Summary

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

Published: January 12, 2018
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

Abstract

Transposon היפהפייה הנרדמת (SB) היא מערכת שילוב נגיפי עם יעילות מוכחת עבור העברה גנטית, גנומיקה תפקודית. כדי למטב את מכונות transposon SB, הם מועסקים, transcriptionally מוסדרים היפראקטיביים transposase (SB100X) ו transposon מבוסס-T2. בדרך כלל, transposase ואת transposon הינם מסופקים transiently על ידי פלסמיד תרביות תאים, SB100X ביטוי מונעת על ידי יזם מכוננת. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה כדי לספק את הרכיבים SB תאים אנושיים, כי הם עמידים בפני מספר שיטות פיזיקליות, כימיות תרביות תאים, SB100X הביטוי שליטה ולשלב stably הגן עניין (גוי) דרך SB “גזור והדבק” מנגנון. הביטוי של transposase היפראקטיבי מפוקחת באופן קפדני על-ידי מערכת ט-ON, בשימוש נרחב כדי לשלוט ביטוי גנים מאז 1992. הגן עניין משני צדדיה הפוך חזרה (IR) של transposon T2. שני הרכיבים SB ארוזים בשילוב פגומים וקטורים lentiviral transiently המיוצר בתאים HEK293T. תאים אנושיים, או שורות תאים או ראשי תאים מרקמות אנושיות, הם במבחנה transiently transduced עם וקטורים ויראלי. על תוספת של דוקסיציקלין (dox, טטרציקלין אנלוגי) לתוך המדיום תרבות, כוונון של ביטוי transposase נמדד, התוצאה היא שילוב לטווח ארוך של הגן עניין הגנום של תאים שטופלו. שיטה זו היא יעילים וישימים שורת התאים (למשל, הלה תאים) ותאים הראשית (למשל, אדם ראשי keratinocytes), ובכך מייצג כלי רב ערך עבור הנדסה גנטית, העברה גנטית טיפולית.

Introduction

Transposase SB100X היפראקטיבי מצמידים את transposon מבוסס-T2 שימש כבר ג’ין פרה טיפול יישומים1,2,3, הגנום שינויים4,5, ו pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) התכנות6,7. בדרך כלל, הרכיבים SB transiently הינם מסופקים על ידי תרביות תאים פלסמיד וכונני מקדם מכוננת חזקה הביטוי של transposase. עם זאת, למרות השיטות חדש משופר של תרביות תאים, משלוח של מערכת שני עדיין אתגר עבור יישומים רבים. לפיכך, הפיתוח של פרוטוקול מסירה חדש יש עניין גובר. מלבד השיטות תרביות תאים פלסמיד8 ו- mRNA9, משלוח ויראלי בהתבסס על adenoviral10,11, adeno-הקשורים ויראלי (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 , lentiviral וקטורים15 הוצע בעבר. ראוי לציין, המערכת של בחירה חייבת להבטיח את משלוח ארעית של רכיבי SB בלי אינטגרציה של וקטור ויראלי. למרות זאת, הביטוי המכונן של transposase מעלה חששות בטיחות בשל הסכנה של rehopping בלתי נשלט של transposon.

לכן, רגולציה תעתיק של SB100X על-ידי מערכת ט-אן מעודן הוא האתגר הראשון. מקדם ט מגיב שונה, שהושג על ידי החלפת ייצוג המקדם cytomegalovirus מינימלי מפותחת (CMV) המקורי עם האמרגן מינימלי (-81) של הגן Timidine קינאז (TK) 1 וירוס הרפס סימפלקס (HSV-1)16, שוכפל הזרם של CDNA SB100X (pTetOTKSB100X). מוטציה rtTA2 הפוכה-טטרציקלין-transactivators-M217 מבוטא תחת השליטה של האמרגן מכוננת חזקה (מקדם phosphoglycerate, PGK) שיכפל בתוך פלסמיד שונים (pCCL-PGKrtTA2S-M2). בעת הוספת המדיום תרבות, dox מאגד את rtTA2s-אפנן M2 ו tethers ט ייצוג המקדם מורכבים או, המתקבל ב מוסדר בחוזקה אינדוקציה של הביטוי SB100X18.

האתגר העיקרי השני נובע תרביות תאים לא יעיל של תאים אנושיים הראשי באמצעות מספר שיטות פיזיקליות, כימיות. להעביר ביעילות transposase בתאי אדם עמיד תרביות תאים, את SB100X של ה-rtTA2s-קסטות הביטוי M2 ארוזים אל תוך שילוב שני וקטורים פגומה lentiviral (IDLVs)19: IDLVTKSB ו- IDLVrtTA2s– M2. וקטורים ויראלי מיוצרים transiently כמו וקטורים הדור השלישי HEK293T תאים20 ו- pseudotyped עם גליקופרוטאין G של הנגיף Vescicular Stomatitis (VSV-G), אשר מקנה לקשת רחבה של זיהום. וקטור חלקיקים מרוכז על-ידי ultracentrifugation, טיטרציה על ידי HIV-1 להקיא p24 immunocapture. כדי מגלי שורות תאים ותאים הראשי, וקטור חלקיקים הם ומורכבת עם polybrene, מודגרת עם התאים היעד ב נוכחות או היעדרות של dox. התרופה תלוית ההפעלה של הביטוי SB100X בתאים transduced נמדד על ידי RT-PCR (לרביעיית-PCR) כמותית18.

ברגע מוסדר ט SB100X ביטוי הוכח, טרנספוזיציה של ממשלת ישראל (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לתוך הגנום בתא היעד עוקב אחר האירועים המולקולריים schematized בבירור על ידי בק, Mikkelsen21. שליש IDLV וקטור נושא קלטת הביטוי עבור ממשלת ישראל משובטים בין ההכנסה T2-transposon (IDLVT2) חייב להיות נבנה ונארז כאמור לעיל. לבסוף, שלושת הווקטורים IDLV יכול לשמש ביעילות מגלי תאים אנושיים (למשל, ראשי keratinocytes) במבחנה ולשלב ממשלת ישראל בנוכחות דוקסיציקלין18.

Protocol

1. פלסמידים המועסקים הערה: פלסמיד pCCL-PGKrtTA2S-M2 היה בחביבות שסופקו על-ידי פרופסור Zappavigna (אוניברסיטת מודנה, רג’יו אמיליה, שוויץ). פלסמיד pCMVSB100X נושאת את רצף קידוד של transposase היפראקטיבי של פלסמיד transposon pT2/BH בחביבות שסופקו על-ידי פרופ ‘ / ח’ ז’ Ivics (פול ארליך המכון, Langen, גרמניה), פרופסור…

Representative Results

שימוש בהליך המובאים כאן, שלושה וקטורים IDLV נושאת את הרכיבים SB מוסדר (SB100X, rtTA2S-transposon M2 ו- T2-GFP) היו באריזה, נהגה לספק ביעילות, בחוזקה לווסת את המערכת SB בתאים אנושיים. איור 1A מציג ערכה עבור במבחנה התמרה חושית של הלה תאים, אשר נערך כדי להעריך את התקנון ת?…

Discussion

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישים נרחב stably שילוב של גוי לתוך הגנום של התאים היעד על ידי היפהפייה הנרדמת-מתווכת טרנספוזיציה. למרות שהמערכת SB פותחה כדי לספק שיטה nonviral לעריכה הגנום, העברה יעילה של מכונות אינטגרציה (transposase ו- T2 transposon) הוא חובה. לכן, להשתמש במערכת SB בתאי ראשי בקושי transfectable, מש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים פרופסור Zappavigna, אוניברסיטת מודנה, רג’יו אמיליה, שוויץ סיפק לנו pCCL-PGKrtTA2S-M2 פלסמיד. אנו גם להכיר פרופ Ivics צ (פול Ehlrich המכון, Langen, גרמניה), פרופסור צ Izvak (Max Delbruck מרכז לרפואה מולקולרית, ברלין, גרמניה) עבור pCMVSB100X ו pT2/BH פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי דברה בינלאומי ומשרד איטלקית של אוניברסיטת ומחקר.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Play Video

Cite This Article
Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

View Video