Женских млекопитающих как известно ошибкам, особенно благодаря missegregation хромосомы. Эта рукопись описывает методы подготовки хроматина распространения для мыши профаза, метафазы I и II-поставил ооцитов. Эти основные методы позволяют для изучения хроматина прыгните белков и морфология хромосомы во всем млекопитающих женских.
Хроматин распространение методы были широко используется для оценки Динамическая локализация различных белков во время гаметогенеза, особенно для сперматогенеза. Эти методы позволяют для визуализации белков и ДНК локализации шаблонов во время meiotic событий, таких как гомологичные хромосомы сопряжения, ремонт синапса и ДНК. Хотя несколько протоколов были описаны в литературе, общие хроматина распространения методов с использованием яйцеклетки млекопитающих профаза являются ограниченными и сложной ввиду сроков возбуждения мейоза в плода яичников. В сравнении профаза сперматоцитах могут быть собраны из несовершеннолетних самцов мышей с более высокой урожайности без необходимости microdissection. Однако трудно получить чистый синхронизированные популяция клеток на определенных этапах вследствие неоднородности населения meiotic и пост meiotic зародышевых клеток семенников несовершеннолетних и взрослых. Для более поздних стадиях мейоза это выгодно для оценки ооцитов, претерпевает мейоз I (MI) или мейоз II (МИИ), потому что группы зрелых яйцеклеток могут быть собраны из взрослых самок мышей и стимулировали возобновить мейоза в культуре. Здесь методы подготовки meiotic хроматина распространения, с помощью ооциты расчлененный от плода, новорожденных и взрослых яичников описаны с сопровождающим видео демонстрации. Хромосоме млекопитающих ооцитов missegregation события являются частыми, особенно во время ми. Эти методы могут использоваться для оценить и охарактеризовать последствия различных мутаций или экологического воздействия различных этапах женских. Как существуют явные различия между женских и сперматогенез, методы, описанные в рамках имеют неоценимое значение для увеличения нашего понимания млекопитающих женских и сексуально диморфных особенности динамики хромосомы и белков во время мейоза .
В ходе сперматогенеза большие полусинхронные волны meiotic зародышевые клетки быстро и непрерывно пополняется в яички в начале полового созревания и во взрослой жизни1. В отличие от мужчин мейоза у самок инициируется исключительно во время внутриутробного развития. После рождения, ооциты остаются арестованных в длительной dictyate стадии профазе I с нетронутыми Жерминаль везикул (GV; ядерная оболочка) до полового созревания. В начале полового созревания подмножество яйцеклетки циклически выбираются пройти роста и созревания, маркировка начало meiotic возобновления. Meiotic возобновления в взрослой ооциты проявляется исчезновение GV в процессе, известном как Жерминаль везикул разбивка (GVBD). Яйцеклетка затем подвергается конденсация хромосом и сегрегации, следуют экструзии полярного тельца. Ооциты стать арестован по прогрессии к MII и стимулируются завершить второй и последний meiotic отделе только после оплодотворения.
Женскую плодовитость сильно зависит от успеха meiotic профаза я прогрессии. Ключом к этому является формирование физической связи между гомологичных хромосом, известны как chiasmata, которые при посредничестве ремонт индуцированных разрывы двойной нити ДНК (DSBs) через кроссовер рекомбинации2. Этот процесс происходит в контексте динамических богатых белком эшафот, известный как синаптонемного комплекса (SC), который формирует между гомологичных хромосом для облегчения их Синапсис3. СК является молния как трехсторонняя структура состоит из двух параллельных боковых элементов, соединены центрального региона белки, содержащий гомолог вместе на протяжении текущей репарации ДНК. До синапса прекурсоров боковых элементов, называемых осевой элементами, образуют между сестра chromatids. Белков синаптонемного комплекса таких как SYCP2 и SYCP3 образуют осевой элементы, которые colocalize сестра хроматиды сплоченности осям во время ранних профаза. Позже в качестве привязки сайтов для поперечной нити белка, SYCP1, которая облегчает центральным элементом Ассамблеи и синапса между унифицированных гомолог4. В ооцитов мыши полный Синапсис обозначается присутствие 20 полностью что перекрывающиеся участки SYCP3 и SYCP1, которые могут быть визуализированы с помощью хроматина распространение препаратов. Синапсис завершена после вступления в pachytene substage, whereby Зрелые кроссоверы, которые предназначены для chiasmata формы между гомолог украшены димеры mutL гомолога (MLH1/3) для содействия их точная обработка5,6 , 7. структурные поддержание хромосом (SMC) комплексов, включая Когезин, condensin и комплекс, СМТ5/6 имеют важное значение для регулирования хромосома динамики и структуры всей мейоз8,9, 10,,1112. В совокупности эти события обеспечить надлежащего би направленности гомологичных хромосом против поляков шпинделя после разборки SC.
Meiotic клеточный цикл представляет собой мощный модель для изучения роли различных белков в геном обслуживания благодаря запрограммированных индукции и последующего ремонта DSBs ДНК. Кроме того у млекопитающих мейоз является также соответствующую модель для изучения импринтинг13и эпигеномные изменения. Однако технически трудно оценить эти события во время женского мейоз, который проходит в яичниках плода и новорожденного в млекопитающих (рис. 1). Я можно разделить на 5 подэтажи профаза: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema и dictyate. Здесь мы опишем, как изолировать и различие между плода и новорожденного яичников и яичек (рис. 2). Адаптировано из описанных ранее методов, этот манускрипт также излагаются с видео демонстрации для подготовки женщин meiotic профаза протокол (шаг 1) я хроматина распространяется14,,1516,17 . В сочетании с immunolabelling, как описано в шагах 6-7, этот протокол позволяет подробный анализ микроскопических профаза я события в ооцитов.
Женских ошибок – хромосомы missegregation события во время первого дивизиона meiotic представляют собой наиболее распространенным источником генетических заболеваний в потомстве18,19. В этой рукописи (протокол шаг 2) мы описываем протокол, в котором зрелых яйцеклеток, GV-поставил извлекаются из загрунтовать яичников взрослых самок мышей. При благоприятных условиях взрослой ооциты проходят лютеинизирующего гормона независимые возобновление после изоляции и культуры20мейоз. После возобновления meiotic ооциты прогресс через мейоз я, а затем арестовать на метафазы II. Ооциты остаются арестованных в метафазы II, если оплодотворенной. В шагах 2-5 мы адаптируем сообщалось ранее протоколов с видео демонстрации для описания как собирать, культуры и подготовиться хроматина распространения подготовку21ми и MII ооцитов. Этот хроматина, распространение техника позволяет ясно immunolabelling белков, связанные с хромосомами. Кроме того, этот протокол может также использоваться для различения двухвалентные и однолистных хромосом и далее может решить один сестра chromatids для облегчения оценки плоидности ооцитов. Таким образом Помимо выявления локализации шаблонов meiotic белков, этот протокол может также служить бесценным инструментом для выяснения возможных причин возникновения missegregation хромосомы во время ми и MII.
Хроматина распространение препаратов позволяют исследователям хронологически изучения женского млекопитающих мейоз и динамическая локализация белков, участвующих. Эмбрионов и новорожденных хроматина спреды позволяют тщательный анализ событий в течение meiotic профаза. Метафазы I и ме…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIGMS (R01GM11755) для P.W.J и обучения Грант стипендий от Института национального рака (НИЗ) (CA009110) Г.Х. и. г.
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |