster chromatiden. Synaptonemal complex eiwitten zoals SYCP2 en SYCP3 vormen axiale elementen die colocalize aan de zuster-chromatide cohesie assen tijdens de vroege profase. Deze later dienen als bindend sites voor de dwarse gloeidraad eiwit, SYCP1, die centraal element vergadering en synapsis tussen de uitgelijnde homologen4vergemakkelijkt. In muis eicellen, wordt volledige synapsis aangegeven door de aanwezigheid van 20 volledig preparaten overlappende SYCP3 en SYCP1 stukken, die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van chromatine verspreid. Synapsis is voltooid bij binnenkomst in de pachytene substage, waarbij de volwassen crossovers die bestemd zijn om te formulier chiasmata tussen homologen zijn versierd met mutL homolog (MLH1/3) Dimeren ter bevordering van hun nauwkeurige verwerking5,6 , 7. de structurele handhaving van de chromosomen (SMC) complexen, met inbegrip van cohesin, condensin en de SMC5/6 complex, zijn belangrijk voor de regulering van chromosoom dynamiek en structuur in de gehele meiose8,9, 10,11,12. Collectief, zorgen deze gebeurtenissen voor goede bi-richting van homologe chromosomen naar tegengestelde Polen van de spindel na demontage van de SC.
De Meiotische celcyclus is een krachtig model te onderzoeken van de rol van verschillende eiwitten in het genoom onderhoud als gevolg van de geprogrammeerde inductie en latere reparatie van DNA-DSBs. Zoogdieren meiose is bovendien ook een relevante model voor de studie van de epigenetische aanpassingen en inprenting13. Het is echter technisch moeilijk in te schatten van deze gebeurtenissen tijdens vrouwelijke meiose, die in de foetale en neonatale eierstokken bij zoogdieren (Figuur 1 plaatsvindt). Profase ik kan worden onderverdeeld in 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema en dictyate. Hierin beschrijven we hoe u kunt isoleren en onderscheid maken tussen foetale en neonatale eierstokken en teelballen (Figuur 2). Aangepast van de eerder beschreven methoden, dit manuscript wordt ook uitgelegd welke een protocol (stap 1) met video demonstratie voor bereiding van vrouwelijke Meiotische profase ik chromatine verspreidt14,15,16,17 . Wanneer in combinatie met immunolabelling, zoals beschreven in stap 6-7, dit protocol maakt een gedetailleerde microscopische analyse van profase ik gebeurtenissen in eicellen.
Oögenese is foutgevoelig en chromosoom missegregation gebeurtenissen tijdens de eerste Meiotische verdeling vertegenwoordigen de meest voorkomende bron van genetische ziekte in nakomelingen18,19. In dit manuscript (protocol stap 2) beschrijven we een protocol waarin volwassen GV-geënsceneerde eicellen worden gewonnen uit primer eierstokken van volwassen vrouwelijke muizen. Ondersteunende voorwaarden ondergaan volgroeide eicellen luteïniserend hormoon-onafhankelijke hervatting van meiose na isolatie en cultuur20. Na de hervatting van het Meiotische, eicellen vooruitgang door middel van meiose I, dan arresteren op metafase II. Eicellen blijven gearresteerd op metafase II, tenzij bevrucht. In stap 2 – 5, passen we eerder gemeld protocollen met video demonstratie om te beschrijven hoe te verzamelen, cultuur en MI en MII eicellen voorbereiden chromatine verspreid preparaten21. Deze techniek verspreidt chromatine zorgt voor duidelijke immunolabelling van eiwitten die zijn gekoppeld aan de chromosomen. Bovendien, dit protocol kan ook worden gebruikt om te onderscheiden tussen bivalente en univalent chromosomen en één zus verder kan oplossen chromatiden ter vergemakkelijking van de beoordeling van de oöcyt ploïdie. Daarom, naast onthullend lokalisatie patronen van Meiotische eiwitten, dit protocol kan ook dienen als een instrument van onschatbare waarde voor het ophelderen van de mogelijke oorzaken van chromosoom missegregation tijdens MI en MII.
Chromatine verspreiding preparaten kunnen onderzoekers chronologisch studeren vrouwelijke zoogdieren meiose en de dynamische lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn. De embryonale en neonatale chromatine spreads zorgen voor nauwe analyse van de gebeurtenissen in de gehele Meiotische profase. Metafase I en II metafase chromatine spreads kunnen worden gebruikt om te onderscheiden van één zuster chromatiden van gepaarde zusters en gepaarde homologe chromosomen, evenals ploïdie beoordelen. Ter vergelijking: het protoc…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door NIGMS (R01GM11755) te P.W.J en door een opleiding subsidie fellowship van het National Cancer Institute (NIH) (CA009110), G.H. en J.H.
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |