Summary
アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV の血清型に由来するカプシドのアセンブリを促進します。
Abstract
アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) は遺伝子療法のための魅力的なベクトルとして広く受け入れられて、それはまた、ウイルスの生物学を理解するためのモデル ウイルスとして提供しています。後者の点でアセンブリ活性化タンパク質 (AAP) と呼ばれる非構造 AAV 蛋白質の最近の発見はキャプシドにウイルス キャプシド VP のアセンブリにかかわるプロセスに新たな光を当てます。我々 が最近報告している多くの AAV の血清型には、アセンブリの AAP が必要ですが、その AAV4、5、11 がこの規則の例外を。さらに、薬学会合同と異なる血清型の組み立てのカプシドを別の細胞内コンパートメントにローカライズすることを示した。生物学的特性と異なる AAV 間薬学会合同の機能的役割で予期しないこの不均一性アンダー スコア薬学会合同研究の重要性は多様な血清型に由来の血清型します。この原稿は、AAV の定量とその応用キャプシド アセンブリの AAP 依存性と血清型特異性を評価するために簡単なドット プロット法を詳しく説明します。このドット プロット法の有用性を示すためには、カプシド アセンブリおよび AAP 蛇 AAV, 以前メタボライト爬虫類 AAV と同様、AAV5 および AAV9、AAP 自立・ AAP 依存以前示されている依存性を特徴付けるに着手しました血清型、それぞれ。アッセイでは、蛇 AAV キャプシド アセンブリ蛇 AAP を必要とし、AAV5 と AAV9 から薬学会合同によって昇格できませんを明らかにしました。試金はまた、一般的な血清型異種キャプシド アセンブリを促進する相互補完によって薬学会合同の多くとは異なり蛇 AAP を促進しない AAV9 カプシドのアセンブリを示した。ヌクレアーゼの選択に大きく影響するドット プロット法の読み出し、したがって、最適な酵素を選択することは、AAV 価の成功評価のため重要です。 さらに、示します。
Introduction
アデノ随伴ウイルス (AAV) は、約 4.7 kilobases (kb) のゲノムと小さく、非エンベロープ、一本鎖 DNA ウイルスです。AAV のゲノムには、担当者とキャップの遺伝子のオープンリーディング フレーム (Orf) が含まれています。2010 年、AAV2キャップ遺伝子内の +1 フレーム シフト ORF がエンコードされた未知の非構造蛋白だったゾンタークらによって発見され、ウイルス AAV2 VP 単量体蛋白質のアセンブリで重要な役割を果たすことが判明カプシド1。この蛋白質はキャプシド アセンブリ1の推進における役割後アセンブリ活性化タンパク質 (AAP) を選ばれました。
AAP の ORFs 属Dependoparvovirus、内がパルボ ウイルス家族1,2の別属のウイルスのゲノム内にないすべてのパルボ ウイルスのゲノムの特定の bioinformatically をされています。この蛋白質の機能調査された最初 AAP AAV2 のプロトタイプから (AAP2)、集積の形成に核小体に組み立ての VP 蛋白質を完全にターゲットに AAP2 の重要な役割を確立しているに焦点を当ててください。カプシド1,3、4を組み立てください。AAV2 カプシドの AAP 式の不在でアセンブルすることができないが個別にされている我々 を含む複数のグループによる1,2,3,4,5 を確認.AAV 血清型 1、8、および 9 の後の研究に裏付け薬学会合同の AAV1、8 の VP3 単量体蛋白質とキャプシド アセンブリ内の重要な役割と 9 は AAP2の共発現の不在で完全に組み立てられた構造を形成することができませんでした。
最近では、定量的なドットの使用を含むアプローチを試金のしみ、AAP の発現の有無と AAP1 の能力で縁どら VP3 モノマーからのアセンブリを促進するために 12 をアセンブルする 12 VP3 モノマーに AAV1 の機能を調べた異種血清型。本研究は明らかにその AAV4、5 と 11 の VP3 モノマーが AAP なく組み立てることができます。さらに、調べた 12 の AAP の血清型のうち 8 つがわかっただった (すなわち、すべてが AAP4、5、11、および 12) AAP4、5、11、12 を表示中、異種の AAV 血清型カプシドのキャプシド アセンブリをサポートする広範な権限を表示、大幅にこの点6の限られた能力。これらの 4 つの血清型が系統他 AAP 血清型2,の3から遠いです。また、研究では異なる薬学会合同6の細胞レベル下のローカリゼーションの重要な不均一性が明らかになった。さらに、研究は、組み立てられたカプシドと核小体、AAV2 キャプシド アセンブリの特徴 AAP の緊密な関連を AAV5 を含む他の血清型に拡張して必ずしもできないことを示唆している 8、および 9 は、核小体の排除を表示組み立てカプシド6。したがって、任意の特定の血清型 AAP の研究から得られる情報はすべて AAP 生物に広く適用できません。AAP の生物学のような不可解な性質は、正規と非正規の AAV 血清型から各 AAP の機能と役割を調査する必要性を強調します。
人間の萌芽期の腎臓 (HEK) で AAV のウイルスの粒子の完全パッケージ化抗体生産 293 細胞 AAV のベクトル生産、AAP の蛋白質の有無の最も一般的に使用されるセル行の決定によって評価されるキャプシド アセンブリの AAP の生物学的役割式です。AAV を定量化するための標準的な方法は量的な PCR (qPCR)-基づいた試金7,8としみに基づく定量的ドット9を試金します。酵素免疫アッセイ10,11など光学密度計測12 AAV ウイルス粒子の定量のための他の方法は、多くの異なる AAV の血清型に由来サンプルまたはサンプル不純物 (粗野な lysates または文化メディア)、AAV の研究に使用されるサンプルが多いと汚染されます。現在、qPCR 最も広く AAV 定量; の使用します。ただし、システム エラーや大きな価変動13,14qPCR ベース試金の試金としての潜在的な注意事項が発生を確認する必要があります。PCR に基づく試金は潜在的交絡増幅13を阻害する PCR テンプレートで共有閉じたターミナル ヘアピンの存在などの要因の数の影響を受けます。経験豊富な人であっても潜在的な紹介 qPCR ベースに交絡要因を無意識のうちに13試金。対照的に、定量的なドットのしみアッセイ、ゲノム増幅を必要としない、qPCR に基づく試金と比較してエラーの最小限のリスクで多くの単純な原理を使用して古典的な分子生物学手法です。このメソッドは技術的に困難な; 以下したがって、アッセイ結果が合理的に経験の浅い個人によっても再現可能です。
本報告では、AAV ベクターを定量化するために使用、(AAV5 と AAV9) の血清型共通の薬学会合同のアセンブリ促進の役割を勉強するアッセイを適用する方法と例を提供しています定期的に定量的なドットのしみの試金の方法論の詳細について述べる以前メタボライト AAP 蛇 AAV14から。自然の中で AAV VP 蛋白質および AAP 蛋白質は単一の遺伝子 (すなわち、VP AAP cis 補完) 中でここで説明アッセイから cis で表されます、VP、AAP の蛋白質は 2 つの独立したプラスミド (すなわち、VP AAP からトランスで指定されました。トランス-補完)。それぞれ異なる血清型から各 VP または AAP 蛋白質は、それぞれ独立したプラスミドから表現できる、キャプシド アセンブリ (つまり、VP AAP クロス補完) の異種の VP AAP の組み合わせをテストすることが可能になります。簡単に言えば、様々 な血清型から AAV VP3 は同種の血清型 AAP、または異種血清型 AAP の存在の有無で、AAV ベクター ゲノムをパッケージ化するプラスミド DNA トランスフェクションによって HEK 293 細胞で表されます。次の生産、文化メディアとセル lysates はキャプシド シェル内でウイルスのゲノムを定量化するドット プロット法にさらされます。点のしみの分析の最初の手順は、サンプルの汚染のプラスミド Dna とアンパックの AAV のゲノムを削除するヌクレアーゼとサンプルを扱うことです。そう失敗は unpurified サンプル試金されるとき、背景信号を特に増加させます。ウイルスのカプシドを破るし、サンプル ソリューションにヌクレアーゼ耐性ウイルスのゲノムを解放するプロテアーゼ処理によるこれは後します。次に、ウイルスのゲノムは、変性、膜の quantitation のためウイルス ゲノム特定 DNA プローブとハイブリダイズします。蛇 AAV VP3 がキャプシド アセンブリの蛇 AAP を必要とし、ヘビ AAP が薬学会合同総会を促進することも AAP 依存型の血清型に由来の多くとは異なり AAV9 カプシドのアセンブリを促進しないことを示すここで報告例の分析で異種血清型カプシド。最後に、我々 は qPCR に重要な注意点を報告またはドットのしみベース AAV 定量アッセイ ヌクレアーゼの選択は、分析結果に対して大きな影響を及ぼすこと。
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Protocol
注: ソリューションおよびこのプロトコルに必要なバッファーのためのレシピは、表 1に提供されます。下記プロトコルはキャプシド アセンブリの AAP 蛋白質の役割を検討する VP AAP クロス補完ドットしみ試金のためです。精製 AAV ベクターの滴定のためより一般的な定量的ドットしみアッセイ法は、代表結果セクションで説明します。
1. VP3、AAP、プラスミドを表現する AAV2 担当者の建設
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PCMV-AAVx-VP3 (x = 血清型) の建設
- 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して全体の VP3 ORF (1.6 kb) を PCR 増幅: VP3 前方、CTAA RE1 CACC N25 (VP3 ORF の最初の 25 のヌクレオチド);VP3 リバース、TCTT RE2 N25 (VP3 ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
注: RE1 と RE2 は、制限酵素 (解像度) のクローニングのためのサイトです。CTAA と TCTT は、ターミナル 5' と 3' tetranucleotides 制限の酵素消化を容易にする追加二本鎖 DNA の終わりの近きます。CACC が、コザック配列です。 - 高度な式にヒトサイトメガロすぐに初期 (CMV IE) エンハンサー-プロモーターを使用します哺乳類発現ベクターのサイト再対応する間 RE-digested PCR の製品をクローンします。
注: 分子クローニングのため最適な温度で 1 時間 4 U/μ g の DNA の濃度で restriction enzyme(s) とバックボーン プラスミド DNA の 5 μ g を消化します。PCR のフラグメントの単位長さあたりの制限酵素認識部位数の増加による酵素使用時 (例えば、1.6 kb VP3 ORF PCR の製品の 10 U/μ g) と (例えば、4 h) に長いインキュベーション時間の単位を増加します。分子生物学酵素および細菌変換を含むクローニング プロシージャの有用な情報は15,16,17他の場所で見つけることができます。
- 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して全体の VP3 ORF (1.6 kb) を PCR 増幅: VP3 前方、CTAA RE1 CACC N25 (VP3 ORF の最初の 25 のヌクレオチド);VP3 リバース、TCTT RE2 N25 (VP3 ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
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PCMV-フラグ-AAPx (x = 血清型) の建設
- 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して最初のアミノ酸を除く全体の AAP ORF (0.6 kb) を PCR 増幅: AAP 前方、CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (4 塩基から 25 のヌクレオチド、AAP ORF);AAP リバース、TCTT RE2 N25 (AAP ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
注: GACTACAAGGACGACGATGACAAA コード フラグの札、有害な影響の4、5がないように示されているが、不要な場合は省略することができます。 - CMV IE エンハンサー プロモーター15,16,17哺乳類発現ベクターの対応するサイト間 RE-digested PCR の製品をクローンします。
- 忠実度の高い DNA ポリメラーゼと次のプライマーを使用して最初のアミノ酸を除く全体の AAP ORF (0.6 kb) を PCR 増幅: AAP 前方、CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (4 塩基から 25 のヌクレオチド、AAP ORF);AAP リバース、TCTT RE2 N25 (AAP ORF の最後の 25 のヌクレオチド)。
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PHLP 担当者の建設
- Xho の 20 台 pAAV RC2 プラスミド (7.3 kb) のダイジェスト 5 μ g 私と Xcm、商業 DNA 精製キットを使用して DNA を浄化し、フェノール-クロロホルム抽出法。
注: 1.8 kb Xho 私-Xcm Rep 蛋白質の表現を維持しながらキャプシド VP 蛋白質の表現の損失で 7.3 kb pAAV RC2 プラスミドの結果から私の断片を取り除く。 - 鈍 DNA は、6 台の T4 DNA ポリメラーゼの終了、アガロース 5.5 kb DNA 断片をゲルの浄化し 50 に 100 を使用して浄化されたフラグメントを縛る自己 DNA および製造元の勧告15によると T4 DNA リガーゼの 400 台の ng。
- 1.1.2 の手順で参照される標準細菌変換手順メモ。
- Xho の 20 台 pAAV RC2 プラスミド (7.3 kb) のダイジェスト 5 μ g 私と Xcm、商業 DNA 精製キットを使用して DNA を浄化し、フェノール-クロロホルム抽出法。
- 制限の酵素の消化力およびシーケンス15,18によってプラスミッドを構築を確認します。
- プラスミド minipreps または下流の AAV 生産実験のプラスミド DNA の十分な量を取得する市販のキットを使用して maxipreps を実行します。
2 プラスミド DNA トランスフェクション (クロス否定回路試金) によって細胞 HEK 293 の AAV の生産
- HEK 293 細胞ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) での培養-ペニシリンとストレプトマイシン ミックス、高グルコース (4.5 g/L) が 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% を添加した 1 mm L-グルタミン 5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C の定温器。
注: AAV 価は大幅 HEK 293 の細胞のソースによって異なります。
注意: は、バイオ セーフティ レベル 1 (BSL1) 封じ込めで AAV を処理できますが、BSL2 封じ込めは HEK 293 細胞ワークでお勧めです。 - 日-1 (トランスフェクション前 24 h)、プレート 6-7 105 HEK 293 細胞/ウェル 2 ml x 6 ウェル プレートで手順 2.1 で説明した完全な媒体の。これは一般的に、次の日 〜 90% の confluency を実現します。
-
0 日目: トランスフェクション
- DNA トランスフェクションの準備
- セル ~ 90% の confluency に達していることを確認します。
- ウォーム アップ 10% ではなく 1% ペニシリンとストレプトマイシン ミックス 1 mM L グルタミンを DMEM (すなわち、無血清培地) を短期国債、37 ° C の水浴中。
- 部屋の温度に到達するポリエチレンイミン (PEI) ソリューションを許可します。
- プラスミド DNA の混合物の調製
- 表 2に示されているように、CaCl2または MgCl2滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブでなくリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 96 μ L でプラスミドをミックスします。DNA 量が 2 μ g/ウェルです。
注: 場合は、公称プラスミド DNA の解決のボリュームが無視できます。音量調整をお勧めプラスミド DNA ソリューションの総量が ≥10 μ L の場合。
- 表 2に示されているように、CaCl2または MgCl2滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブでなくリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 96 μ L でプラスミドをミックスします。DNA 量が 2 μ g/ウェルです。
- PEI トランスフェクション
- PEI ソリューション (1 mg/mL) の 4 μ L を (上記のように準備) PBS プラスミッド DNA のミックスに追加します。最終巻は、約 100 μ L (培地の容積 5%) です。渦管を簡単にし、室温で 15 分間 DNA: PEI 混合物を孵化させなさい。
- 15 分インキュベーションを完了するを待っている間手順 2.3.1.2 prewarmed 無血清培地で培養液を置き換えます。
- DNA の 15 分インキュベーション一度: PEI 混合が完了すると、簡単にスピン チューブの下に液体を収集するために遠心機のチューブと HEK 293 培養プレートの各ウェルに培養液を滴下し DNA: PEI の混合物を追加。優しくプレートを扇動し、5% CO2と 37 ° C の定温器に戻ります。
- 日 5 (中型の変更は不要です) で収穫までこのトランスフェクション培地で細胞を維持します。
- DNA トランスフェクションの準備
- 1 日目と2 日目、トランスフェクション効率を評価するために倒立蛍光顕微鏡下で pCMV GFP プラスミドをトランスフェクトした細胞を観察します。
注: ここでは、10 X 蛍光顕微鏡の/10 × アイピースとの組み合わせで 0.25 開口目的が使用されたと 450-490 nm 励起帯域通過フィルターと 515-565 nm バンドパス排出フィルターが採用されました。上記の条件は通常以上の 70% のトランスフェクション効率を得られます。細胞は無血清条件による形態学的変化 (例えば細胞がスリムになっている) を示すことがあります。 - 日 3-5、5% CO2と 37 ° C の定温器でトランスフェクション細胞の培養に進みます。
- 日 5細胞とウイルス含有培地 15 mL ポリプロピレン製の円錐管に上下ピペッティングによる、または収集細胞スクレーパーでこする。
- 使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。
3 AAV 定量のドット プロット法
- ウイルス粒子の回収
- すぐに 37 ° C の水浴中凍結チューブを解凍します。渦セルから AAV の回復を最大限に 1 分は積極的にチューブ。
- 10 分の 4 ° C で 3,700 × g で遠心分離によって細胞の残骸をペレットします。各チューブから上清 200 μ L を取るし、ドット プロット法のスクリュー キャップとラベルの付いた微量遠心チューブにそれを転送します。
注: 因数遠心に残りの上清は管し、将来使用するため-80 ° C で凍結保存します。ここでは、スクリュー キャップ付けポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用と o リングが使用されました。タイトなシールが AAV とフェノール クロロホルムの流出を防ぐために必要です。
- セラチアエンドヌクレアーゼによる治療
- ミックス A とミックス B 試薬 (表 3) を準備します。ミックス A の 10 μ L と各チューブにミックス B の 10 μ L を追加します。渦管 5 s、簡単にスピン チューブの底に液体を収集し、37 ° C でチューブを少なくとも 1 時間インキュベートするチューブ。
注: ミックスは水酸化ナトリウムが含まれています、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼによる治療のための pH を最適化します。ミックス B マグネシウムをサプリメントします。市販酵素株のs. の marcescensエンドヌクレアーゼの濃度が異なる場合があります。S. marcescensエンドヌクレアーゼのボリュームは、3.2.1 の手順でチューブにミックス、ミックス B を追加した後 200 U/mL に調整する必要があります。
注: 長いインキュベーション時間を 4 時間に減らすことができますバック グラウンド信号。 - 孵化の最後に、トップ チューブの側面から結露・ ソリューションを収集するベンチトップ遠心チューブ簡単にスピンします。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、-20 ° C または-80 ° C で凍結保存できます。
- ミックス A とミックス B 試薬 (表 3) を準備します。ミックス A の 10 μ L と各チューブにミックス B の 10 μ L を追加します。渦管 5 s、簡単にスピン チューブの底に液体を収集し、37 ° C でチューブを少なくとも 1 時間インキュベートするチューブ。
- プロティナーゼ K の治療
- ミックス C 試薬 (表 3) を準備します。各チューブにミックス c 180 μ L を追加します。渦 5 管 s、簡単にチューブをスピンし、1 h 55 ° C でチューブを孵化させなさい。
注: ミックス C 試薬で EDTA 自由なマグネシウム イオンをキレート、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼを不活性化します。 - 孵化の終わりには、室内温度に達するまでサンプルを許可して簡単にスピン チューブ トップとチューブの側面から結露・ ソリューションを収集するベンチトップ遠心分離機。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは、-20 ° C または-80 ° C で凍結保存できます。プロトコルを再開、完全にバッファーに格納されている SDS の結晶を溶解する 5 〜 10 分のための 55 の ° C でチューブをインキュベートします。
- ミックス C 試薬 (表 3) を準備します。各チューブにミックス c 180 μ L を追加します。渦 5 管 s、簡単にチューブをスピンし、1 h 55 ° C でチューブを孵化させなさい。
- フェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿
- サンプルと 1 分のためにそれらは ≥16、室温で ≥5 分 100 × g で遠心機でサンプルをスピン渦にフェノール クロロホルム 200 μ L を追加します。
注意: フェノール クロロホルムは適切な個人用保護具 (PPE; の化学発煙のフード処理必要があります。すなわち、ニトリル手袋、ゴーグル、フェイスシールドや長袖の白衣)。 - 水層 (P200 ピペットで 2 回 160 μ L) の 320 μ L を新しい標準遠心チューブ (水溶液の液量の 80%) に転送します。
注: 水溶液サンプル間の同じ量を取ることが重要です、それ以外の場合アッセイが量的な正確さを失います。 - ミックス D 試薬 (表 3) を準備します。各チューブにミックス D の 833 μ L を追加します。渦管 5 s、≥20 分-80 ° c チューブを孵化させなさいと。
注: ミックス D、エタノール、酢酸ナトリウムと DNA の便利なエタノールの沈殿物のためにグリコーゲンの混合物です。サンプルは、この手順で-80 ° C で保存できます、プロトコルを後で再開することができます。 - ≥16 で遠心機、4 ° c で ≥15 分間 100 × g で遠心分離機サンプルは上澄みを離れて注ぎ、一度きれいなペーパー タオルの上にしみ。70% のエタノールの約 500 μ L を入れ各チューブ渦 5 s、および遠心分離用管 ≥16、≥5 分の 4 ° C で 100 x g でベンチトップ遠心機チューブ。
- 一度きれいなペーパー タオルの上にしみし、上澄みを離れて注ぐ。65 ° C で乾燥ペレットペレットを完全に乾燥することができます。
注: は、チューブをしみが付くことの後に残っている余分なエタノールを削除するのにピペットを使用しないでください。ペレットは、一晩にも室温で乾燥することができます。ここで一時停止できるプロトコルと乾燥 DNA ペレット格納できる室温で数日間管蓋を閉めた状態します。
- サンプルと 1 分のためにそれらは ≥16、室温で ≥5 分 100 × g で遠心機でサンプルをスピン渦にフェノール クロロホルム 200 μ L を追加します。
- TE バッファーでウイルスの DNA の再懸濁
- TE バッファーの 120 μ の DNA ペレットを室温で 1 時間に 30 分の各チューブを揺することによって溶解します。
- ドットのしみ
- プラスミド DNA の基準の作成
- 水またはトリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.0) に 10 ng/μ L に AAV ベクター ゲノム プラスミド DNA を希釈します。この希釈の 1 h 50 μ L の反応量にプラスミド DNA をリニア化するための適切な制限の酵素のダイジェスト 25 μ L を取る。
注: 我々 は消化の重複セットを作る (3.6.4.1 の手順を参照してください)。適切な酵素は、ドットのしみプローブ結合領域外プラスミド DNA を切る 1 つをする必要があります。便宜上、希釈したプラスミド DNA 検体 (25 μ L/チューブ) をすることができます、保存将来の使用のための-20 ° C で凍結します。チューブ ステップ 3.5.1 で揺れている間は、プラスミド DNA を消化します。プラスミド DNA 標準以上消化しません。 - 消化プラスミッド DNA の標準を含んでいる管に水または TE の 450 μ L を追加し、徹底的に混ぜます。この混合物の 70 μ L を水や希釈プラスミド標準 (25 pg/μ L) に TE の 1,330 μ L で新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
- 表 4 2 倍連続希釈 (600 μ L/チューブ) のセットを作成するに従ってください。5 のボルテックスによって希釈を徹底的にミックス s。
- 水またはトリス塩酸バッファー (10 mM、pH 8.0) に 10 ng/μ L に AAV ベクター ゲノム プラスミド DNA を希釈します。この希釈の 1 h 50 μ L の反応量にプラスミド DNA をリニア化するための適切な制限の酵素のダイジェスト 25 μ L を取る。
- 標準およびウイルスの DNA サンプルの変性
- 各標準希釈にアルカリ溶液 x 2 の 600 μ L を追加します。5 に 10 s. 加温 10 分の室温でのボルテックスでよく混ぜます。
- アルカリ溶液 x 2 の 120 μ L を各ウイルスの DNA サンプルに追加します。5 に 10 s. 加温 10 分の室温でのボルテックスでよく混ぜます。
- 点のしみの装置のセットアップ
- はさみを使用して、サンプルおよび標準の数の適切なサイズを (例えば、ゼータ プローブ) しみの膜をカットします。ドットのしみ装置にそれを置く前に 10 分のための水の膜を浸漬します。膜装置の未使用の井戸をカバーします。
注: は、清潔なピンセットで膜を処理します。空井戸をカバーするには、膜に付属している光の青い保護シートを使用できます。サンプルおよび標準のバインド前に乾燥膜ができないようにします。アセンブリおよび装置の使用の詳細については、ユーザー マニュアルの19を参照してください。 - サンプルが読み込まれる井戸に水を追加します。真空とプル エラーのチェックし、修正を再テストする井戸水を適用します。再密封を確保するために真空を適用しながらネジを締めます。
メモ: 不完全なシール井戸間サンプル漏れを原因します。 - 水は完全に引っ張られる、一度完全に真空を解放 (すなわち、真空マニホールドに開放する空気圧)。
- はさみを使用して、サンプルおよび標準の数の適切なサイズを (例えば、ゼータ プローブ) しみの膜をカットします。ドットのしみ装置にそれを置く前に 10 分のための水の膜を浸漬します。膜装置の未使用の井戸をカバーします。
- 標準およびドットしみ装置にサンプルの読み込み
- 各希釈プラスミド DNA 標準の 400 μ L を各ウェルに適用し、標準的な希薄の 4 車線を実行します。標準のダイジェストの 2 つの別々 の因数を使用し、各複製をロードします。各ウイルスの DNA サンプルの 200 μ L/ウェルを適用します。
注: 変性サンプルの残りの ~ 40 μ L を使用して、希釈サンプルを作成 (例えば、10 倍希釈サンプル サンプルの 20 μ L プラス アルカリ溶液 x 1 の 180 μ L を使用して) し、に応じてを消されました。 - 井戸を介して DNA ソリューションをプルする穏やかな真空を適用します。
注: 真空圧力真空圧はドット、部分的に三方弁の開始によって調整が必要なしみの雰囲気と同様、装置 (すなわち活栓の腕に配置、約 45 ° の角度でそれ大きく吸引ノイズになります)。 - すべての井戸を空にして、一度、三方バルブを調整することによって真空を解放します。標準およびサンプルに含まれている各ウェルにアルカリ溶液 x 1 の 400 μ L を追加します。井戸を空にするために真空を再適用する前に 5 分待ちます。
- 再度同じ方法で真空を適用 (3.6.4.2 の手順を参照してください)。
- 真空下でドットのしみ装置を分解、膜を削除および 2 ですすいでください x SSC。余分な 2 を削除する、DNA 結合の面にしてきれいなペーパー タオルの上に膜を置く x SSC。
- UV クロスリンク適切な UV 架橋; と膜にブロッティングの DNA膜は、交配のため準備が整いました。
メモ: ウェット膜は、UV 架橋に使用できます。乾燥、UV 架橋膜は室温で保存することができます。さらに詳しい情報は、テーブルの材料で見つけることが。
- 各希釈プラスミド DNA 標準の 400 μ L を各ウェルに適用し、標準的な希薄の 4 車線を実行します。標準のダイジェストの 2 つの別々 の因数を使用し、各複製をロードします。各ウイルスの DNA サンプルの 200 μ L/ウェルを適用します。
- プラスミド DNA の基準の作成
- 交配および洗浄
- ウォーム アップ 65 ° C の水浴の交配バッファー。
- 酵素によって放射性 α-32P dCTP を DNA プローブのラベルし、製造元の推奨によると市販のキットを使用してそれを浄化します。
注: 0.5-2.0 のプローブを用いてエンハンサー プロモーター領域またはウイルスのゲノムのタンパク質コーディング シーケンスからの長さで kb。このプロトコルは、信号検出32P 標識放射性プローブを利用して、非放射性化学発光や蛍光プローブも使用できます (ディスカッションセクションを参照してください)。 - DNA バインド側の交配瓶の中膜を上に置き、リンス 5 ml 膜 prewarmed 交配バッファーとバッファーを破棄します。Prewarmed 交配バッファーの 10 mL を追加し、65 ° C で設定回転ハイブリダイゼーション オーブンでボトルを配置≥5 分を回転させます。
- 100 ° C で熱ブロック セットに管を置くことによって 10 mg/mL 変形ニシンやサケ精子 DNA ソリューションと32P 標識プローブ (≥107 cpm) 5 分の 20 μ L の熱変性します。スナップを簡潔に、スピン、≥2 分間氷の上チルそれら、使用するまで氷の上を維持します。
注意: 放射性 DNA プローブのスクリュー キャップと o リング 1.5 mL チューブを使用する必要があります。 - ボトルし、10 のボトルを振る変性精子 DNA および放射性プローブの交配で交配バッファーをすばやく追加ミックスする s。65 ° C のオーブンにボトルを戻り、≥4 h 65 ° C で回転でボトルを孵化させなさい。
- 交配が完了すると、回転を止める、交配ボトルを削除および防漏プラグ シール キャップ付け 50 mL の円錐管に放射性プローブ溶液を注ぐ。放射性物質の冷蔵庫は、適切なコンテナーにプローブを格納します。
注: 4 ° C で保存されているプローブで使われた交配バッファー再使用できます、少なくとも 5 回 5 分間 100 ° C の水浴の交配バッファーを含む防漏プラグ シール キャップ付け 50 mL の円錐管を配置することによって。 - 65 ° C まで加熱洗浄バッファーで膜を洗浄します。交配ボトルに 20 に 30 mL の洗浄バッファーを追加し、5 分これは 2 回以上洗って繰り返し回転させます。
注: 洗浄溶液の放射能を測定し、ローカルの所で必要な場合、それを記録します。 - 膜を洗浄しながら 5 分イメージ消しゴムの画面をイメージング蛍光体を配置します。
- 第 3 洗浄後交配ボトルから膜を削除、ペーパー タオルで膜に余分なバッファーを削除、透明なプラスチックのペーパー ホルダーに膜を配置します。ガイガー カウンターを使用して膜の放射性の信号を確認してください。一夜にして信号強度に応じて 10 分間膜に消去された蛍光イメージング画面を公開します。
- システムをスキャン蛍光画像を用いた画面をスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。
- データ分析
- スプレッドシートとデータ解析ソフトウェア (たとえばExcel) を使用して標準曲線を描画します。
注: ログ-ログ線形回帰は、標準曲線を描画する使用されました。 - 補間によってウイルスの DNA のサンプルのそれぞれのナノグラムと同等 (ng eq) を決定します。Ng eq は、DNA ウイルスの DNA の分子の数に相当する標準曲線を描画するために使用するプラスミドの量です。プラスミド DNA の長さが 8,000 の場合 bp、単一座礁させた AAV ウイルス DNA の 1 ng eq は 2.275 × 108粒子に対応します。
注: ng eq はウイルス粒子の数を次の数式によって変換できます。
AAV の粒子の数は、従来"vg"(ベクトル ゲノム) または「DRP」(DNase 私耐粒子) として表されます。 - 出発原料の AAV の濃度を計算します。ブロッティング ウイルス DNA が 66.7% を表すので
開始材料でウイルスの DNA の 1 ng eq は、1.7 倍の 109粒子/mL に対応
。
注: を失わず膜の原料に含まれているすべてのウイルス DNA をにじませる場合は、この修正は必要ありません (図 1参照)。
- スプレッドシートとデータ解析ソフトウェア (たとえばExcel) を使用して標準曲線を描画します。
開始材料でウイルスの DNA の 1 ng eq は、1.7 倍の 109粒子/mL に対応
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Representative Results
大規模な生産精製 AAV ベクター株式を定量化するため、定量的なドット ・ ブロットの代表的な結果を図 1に示します。このドットのしみアッセイで二本鎖 AAV2G9 CMV GFP ベクトル株式の価を測定しました。ベクトルは、セシウムの塩化物 (CsCl) 密度勾配超遠心法に続いて前述20として透析の 2 つの円形によって精製した.一般に、精製の AAV ベクター株各 AAV ベクター素材 (例えば、0.3 μ L、0.1 μ L、0.03 μ L) の 3 つの異なるボリューム変更と重複で上記ドットしみプロシージャに服従するが。ステップ 3.2、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼの代わりに DNase I 酵素 A が使用され (材料表参照) 3.4 の手順で抽出・ ウイルスの DNA を精製する市販のキットを使用します。図 1に示す例では、各のプラスミド DNA 標準 (図 1 a) から得られた信号強度値 (任意の単位) を相関関係を示す標準曲線 (図 1 b) を描画する知られている DNA の量に対してプロットしました。0.998 の係数。この標準曲線を使用すると、それによって決定された補間 AAV2G9 ベクトルの 0.3、0.1 0.03 μ 因数が 1.487 と 1.522 の ng eq (0.3 μ L)、0.487 と 0.507 の ng eq (0.1 μ L) 0.158 と 0.171 の ng eq (0.03 μ L) を示したこと。これは次の 6 つの値を与えた: 4.957、5.073、4.870、5.070、5.267 と 5.700 ng eq/μ この特定 AAV2G9 ベクトル株式 5.16 ± 平均 0.27 ng-eq/μ L (平均 ± SD) をリードします。使用標準 (pEMBL-CMV-GFP) が 5,848 プラスミドの長さ以来 1011英領バージン諸島/mL方程式 2ステップ 3.8.2 x 8.0 に bp、この AAV2G9 ベクターの力価を求めた。この試金は、AAV ベクター株式の最終価を決定するために少なくとも二回繰り返されます。
VP3 キャプシド アセンブリと薬学会合同の能力異種起源の VP3 蛋白質を組み立てるための AAP の依存関係を評価するために相互補完の試金の代表的な結果は、図 2に表示されます。In vitro研究 AAV の多くの場合結論は、ウイルスの精製を必要としない、意味のある結果を生成するための十分な粗セル lysates とウイルスを含んだ培など unpurified ウイルス製剤を用いた実験です。この実験では、AAV のウイルスの粒子の生産は定量的ドット プロット法による蛇 AAV VP3 の AAP の組み合わせを含む、AAV9、AAV5 の間ですべての AAV VP3 AAP 組み合わせから評価されました。重複している一連の実験で得られたサンプルが 1 倍と 10 倍希釈液で消された (セット A とセット B図 2 a、それぞれ)。図 2 bに示すようなグラフは、ドットの定量分析をまとめたものです。結果: (1) AAV5VP3 アセンブル AAP がトランス、(2) AAP5 と AAP9 することができますを促進 AAV9VP3 キャプシド アセンブリ AAP5 AAP9、(3) より効果的に以下の機能が提供されるかどうかに関係なく、AAP5 も AAP9 展示活動を推進アセンブリ蛇 AAV VP3 で (4) 蛇 AAP は蛇 AAV VP3 のアセンブリを促進します。(1) と (2) で以前観察6日、一意に特定の AAV の VP3 AAP に沿ってヘビ AAV における相互作用はこの実験で新発見。定量的なドットのしみに基づくクロス否定回路試金の 1 つの弱点はネガティブ コントロールが常に完全に排除することはできません背景信号のかなりのレベルを示しています。したがって、それ自体でドット プロット法の可能性を排除できないアッセイの感度より下のレベルにそのキャプシドを組み立てます。この点、ネガティブ コントロールを生成するためでキャプシド VP3 蛋白質の不在で指数関数的にレプリケートする AAV ウイルス ゲノムの下で条件を使用することに注意してください。このような否定的なコントロールは、pAAV 記者、pHLP レップ pHelper (表 2) と HEK 293 細胞株によって生成することができます、偽陽性を減らすために使用されます。
DNase 私用いられているドットのしみ、AAV を定量化するためのアッセイの qPCR ベースでヌクレアーゼとして残留プラスミド Dna と AAV 準備を汚染している包装のウイルスのゲノムを削除します。これらの汚染物質の抗体; の過大評価につながるそうでなければしたがって、ヌクレアーゼ消化はウイルスのゲノム抗体を正確に定量化するための非常に重要なステップです。DNase 私の酵素が様々 なメーカーや商用ベンダーから利用できます。ただし、DNase の選択の重要性 AAV の定量では、過小評価されているに表示されます。上記手順 2 で説明されている AAV ベクターを含む文化メディアからバック グラウンド信号を除去する能力を比較した次の 3 つの核酸分解酵素ヌクレアーゼの選択がドット プロット法の成果に与える影響を調査するため3: DNase 私酵素 A、DNase I 酵素 B、およびs. の marcescensエンドヌクレアーゼ (材料表)。発表された研究は、元の 2 つの DNase を使用している私の以前のS. marcescensエンドヌクレアーゼと電流酵素13,21,22,23,24私たちを使用しています。研究。驚いたことに、DNase I 酵素 A はすべてではないテスト、様々 な条件でウイルスを含むメディアを使用するドットのしみの試金のための適切な選択の結果ネガティブ コントロール、DNase I 酵素 B 中から高いバック グラウンド信号が分かった。S. marcescensエンドヌクレアーゼが DNase I 酵素 B されてバック グラウンド信号を効果的に削減し、〜 s. の marcescensエンドヌクレアーゼ (図 3 a, B) のよりも倍効果的。DNase I 酵素 C はバック グラウンド信号 (データは示されていない) を減らすために非常に効果的であることもわかった。これらのデータは、酵素反応は unpurified AAV 準備されるヌクレアーゼ消化は効果が小さい必要がありますが市販核酸分解酵素の酵素活性に有意差があることを示す精製ウイルス preps の数量は、最適化された条件の下で扱われます。したがって、これらのデータは unpurified AAV 準備定量的ドットのしみまたは qPCR 測定を受けるときにアッセイのヌクレアーゼの正しい選択の重要性を強調表示します。
図 1: CsCl 精製 AAV ベクターの力価を決定する代表的な点のしみの分析。(A) 二重鎖 AAV2G9 CMV GFP ベクトルは標準的な大規模な無料のアデノ ウイルス 3 つのプラスミド トランスフェクション法によって HEK 293 細胞で生産され、2 回の透析に続いて CsCl 勾配遠心により精製しました。0.3、0.1 0.03 μ L (右端の列の消された) 精製 AAV ベクター素材の複製されたプラスミド DNA 標準 (Std) の 2 つのセットの重複の定量的ドット プロット法を受けた。しみは32P 標識 GFP プローブ (0.77 kb)、交配し、システムをスキャン蛍光画像を用いた画像を得た。(B) A 知られているプラスミド DNA 量 (ng eq、x 軸) とドットの強度 (任意の単位 (AU)、y 軸) との関係を示した曲線標準。Y 軸上の数字は、システムをスキャン蛍光画像が得られました。R は、ピアソンの相関係数を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: AAV VP3 AAP クロス補完ドット プロット法。二本鎖 AAV CMV GFP ベクトル粒子生産から AAV5、AAV9、およびヘビ AAV VP3 蛋白質の同種薬学会合同のまたは異種起源の薬学会合同の存在の有無で試験しました。(A) アッセイは、 S. marcescensエンドヌクレアーゼと 4 h の培養時間 (セット A とセット B) 実験の生物学的重複セットで行われ、それぞれの組み合わせから得られる AAV ベクター価を定量的なドットで測定しましたしみのプロトコル セクションで説明する方法。各ドットが 3 分の 2 を表す (5, 6 行、66.7%) または 2 数 (7、8 行、6.7%) 中の各 200 μ L から回復 DNA のサンプルまたは負の制御から収集します。トップ 4 つの行 (1 ~ 4 行) は、(すなわち、線形の pEMBL CMV GFP プラスミドを二本鎖 AAV CMV GFP ベクトル生産に使用されるプラスミドである) の重複で消されたプラスミッド DNA 標準 (STD 1 および STD 2) の 2 つのセットを表します。ドットしみの膜は、 32P 標識 GFP プローブとプローブでした。角丸長方形で示されているドットのペアは、マイナス コントロールです。上部の 2 行 (STD 1) 元のしみの下からがカットされ両方のプラスミッドの規格 (STD 1、STD 2) を並べて表示する画像の輝度を変更することがなく先頭に移動します。この操作は、図の黒い線で示されます。(B) ウイルス抗体価を測定した VP3 の組み合わせとドットで AAP タンパク質アッセイのしみ。グラフは、データ、2 つのパネルから、表示されていない別のドットしみから 2 つの生物学的 quadruplicated のセットを表します。誤差範囲を示す平均 ± SD (n = 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: unpurified AAV ベクターの準備の別の核酸分解酵素の酵素活性の比較。(A) A 定量ドットしみ背景信号を排除することでそれぞれのヌクレアーゼの治療の有効性を示します。二本鎖 AAV9 CMV GFP ベクトルを含む準備 (「AAV9 ベクトル」) であり、「いいえキャプシド コントロール」プラスミド Dna の HEK 293 細胞トランスフェクションによって生成されるアッセイを受けます。いいえキャプシド コントロールはウイルス粒子が含まれていないが、指数関数的に増幅された包装 CMV GFP ベクトル ゲノムに含まれています。MgCl2は媒体に 0.8 mM MgSO4を考慮せず 1 つまたは 3 倍推奨量 (6 mM と DNase I 酵素 A の 18 mM と 2.5 mM と DNase I 酵素 B の 7.5 mM) で補われました。S. marcescensエンドヌクレアーゼと治療のプロトコル セクションで説明されている 1 つだけの条件を調べた。すべてのサンプルは、1 h のそれぞれのヌクレアーゼと扱われました。ドットしみの膜は、 32P 標識 GFP プローブとプローブでした。右側の 2 つの列 (STD 2) 元のしみの左から、カットされ両方プラスミド標準 (STD 1 および STD 2) 側を表示する画像の輝度を変更することがなく、右に移動します。この操作は、図に細い黒い線で示されます。パネル A いいえキャプシド コントロールのサンプル (B) ドットの定量化し、平均 ± として表示 | 各値-平均値 |DNase I (アスタリスクで示される) 酵素 A と扱われる 12 個の試料のうち、7 はわずか最高水準に比べて高い値を表示します。したがって、彼らは、このグラフの比較のために含まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| セラチアエンドヌクレアーゼ バッファー | |
| 50 mM トリス-HCl | |
| 2 mM MgCl2 | |
| 4 M NaOH で pH 8.5 に調整されます。 | |
| プロティナーゼ K バッファー x 10 | |
| 100 mM トリス塩酸 pH 8.0 | |
| 100 mM EDTA pH 8.0 | |
| 5% SDS | |
| アルカリ溶液 x 2 | |
| 800 mM NaOH | |
| 20 mM EDTA | |
| 20 x SSC (1 L) | |
| 175.3 g 塩化ナトリウム | |
| 88.2 g クエン酸第三ナトリウム (Na3C6H5O7) | |
| Denhardt のソリューション 100 (50 mL) x | |
| 1 g ウシ血清アルブミン (分数 V) | メモ: フィルタ リングが背景の交配のシグナルを起こす小さな粒子を除去するために重要です。 |
| 1 g Polysucrose 400 | |
| 1 g ポリビニルピロリドン | |
| 55 ° C の水浴の水 20 mL で溶解します。 | |
| 50 mL に最終的な音量を調整します。 | |
| 0.22 μ m のフィルターとフィルター滅菌します。 | |
| 交配バッファー | |
| 1% SDS | 注: ストア交配バッファー 4 ° C から 65 ° C 使用する水のお風呂前に熱で。 |
| 6 x SSC | |
| Denhardt のソリューション x 5 | |
| 10 mM トリス塩酸 pH 8.0 | |
| 洗浄バッファー | |
| 0.1% SDS | |
| 0.1 x SSC | |
| ポリエチレンイミン (PEI) ソリューション (1 mg/mL, 500 mL) | |
| 450 mL の水に 500 mg プリンスエド ワード島を加え、かき混ぜます。 | 注: 長期保管のため-80 ° C お勧めします。 |
| ダウンして pH をもたらすに濃塩酸を追加 < PEI を溶解する 2.0 (塩酸約 800 μ L 必要となります)。 | |
| させる pH 7.0 まで 10 M NaOH を追加 (約 500 μ L の 10 M NaOH 必要になります)。 | |
| 水 500 mL にボリュームを調整します。 | |
| 0.22 μ m のフィルターとフィルター滅菌します。 | |
| 因数と-20 ° C にてストア | |
| フェノール クロロホルム (1:1 の混合) を定量的なドットのしみが付くことの | |
| バッファー飽和フェノール (pH 8.0) を追加し、クロロホルム 50 mL ポリプロピレン円錐管で 1:1 の比率で。 | 注: 有機層をカバー バッファーがピペッティングをサンプル管に持ち越すことができる場合は、チューブに残って、不正確な測定をすることができます。 |
| 渦ミックスに、積極的にチューブ。 | |
| 遠心分離によって、相分離の許可し、水層を完全に削除します。 | |
| 4 ° C でのストア | |
表 1: ソリューションとバッファー調理法。ソリューションや定量的なドットを完了するために必要なバッファーのレシピしみのプロトコル。
| プラスミド | AAP(+) (μ g) | AAP(-) (μ g) | ネガティブ コントロール (μ g) | トランスフェクション コントロール (μ g) |
| pCMV AAVx VP3 | 0.4 | 0.4 | ||
| pCMV フラグ AAPx | 0.4 | |||
| pAAV 記者 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | |
| pHLP 担当者 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | |
| pHelper | 0.4 | 0.4 | 0.4 | |
| pCMV (空) | 0.4 | 0.8 | ||
| pCMV GFP | 2.0 | |||
| 合計 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
表 2: AAV VP3 AAP クロス否定回路試金のためのプラスミド組み合わせ 6 ウェル プレート形式で実行します。各実験群の HEK 293 細胞トランスフェクションに使用される Dna のプラスミッドの組み合わせが表示されます。pCMV AAVx VP3、AAV の血清型を発現プラスミド x (x = 1, 2, 3、等) CMV IE エンハンサー - プロモーター; VP3 蛋白質pCMV フラグ AAPx、AAV の血清型を発現プラスミド x (x = 1, 2, 3、等) CMV IE エンハンサー - プロモーター; AAP タンパク質2 つの反転 AAV2 ターミナル繰り返し (ITRs) を持ち、組換え AAV のベクトル生産のために設計されたプラスミド pAAV 記者AAV2 担当者のタンパク質を発現するプラスミド pHLP レップpHelper、アデノ ウイルス ヘルパー プラスミド;pCMV (空)、実験条件を制御する追加空プラスミド成功したトランスフェクションを確認する蛍光マーカーの (例えばGFP) 遺伝子を発現するプラスミド pCMV GFP。Transfections は 6 ウェル プレートで行い 2 μ g のプラスミド Dna の合計を使用します。
| ミックス A | 10 管 (μ L) |
| セラチアエンドヌクレアーゼ バッファー | 91.2 |
| 0.1 M NaOH | 8.8 |
| 合計 | 100 |
| ミックス B | 10 管 (μ L) |
| セラチアエンドヌクレアーゼ バッファー | 91.2 |
| 1 M MgCl2 | 7.04 |
| セラチアエンドヌクレアーゼ (250 単位/μ L) | 0.176 |
| 合計 | 100 |
| ミックス C | 10 管 (μ L) |
| プロティナーゼ K バッファー x 10 | 400 |
| プロティナーゼ K (20 mg/mL) | 100 |
| H2O | 1,300 |
| 合計 | 1,800 |
| ミックス D | 10 管 (μ L) |
| 100% エタノール | 8,000 |
| 3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) | 320 |
| カキのグリコーゲン (20 mg/mL) | 10 |
| 合計 | 8,330 |
テーブル 3: マスター ミックス試薬の一覧。ミックス A と B ミックスは、3.2 でs. の marcescensエンドヌクレアーゼ処理に使用されます。これら 2 つの混合物は、マグネシウムの水酸化物の沈殿を防ぐために、別々 にすべきであります。ミックス C はプロテイナーゼ K 処理手順 3.3 で使用されます。ミックス D は、3.4.3 の手順でエタノールの沈殿物のために使用されます。表に示すボリュームは、10 管用マスター ミックス試薬です。
| プラスミド DNA 標準 (ng) | 25 pg/μ L プラスミド DNA 標準液量 (μ L) | 水の量 (μ L) | 合計量 (μ L) |
| 5 | 600 | 0 | 600 |
| 2.5 | 300 | 300 | 600 |
| 1.25 | 150 | 450 | 600 |
| 0.625 | 75 | 525 | 600 |
| 0.313 | 37.5 | 562.5 | 600 |
| 0.156 | 18.8 | 5,812億 | 600 |
| 0.078 | 9.4 | 590.6 | 600 |
| 0.039 | 4.7 | 595.3 | 600 |
表 4: 定量的ドットしみプラスミド DNA 標準。25 pg/μ L プラスミド DNA 標準溶液と水、または TE 2 倍連続希釈 (600 μ L/管) によるプラスミド DNA 標準を準備するのに必要なボリュームが表示されます。プラスミド DNA の標準列の数値 (0.039 に 5 ng) プラスミド DNA 標準溶液 200 μ L の DNA の量います。
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Discussion
本報告では、AAV 薬学会合同とキャプシド アセンブリでの役割を研究する定量的ドットしみアッセイの有用性を説明します。これらの研究から得られた知識は、AAV キャプシド アセンブリの過程で生得的な違いとそれぞれ異なる血清型間薬学会合同の機能的役割に関する詳細情報を提供できます。この点で、AAV VP3 AAP クロス補完ドットしみアッセイ蛇 AAV VP3 はキャプシド アセンブリの同種の AAP の共発現に厳格な依存関係を表示して蛇 AAP が異種血清型のキャプシド アセンブリを促進しないことを明らかにしました。.AAP 依存 AAV の血清型をので、この観察は興味をそそられる以前調べた (AAV1、2、3、6、7、8、9、および 12) すべて異種 AAP6を利用してある程度、少なくともアセンブリを処理することができます。
定量的ドットまたはスロットしみの交配は、便利な方法25で同時に複数のサンプルに含まれている核酸の定量のための伝統的な方法です。メソッドは、qPCR 流行した 1990 年代26,27まで DNA および RNA の定量に広く使用されていた。それはまたエラーを無意識のうちに、指数関数的に増大するという事例だった固有の危険を運ぶ qPCR 定量的ドットしみ上利点がある、他の交配に基づく試金、qPCR の展示より高い感度、広いダイナミック レンジ、qPCR13,23によって決まります AAV ベクター株式の価の定量的ドットしみ試金は低コストを簡単に設定および研究者はどちらか放射性プローブとハイブリダイズ ドットのしみの膜からの信号を取得することができます定量的分子イメージング システムへのアクセスを持っている限り、簡単に実施または非放射性化学発光や蛍光プローブ。このプロトコルは、信号検出32P 標識放射性プローブを利用して、他は正常に直接付けられて市販の耐熱性アルカリフォスファターゼ28非放射性 DNA プローブを使用します。点のしみの試金を使用して、単純明快な原則とひとりでにアッセイは実行者への技術的課題をもたらさないしたがって、結果は一般に経験の浅い個人によっても再現可能です。
ここで説明したアプリケーション以外にも日常的にすぐに AAV 粒子の半定量化することができますドットしみプロシージャの簡便かつ迅速なバージョンを使用します。このコンテキストではドットのしみアッセイの利点があります: (1) アッセイは、浄化を必要としないまたはサンプルの AAV 粒子を破るのに十分な時間、(2) 熱とアルカリ変性の組み合わせがかかるウイルス ゲノムの酵素の拡大ソリューションとリリース ドットしみの膜、(3) 高い塩の存在にバインドする準備ができているソリューションにウイルスのゲノムを変性試料中濃度分析結果を大幅に影響しません。たとえば、だ CsCl の豊富なソリューション (例えば、CsCl 密度勾配遠心分画) で半定量化すること AAV 粒子小さい因数 (≤10 μ L) を置くことによって 100 ° に加熱のアルカリ溶液 x 1 の 100 μ L にサンプルの10 分、または事前に準備された、15 分交配、3 x 3 分の洗浄および 15 分間画面をイメージング蛍光体への暴露が続く (または減らされた放射能でプローブを使用するときより長い) の基準がなければ膜にしみが付くことのための C。全体の手順は、ユーザーが手順を知ってになると 1 h で完了ことができます。習慣「沸騰ドットしみ方法」と呼んでこの優先メソッドを使用して、AAV を識別するために、ベクトル浄化中粒子リッチ CsCl 分数の処理して、前に大規模な精製 AAV ベクター株式の価を決定します。ベクトル評価するプロセス。したがって、ドットのしみアッセイは、核酸を定量化し、科学訓練の広い範囲でさまざまな pcr 方法は既に交換済みの古いメソッドと見なすかもしれないがまだ必要がありますこのメソッドに利点の数研究者は自分の研究室で採用を検討をします。
プロトコルの最も重要なステップは、サンプルのヌクレアーゼ治療です。このステップが最適な状態で実施していない場合、それは高いバック グラウンド信号を引き起こすでしょう。我々 は DNase、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼを使用して私の異なるソースの酵素はウイルス DNA の定量化のため他の所で広く使用されています。DNase ウシ膵臓由来の私は、研究者によって最も広く使用されています。これは部分的に私が最初ウシ膵臓 DNase、29が最も広く特徴付けられる生化学的識別するためです。DNase 私・組成分析(DNase I 酵素 A) (例えばDNase I 酵素 B)、ウシの膵臓から精製したネイティブ形式などいくつかの異なる生物学的ソースから商用ベンダーから現在利用可能な酵素が生産され、酵母種または大腸菌(DNase I 酵素 C) で生産する組換え酵素。我々 はことを発見した DNase 私 3 つすべてのこれらの異なる源からの酵素は、AAV ベクター定量研究; で使用されています。しかし、私たちの知る限りでは、以前の研究のどれもはさまざまなソースから酵素が AAV ベクターの準備で汚染の DNA 分子を消化で均等に有効かどうかを検討しました。注意してくださいその DNase 私 AAV ベクターの試金のための治療がしばしば培養液中や細胞由来不純物の存在のための非最適化の条件の下でなされる。DNase I 酵素 A のみを用いて培地の部分的にアクティブな観察は、ドットのしみと qPCR、AAV ベクターを定量化するためのアッセイの設計に大きな影響を与えます、この未知の問題に研究者に警告。この点では、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼエシェリヒア属大腸菌に表現は AAV ベクターの製造を目的としてだけでなく、AAV ベクターを定量化するための理想的なエンドヌクレアーゼです。マグネシウム イオンと 1 価の陽イオンの濃度や pH 値の広い範囲でその酵素活性を保つことができるためです。このため、定期定量点がサザンブロット解析でs. の marcescensエンドヌクレアーゼを使用することを好む我々S. marcescensエンドヌクレアーゼが DNase I 酵素 B 単位ごとに約 2 倍ほど高価です。
定量的ドットしみアッセイは、要約すると、さまざまな条件下でのウイルスの粒子を生産する能力で容易に情報を提供する比較的簡単な手順です。QPCR などの代替のあるアプローチと比較してこの方法は、ほとんどの最適化を必要があります。それは、血清型のベクトルにも容易に適用できるし、価両方単一- と二本鎖ベクトル プロトコルを変更せずに使用することができます。Transfections と AAV ベクターを含むサンプル (培養液中や細胞) の収穫、全体のプロトコルで完了できる日、従って急速になど、多様な条件からウイルス粒子を生成する能力について質問に答えるAAV VP3、AAP の蛋白質の様々 な組み合わせ。定量的ドット ・ ブロットは、VP AAP の相互作用に関するさまざまな疑問とさまざまに異なる血清型 AAV と菌株のキャプシド アセンブリでの役割に対処する適切な方法を提供しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
シャオシャオ ノースカロライナ大学チャペルヒル校でにありがとう pEMBL CMV GFP プラスミドを提供してくれる。原稿の批判的な読み、クリストファー ・ チェンとサミュエル ・ j ・黄に感謝します。この作業によって支えられた公衆衛生サービスを付与 (NIH R01 NS088399 ・ T32 EY232113)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25 |
MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
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