L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.
Techniques d’étalement de la chromatine ont été largement utilisés pour évaluer la localisation dynamique de diverses protéines lors de la gamétogenèse, particulièrement pour la spermatogenèse. Ces techniques permettent pour la visualisation de protéines et de profils d’ADN localisation lors d’événements méiotiques comme les chromosomes homologues, appariement, Synapse et ADN de réparation. Tandis que quelques protocoles ont été décrits dans la littérature, les techniques d’étalement de chromatine générales à l’aide d’ovocytes chez les mammifères de la prophase sont limitées et difficiles en raison du calendrier de l’initiation de la méiose dans les ovaires foetaux. En comparaison, les spermatocytes de prophase peuvent être collectées de souris mâles juvéniles avec des rendements plus élevés sans nécessiter de microdissection. Toutefois, il est difficile d’obtenir une population pure synchronisée des cellules à des étapes spécifiques en raison de l’hétérogénéité des populations de cellules germinales méiotiques et après méiose dans les testicules juvéniles et adultes. Pour les étapes ultérieures de la méiose, il est avantageux d’évaluer en cours de la méiose I (MI) ou la méiose II (MII), parce que les groupes des ovocytes matures peuvent être prélevés dans des souris femelles adultes et stimulés pour reprendre la méiose dans la culture des ovocytes. Ici, méthodes pour les préparations de chromatine méiotique répartie à l’aide d’ovocytes disséqué de foetale, néonatale et ovaires adultes sont décrits avec des démonstrations vidéo d’accompagnement. Événements missegregation chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont fréquentes, en particulier au cours de la MI. Ces techniques permettent d’évaluer et de caractériser les effets de mutations différentes ou des expositions environnementales au cours des différentes étapes de l’ovogenèse. Qu’il sont a des différences distinctes entre l’ovogenèse et la spermatogenèse, les techniques décrites dans sont inestimables pour accroître notre compréhension de l’ovogenèse chez les mammifères et les fonctionnalités présente un dimorphisme sexuel de la dynamique du chromosome et protéines au cours de la méiose .
Au cours de la spermatogenèse, grosses vagues semi-synchrone des cellules germinales méiotiques sont rapidement et continuellement réapprovisionnés dans les testicules au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte1. Contrairement aux hommes, la méiose chez les femelles est initiée uniquement pendant le développement du foetus. Après la naissance, les ovocytes restent arrêtées dans un stade de dictyate prolongé de la prophase I avec une vésicule germinale intacte (GV ; enveloppe nucléaire) jusqu’à la puberté. Au début de la puberté, un sous-ensemble d’ovocytes sont cycliquement choisis pour subir la croissance et la maturation, marquant le début de reprise méiotique. Méiotique reprise dans les ovocytes adulte se manifeste par la disparition de la GV dans un processus appelé vésicule germinale ventilation (GVBD). L’ovocyte subit alors la condensation des chromosomes et ségrégation, suivi par extrusion de globule polaire. Les ovocytes deviennent arrêtés à progression au PPFI et sont stimulés pour compléter la deuxième et dernière division méiotique seulement après la fécondation.
La fertilité féminine est fortement tributaire de la réussite de la prophase méiotique j’ai progression. Clé c’est la formation d’une liaison physique entre les chromosomes homologues appelés les chiasmas, médiée par la réparation des induits ADN double brins (CDB) par l’intermédiaire de crossover recombinaison2. Ce processus se produit dans le cadre d’un échafaudage de riches en protéines dynamique appelé complexe synaptonémal (CS) qui se forme entre les chromosomes homologues afin de faciliter leur synapsis3. Le SC est une fermeture à glissière-comme structure tripartite qui se compose de deux éléments latéraux parallèles reliées par des protéines de la région du centre qui détient homologues ensemble tout au long de la réparation de l’ADN en cours. Avant synapsis, précurseurs des éléments latéraux, appelés éléments axiales, forment entre sœur chromatides. Complexe synaptonémal protéines telles que SYCP2 et SYCP3 forment des éléments axiaux qui sont colocalisées pour les axes de la cohésion des chromatides au cours du début de la prophase. Plus tard service accepteurs pour la protéine de filament transversal, SYCP1, ce qui facilite l’assemblage de l’élément central et synapsis entre homologues alignés4. Dans les ovocytes de souris, synapsis complet est indiqué par la présence de 20 complètement chevauchement des tronçons SYCP3 et SYCP1, qui peuvent être visualisées à l’aide de la chromatine propager des préparations. Synapsis est terminé dès l’entrée dans le sous-étage pachytène, par lequel des véhicules multisegments matures qui sont destinés à des chiasmas forme entre homologues sont décorées avec mutL dimères d’homologue (MLH1/3) pour promouvoir leur traitement exact5,6 , 7. l’entretien structurel des complexes de chromosomes (SMC), y compris cohesin, condensin et la SMC5/6 complexes, sont importants pour la régulation de la dynamique des chromosomes et la structure tout au long de la méiose8,9, 10,11,12. Collectivement, ces événements s’assurer bi-orientation correcte des chromosomes homologues à lutter contre les pôles du fuseau après démontage de la SC.
La méiose des cellules est un modèle puissant afin d’examiner les rôles de diverses protéines dans maintenance du génome en raison de l’induction programmée et la réparation ultérieure des ADN CDB. En outre, la méiose chez les mammifères est également un modèle pertinent pour l’étude des modifications épigénétiques et l’empreinte13. Toutefois, il est techniquement difficile d’évaluer ces événements au cours de la méiose femelle, qui se déroule dans les ovaires foetales et néonatales chez les mammifères (Figure 1). Je peux être divisé en 5 sous-stades la prophase : leptonema, du zygotène, pachytène, diplonema et dictyate. Ici, nous décrivons comment isoler et faire la distinction entre fœtales et néonatales des ovaires et des testicules (Figure 2). Adapté de méthodes précédemment décrites, ce manuscrit présente également un protocole (étape 1) avec la vidéo de démonstration pour la préparation de la prophase méiotique femelle je la chromatine propage14,15,16,17 . Lorsqu’il est couplé avec l’immunomarquage, tel que décrit dans les étapes 6 et 7, ce protocole permet une analyse microscopique détaillée de la prophase I événements dans les ovocytes.
L’ovogenèse est sujette aux erreurs et événements de missegregation de chromosomes au cours de la première division méiotique représentent la source la plus fréquente des maladies génétiques dans la descendance18,19. Dans ce manuscrit (étape 2 du protocole), les auteurs décrivent un protocole dans lequel des ovocytes matures étagée de GV sont extraites apprêtées ovaires de souris femelles adultes. Dans des conditions favorables, ovocytes adulte subissent une hormone lutéinisante indépendante reprise de la méiose suite d’isolement et la culture20. La reprise méiotique, ovocytes progressant grâce à la méiose I, puis arrêtent à la métaphase II. Ovocytes restent arrêtées lors de la métaphase II, sauf s’il est fécondé. Dans les étapes 2 à 5, nous adaptons protocoles rapportés antérieurement avec la vidéo de démonstration pour décrire comment collecter, culture et préparer la chromatine se propager préparations21ovocytes MI et MII. Cette chromatine diffusion technique permet clairement immunomarquage des protéines associées aux chromosomes. En outre, ce protocole permet également de distinguer les chromosomes bivalents et vaccin monovalents et peut encore résoudre seule sœur chromatides à faciliter l’appréciation de la ploïdie de l’ovocyte. Par conséquent, en plus de révéler des modèles de localisation des protéines méiotiques, ce protocole peut également servir un outil inestimable pour élucider les causes potentielles de missegregation de chromosomes au cours de la MI et MII.
Préparations de propagation de la chromatine permettent aux chercheurs d’étudier par ordre chronologique la méiose mammifère femelle et la localisation dynamique des protéines impliquées. Les spreads de chromatine embryonnaires et néonatales permettent une analyse attentive des événements tout au long de la prophase méiotique. Métaphase I et métaphase II la chromatine se propage peut servir à distinguer l’unique sœur chromatides de jumelé de sœurs et paires de chromosomes homologues, ainsi qu’évalu…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à G.H. et J.H.
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |