Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Эта рукопись подробности блот assay просто точка для количественный титры аденоассоциированный вирус (AAV) и ее применение для изучения роли Ассамблеи активации белков (ГПД), Роман класса неструктурных вирусных белков, обнаруженных в всех AAV серотипов, в деле содействия Ассамблее capsids, производные от родственных и гетерологичных AAV серотипов.

Abstract

Хотя аденоассоциированный вирус (AAV) широко признается как вектор привлекательным для генной терапии, она также служит вирус модель для понимания биологии вируса. В последнем случае недавнее открытие неструктурных AAV белка, называют Ассамблеи активация белка (AAP), пролили новый свет на процессы в Ассамблее вирусного капсида VP белков в капсида. Хотя многие AAV серотипов требуют AAP для Ассамблеи, мы недавно сообщили что AAV4, 5, 11, и исключения из этого правила. Кроме того мы показали, что ГПД и собрал capsids различных серотипов локализации для различных внутриклеточных отсеков. Этот неожиданный гетерогенность в биологических свойств и функциональной роли ГПД среди различных AAV серотипов подчеркивает важность исследований по ГПД, полученных от различных серотипов. Эта рукопись подробности блот assay просто точка для AAV количественный и ее применение для оценки AAP зависимостей и серотип специфичность в Ассамблее капсида. Чтобы продемонстрировать полезность этот assay блот точка, мы отправились в характеризуют капсид Ассамблеи и АПУ зависимость змея AAV, ранее uncharacterized рептилий AAV, а также AAV5 и AAV9, которые ранее было показано, быть AAP-независимые и зависимые от АПУ серотипов, соответственно. Assay показали, что змея AAV капсид Ассамблея требует AAP змея и не может поддерживаться ГПД от AAV5 и AAV9. Assay также показал, что, в отличие от многих общих Серотипа ГПД, способствующих гетерологичных капсид Ассамблеи по кросс комплементарности, змея АПУ не поощрять Ассамблея AAV9 capsids. Кроме того мы показываем, что выбор нуклеиназы значительно влияет на индикации пробирного блот точка, и таким образом, выбор оптимального фермента имеет решающее значение для успешной оценки AAV титры.

Introduction

Аденоассоциированный вирус (AAV) является небольшой, не охватило, одноцепочечной ДНК вируса с геном приблизительно 4,7 kilobases (КБ). AAV геном содержит фреймы (ORFs) открыть чтение для генов rep и Кап . В 2010 году ранее неизвестные неструктурных белков, кодируемых + 1 кадра смещается ORF внутри ген AAV2 колпачок был обнаружен Sonntag et al. и играть решающую роль в Ассамблее AAV2 капсид VP мономера белков в Вирусный Капсид1. Ассамблея активация белка (AAP) был назван этот роман белок той роли, которую она играет в содействии капсид Ассамблея1.

ORFs для АПУ были определены bioinformatically в геномах всех parvoviruses в рамках род Dependoparvovirus, но не геномов вирусов различных родов парвовирус семьи1,2. Функциональные исследования этого романа белка первоначально были сосредоточены на АПУ от прототипа AAV2 (AAP2), которая создала важную роль AAP2 в ориентации разобранном виде VP белки ядрышко для их накопления и формирования в полностью собрал capsids1,3,4. AAV2 capsids неспособность собрать в отсутствие AAP выражения был независимо подтверждены несколько групп, в том числе наш1,2,3,4,5 . Последующие исследования на AAV серотипы 1, 8 и 9 подтверждают решающую роль ГПД в Ассамблее капсида, как VP3 мономера белки AAV1, 8, и 9 были не в состоянии сформировать полностью собранный капсида в отсутствие совместного выражения AAP2.

Недавно, через подходов, которые включают в себя использование количественных точка помаркой анализов, мы исследовали способность AAV1 12 VP3 мономеров собрать в capsids в отсутствие экспрессии АПУ и способность AAP1 до 12 для содействия Ассамблее VP3 мономеров из гетерологичных серотипов. Это исследование показало, что AAV4, 5 и 11 VP3 мономеров могут собираться без АПУ. Кроме того, было установлено, что восемь из двенадцати ААР серотипов, мы рассмотрели (то есть, все, кроме AAP4, 5, 11 и 12) отображаются широкие возможности для поддержки капсид Ассамблеи гетерологичных AAV серотип capsids, а AAP4, 5, 11 и 12 отображается существенно ограниченные возможности в этой связи6. Эти четыре серотипов филогенетически далеких от других AAP серотипов2,3. Кроме того исследования обнаружили значительную гетерогенность в субцеллюлярные локализации различных ГПД6. Кроме того, исследование показало, что плотный ассоциации АПУ с собрал capsids и ядрышко, отличительной чертой AAV2 капсид Ассамблеи, обязательно не может распространяться на другие серотипы, включая AAV5, 8 и 9, которые отображают ядрышковые исключение собрал capsids6. Таким образом информация, полученная от изучения любого конкретного серотип АПУ не широко применимо для всех AAP биологии. Такие загадочные характер AAP биологии подчеркивает необходимость изучить роль и функции каждого АПУ от канонического и неканонических AAV серотипов.

Биологическая роль АПУ в Ассамблее капсид может оцениваться путем определения титры полностью упакованы AAV вирусных частиц производится в человеческих эмбриональных почек (ГЭС) 293 клетки, наиболее часто используемых клеточная линия для производства вектора AAV, с или без белка АПУ выражение. Стандартные методы для AAV количественный являются количественного PCR (ПЦР)-7,на основе анализов8 и количественные точка на основе блот assays9. Другие методы для AAV вирусных частиц количественный например иммуноферментного анализа10,11 или измерения оптической плотности12 не являются идеальными для образцов, полученных от многих различных серотипов AAV или образцов загрязненные примесей (сырой лизатов или культуры средств массовой информации), которые часто образцов, используемых для AAV исследований. В настоящее время ПЦР наиболее широко используется для AAV количественный; Однако это необходимо признать возможных предостережений на основе ПЦР анализа, как assay может привести к системной ошибки и титр значительные вариации13,14. На основе ПЦР анализов страдают от ряда потенциально привходящих факторов, таких как присутствия ковалентно закрытых терминала заколки в PCR шаблоны, которые тормозят амплификации13. Даже опытный человек может ввести потенциал отягощающих факторов на основе ПЦР анализа неосознанно13. В отличие от количественных точка анализов помаркой являются метод классической молекулярной биологии, который не включает амплификацию генома и использует гораздо проще принцип с минимальным риском ошибок по сравнению с на основе ПЦР анализов. Этот метод является менее технически сложной; Таким образом результаты анализа достаточно воспроизводимости даже неопытными лицами.

В настоящем докладе мы описываем методологические детали анализа помаркой количественной точки, мы обычно используем для вектора AAV количественный и являют собой пример, как применять пробу для изучения роли Ассамблеи содействие ГПД в общем серотипов (AAV5 и AAV9) и ранее uncharacterized АПУ от змея AAV14. В природе Аав VP белков и АПУ белки выражаются в СНГ от одного гена (то есть, VP-АПУ СНГ дополнения), а в assay, описанные здесь, вице-президент и АПУ белки поставляются в транс от двух отдельных плазмид (т.е., VP-АПУ Транс дополнения). Поскольку каждый VP или АПУ белка из различных серотипов может быть выражена от каждого независимого плазмида, становится возможным проверить гетерологичных VP-АПУ сочетания капсид сборки (то есть, VP-АПУ кросс дополнения). Кратко AAV VP3 из различных серотипов выражается в клетках ГЭС 293 плазмида ДНК трансфекции пакет генома вектора AAV в наличие или отсутствие родственных серотипа АПУ, или в присутствии гетерологичных серотип АПУ. После производства культуры средств массовой информации и lysates клетки подвергаются блот пробирного точка для количественного определения вирусного генома в оболочке капсида. Первый этап анализа помаркой точка является для лечения образцы с нуклеиназы удалить загрязняющие плазмида ДНК и неупакованных AAV геномов в образцах. Неспособность сделать это приведет к увеличению сигналов фона в частности когда assayed неочищенную образцы. Затем следуют протеазы лечения вирусных capsids и выпустить нуклеиназы стойкие вирусных геномов в образце решения. Далее, вирусных геномов денатурированный, смыл на мембрану и гибридизированных с зондом вирусной ДНК генома специфичные для количественный. В примере assay сообщили здесь мы показываем, что змея AAV VP3 требует змея AAP капсид Ассамблеи и что змея АПУ не содействовать Ассамблее AAV9 capsids в отличие от многих ГПД, производный от АПУ зависимых серотипов, которые могут также содействовать Ассамблее гетерологичных серотип capsids. Наконец мы сообщаем важное предостережение для ПЦР или точка на основе блот AAV количественный assays, что выбор нуклеиназы существенно влияет на результаты анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: В таблице 1приводятся рецепты для решения и буферов, необходимых для этого протокола. Для assay блот VP-АПУ кросс дополнения точка для изучения роли AAP белков в Ассамблее капсид протокол, описанные ниже. Метод для более общий Блот assay количественных точка для очищенного титрования вектора AAV объясняется в разделе Представитель результаты .

1. Строительство VP3, АПУ и AAV2 Rep, выражая плазмиды

  1. Строительство pCMV-AAVx-VP3 (x = серотипов)
    1. ПЦР усиливают весь VP3 ORF (1.6 КБ) с использованием высокой верности ДНК-полимеразы и следующая пара грунтовка: VP3 вперед, CTAA-RE1-CACC-N25 (первые 25 нуклеотидов VP3 ORF); VP3 обратный, TCTT-RE2-N25 (последние 25 нуклеотидов VP3 ORF).
      Примечание: RE1 и RE2 являются сайты для ферментов (REs) ограничения для клонирования. CTAA и TCTT являются терминал 5' и 3' tetranucleotides, добавлены для облегчения пищеварения энзима ограничения в конце двуцепочечной ДНК. CACC представляет собой последовательность Козак консенсуса.
    2. Клон продукты RE-digested PCR между соответствующими RE сайты вектора млекопитающих выражение, использующее человека цитомегаловирус немедленно ранний (ЦМВ-IE) усилитель промоутер для высокого уровня выражения.
      Примечание: Для молекулярного клонирования, дайджест 5 мкг ДНК плазмиды позвоночника с restriction enzyme(s) при концентрации 4 U/мкг ДНК за 1 ч при оптимальной температуре. Для ПЦР фрагментов увеличьте единицы ферментов используются (например, 10 U/мкг продукта VP3 ORF PCR 1.6 КБ) и длиннее время инкубации (например, 4 ч) за счет увеличения числа сайтов признание энзима ограничения на единицу длины. Полезная информация в молекулярной биологии ферментов и клонирования процедур, включая бактериальные преобразований можно найти в других15,16,17.
  2. Строительство pCMV флаг-AAPx (x = серотипов)
    1. ПЦР усиливают весь ORF AAP (0,6 КБ) за исключением первого аминокислота с использованием высокой верности ДНК-полимеразы и следующая пара грунтовка: АПУ вперед, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 нуклеотидов от 4 нуклеотидов в AAP ORF); AAP обратный, TCTT-RE2-N25 (последние 25 нуклеотидов AAP ORF).
      Примечание: GACTACAAGGACGACGATGACAAA коды тег флаг, который было показано, имеют пагубные последствия4,5 , но может быть опущен, если ненужным.
    2. Клон продукты RE-digested PCR между соответствующими сайтами млекопитающих выражение вектора с ЦМВ-IE усилитель промоутер15,16,17.
  3. Строительство pHLP-Rep
    1. Digest 5 мкг плазмида pAAV-RC2 (7.3 КБ) с 20 единиц каждого Xho я и Xcm и очистить с помощью коммерческих комплект очистки ДНК ДНК или экстракцией фенола и хлороформа.
      Примечание: Удаление 1.8 kb Xho я-Xcm которую я отрывок из 7.3 КБ pAAV-RC2 плазмида приводит к потере экспрессии белков капсид VP при сохранении Rep белков.
    2. Тупой ДНК заканчивается 6 единиц T4 ДНК-полимеразы, агарозы гель Очистить фрагмента ДНК 5,5 КБ и самостоятельно перевязать очищенный фрагмента, используя 50 до 100 нг ДНК и 400 единиц T4 ДНК лигаза согласно производителя рекомендации15.
    3. Следуйте процедуре стандартных бактериальных преобразование ссылаться на шаге 1.1.2 Примечание.
  4. Убедитесь, что плазмидные конструкции Пищеварение энзима ограничения и секвенирования15,18.
  5. Выполните плазмида minipreps или maxipreps, с помощью коммерчески доступные наборы получить достаточное количество плазмидной ДНК для вниз по течению AAV производства экспериментов.

2. производство AAV в ГЭС 293 клеток путем плазмида ДНК Transfection (кросс дополнения проба)

  1. Культура клетки 293 ГЭС в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM)-высокая глюкозы (4,5 г/Л) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллина и стрептомицина микс и 1 мм L-глютамином, 37 ° C инкубатор с 5% двуокиси углерода (CO2).
    Примечание: Аав титры значительно варьироваться в зависимости от источника ГЭС 293 клеток.
    Предостережение: Хотя AAV могут быть обработаны на биобезопасности уровня 1 (BSL1) сдерживания, BSL2, сдерживания рекомендуется для работы ГЭС 293 клеток.
  2. День -1 (24 ч до трансфекции), плита 6 – 7 x 105 293 ГЭС клеток/колодец в 2 мл полной среды, описанные в шаге 2.1 в знаке 6-хорошо. Это обычно достигает ~ 90% confluency следующий день.
  3. День 0: Transfection
    1. Подготовка к трансфекции ДНК
      1. Убедитесь, что клетки достигли confluency ~ 90%.
      2. Разминка DMEM дополнен с 1% пенициллина и стрептомицина Mix и 1 мм L-глютамином, но без 10% FBS (т.е., сыворотка бесплатно средних) в ванну воды 37 ° C.
      3. Дайте раствору polyethylenimine (PEI) до комнатной температуры.
    2. Подготовка смеси ДНК плазмиды
      1. Смешайте плазмид в 96 мкл фосфатный буфер (PBS) без CaCl2 или2 MgCl в стерильных 1,5 мл microcentrifuge трубы, как указано в таблице 2. Общее количество ДНК-2 мкг/хорошо.
        Примечание: Объемы для плазмида ДНК решения могут быть проигнорированы, если они являются номинальной. Регулировка громкости рекомендуется если общий объем растворов ДНК плазмиды ≥10 мкл.
    3. Трансфекция ПЭЙ
      1. Мкл 4 PEI раствора (1 мг/мл) в PBS-плазмида ДНК смесь (подготовлен как выше). Окончательный объем составляет примерно 100 мкл (5% объема питательной среды). Вихревой трубы кратко и инкубировать ДНК: Пей смесь 15 мин при комнатной температуре.
      2. Время ожидания для инкубации 15 мин для завершения, замените подогретую сыворотки бесплатно среднего, описанные в шаге 2.3.1.2 питательной среды.
      3. После инкубации 15-мин ДНК: Пей смесь является полным, кратко спин трубы с microcentrifuge для сбора жидкости в нижней части трубы и добавить смесь ДНК: Пей каплям питательной среды в каждой скважине ГЭС 293 культуры пластины. Аккуратно агитировать пластины и вернуть их до 37 ° C инкубатор с 5% CO2.
      4. Сохранить в этой среде transfection клетки до сбора урожая в день 5 (без среднего изменения требуется).
  4. День 1 и 2 деньсоблюдайте transfected клеток с pCMV-GFP плазмида под Перевернутый флуоресцентным микроскопом оценить эффективность трансфекции.
    Примечание: для микроскопии флуоресцирования, здесь 10 X / 0,25 числовая апертура цель в сочетании с 10 × окуляра была использована, и 450-490 Нм возбуждением полосового фильтра и 515-565 Нм полосовой фильтр выбросов были заняты. Вышеизложенные условия обычно дает более чем 70% трансфекции эффективность. Клетки могут проявлять некоторые морфологических изменений (например клетки стали тонкий) из-за состояния сыворотки бесплатно.
  5. На 3-5 днейпо-прежнему культура transfected клеток в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
  6. На 5 деньСоберите клетки и вирус содержащих среднего в 15 мл полипропиленовые пробирки конические закупорить вверх и вниз или соскоб с скребок ячейки.
  7. Хранение образцов-80 ° C до использования.

3. точка блот Assay для AAV количественный

  1. Восстановление вирусных частиц
    1. Быстро разморозить замороженные трубы в ванну воды 37 ° C. Вихревой трубы энергично за 1 мин для максимального восстановления AAV из клеток.
    2. Пелле мусора клетки центрифугированием при 3700 x g на 4 ° C на 10 мин. Взять 200 мкл супернатант от каждой трубы и перенести его в обозначенные microcentrifuge трубу с винтовой крышкой для assay блот точка.
      Примечание: Алиготе оставшиеся супернатант в microcentrifuge трубки и хранить их замороженные при температуре-80 ° C для использования в будущем. Здесь Трубы полипропиленовые microcentrifuge придает с колпачки и уплотнительное кольцо были использованы. Жесткие уплотнения не требуется для предотвращения разливов AAV и фенол хлороформ.
  2. Лечение с Serratia marcescens эндонуклеазы
    1. Подготовьте смесь A и B смеси реагентов (Таблица 3). Добавьте 10 мкл смесь A и 10 мкл Mix B в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s, кратко спин трубы для сбора жидкости в нижней части трубы и инкубировать трубы при 37 ° C по меньшей мере за 1 час.
      Примечание: Смеси A содержит NaOH и оптимизирует pH для лечения с S. marcescens эндонуклеазы. Mix B добавки магния. Концентрации S. marcescens эндонуклеазы запасов коммерчески доступных фермента может варьироваться. Объем S. marcescens эндонуклеазы необходимо соответственно скорректировать сделать 200 ед/мл после добавления смесь A и Mix B в пробирки на шаге 3.2.1.
      Примечание: Длиннее время инкубации, до 4 ч, может снизить фон сигналов.
    2. В конце инкубации кратко спин трубы с настольная центрифуга для сбора конденсата и решение от сверху и с боков трубы.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить замороженные при-20 ° C или -80 ° C.
  3. Лечение протеиназы K
    1. Подготовьте смесь C реагент (Таблица 3). Мкл Mix C 180 в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s, кратко спин трубы и инкубировать трубы при 55 ° C за 1 час.
      Примечание: ЭДТА в смеси C реагент chelates ионы магния бесплатно и инактивирует S. marcescens эндонуклеазы.
    2. В конце инкубации позволяют образцов до комнатной температуры и кратко спин трубы с настольная центрифуга для сбора конденсата и решение от сверху и с боков трубы.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить замороженные при-20 ° C или -80 ° C. Чтобы возобновить протокол, Инкубируйте трубы при 55 ° C за 5-10 мин распустить SDS кристаллы, полностью содержащихся в буфере.
  4. Фенол хлороформ добычи и этанола осадков
    1. 200 мкл фенол хлороформ, образцы и вихревой их за 1 мин спина образцы в microcentrifuge в ≥16, 100 x g ≥5 мин при комнатной температуре.
      Предупреждение: Фенол хлороформ должны обрабатываться в Химический вытяжной шкаф с соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; т.е., нитриловые перчатки, защитные очки или щит и лаборатории пальто с длинными рукавами).
    2. Перевести 320 мкл водный слой (160 мкл дважды с пипеткой Р200) новой стандартной microcentrifuge трубки (80% водного объема жидкости).
      Примечание: Жизненно важно принять такой же объем водный раствор между образцами, в противном случае теряет assay количественных точности.
    3. Подготовьте смесь D реагента (Таблица 3). Мкл микс D 833 в каждую пробирку. Вихревой трубы для 5 s и инкубировать трубы на-80 ° C для каналов ≥20 мин.
      Примечание: Смеси D представляет собой смесь этанола, натрия ацетат и гликогена для удобного этанола осадков ДНК. Образцы можно хранить при температуре-80 ° C на этот шаг и протокол может быть позднее возобновлен.
    4. Центрифугуйте образцы с microcentrifuge в ≥16, 100 x g при 4 ° C для мин Pour ≥15 покинуть супернатант и один раз пятно на чистой бумажной салфеткой. Положите около 500 мкл 70% этанола в каждую пробирку, вихревой трубы для 5 s и центрифуги трубки с benchtop microcentrifuge в ≥16, 100 x g при 4 ° C для ≥5 мин.
    5. Слить супернатант и один раз пятно на чистой бумажной салфеткой. Сухие гранулы при температуре 65 ° C; Гранулы можно высушить полностью.
      Примечание: Не используйте пипетку для удаления избыточных этанола, который остается после промокательной трубы. Гранулы можно также сушить при комнатной температуре на ночь. Протокол может быть приостановлена здесь и сухие гранулы ДНК может храниться при комнатной температуре в течение нескольких дней с закрытой крышкой трубки.
  5. Ресуспендирования вирусной ДНК в буфере TE
    1. Растворяют гранулы ДНК в 120 мкл буфера TE путем встряхивания каждой трубе, за 30 мин до 1 ч при комнатной температуре.
  6. Точка помаркой
    1. Подготовка стандартов плазмида ДНК
      1. Разбавьте вектора AAV генома плазмидной ДНК до 10 нг/мкл в воде или буфер Tris-HCl (10 мм, pH 8.0). Взять 25 мкл этой разрежения и дайджест с соответствующей энзима ограничения за 1 ч до линеаризации плазмида ДНК, в реакции объем 50 мкл.
        Примечание: Мы делаем дубликат набора пищеварения (см. шаг 3.6.4.1). Соответствующие фермента должен быть один, который режет плазмида ДНК за пределами региона зонд привязки блот точка. Для удобства, разбавленным плазмида ДНК может быть aliquoted (25 мкл/труба) и хранятся замороженные при температуре-20 ° C для использования в будущем. Дайджест плазмидной ДНК, в то время как трубы дрожат в шаге 3.5.1. Не чрезмерно дайджест плазмидной ДНК стандарта.
      2. 450 мкл воды или TE трубка, содержащая переваривается плазмидной ДНК стандартных и тщательно перемешать. Трансфер 70 мкл этой смеси в новой пробки microcentrifuge 1,5 мл с 1330 мкл воды или TE сделать разреженных плазмида стандарт (25 ПГ/мкл).
      3. Следуйте в таблице 4 для создания набора два раза серийных разведений (600 мкл/трубка). Тщательно перемешать разведений, vortexing для 5 s.
    2. Денатурировать вирусной ДНК образцов и стандартов
      1. 600 мкл 2 x щелочной раствор, для каждой стандартной разрежения. Смешайте хорошо vortexing для 5 до 10 s. инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
      2. Мкл 120 2 x щелочной раствор для каждого вирусной ДНК образца. Смешайте хорошо vortexing для 5 до 10 s. инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Настройка аппарата блот точка
      1. Использование ножницами, вырезать промокательной (например, Зета зонд) мембраны для соответствующего размера для количество образцов и стандартов. Замочите мембраны с водой на 10 минут перед его размещением на аппарат блот точка. Обложка неиспользуемых скважин на аппарат мембраны.
        Примечание: Ручка мембраны с чистым пинцетом. Чтобы покрыть пустой скважин, может использоваться светло синий защиты листа, который поставляется с мембраной. Не позволяйте мембраны высохнуть до обязательных образцов и стандартов. Для более подробной информации о Ассамблеи и использовании аппарата пожалуйста, обратитесь к руководство пользователя19.
      2. Добавьте воду колодцев, которые будут загружены образцы. Применение вакуума и тянуть воду через скважины для проверки ошибок и тестирование при фиксированной. Снова затяните винты при применении вакуум для обеспечения жесткие уплотнения.
        Примечание: Неполная герметизация может привести к утечке образца между скважинами.
      3. После того как вода полностью вытащил, освободить вакуум полностью (т.е., вакуумный коллектор должен быть открыт для давления воздуха).
    4. Загрузка стандарты и образцы для аппарата блот точка
      1. Применить 400 мкл каждого разреженных плазмидной ДНК стандарт для каждой скважины и запустить четыре полосы стандартных растворов. Использовать два отдельных аликвоты стандартная дайджест и загружать каждый в двух экземплярах. Примените 200 мкл/хорошо каждого вирусной ДНК образца.
        Примечание: Используя оставшиеся ~ 40 мкл денатурированного образцов, разбавленным образцы могут быть подготовлены (например, десятикратного разреженных образцы с использованием 20 мкл пример плюс 180 мкл 1 x щелочной раствор) и смыты при необходимости.
      2. Примените нежный вакуумный тянуть решения ДНК через скважины.
        Примечание: Вакуума давление необходимо скорректировать, частично открыв трехходовой клапан, так что вакуумного давления применяется к точка пятно аппарата, а также атмосфера (т.е., с краном оружия, дислоцированные в примерно 45 ° угол где он шумит громче всасывания).
      3. После того, как все колодцы опустели, отпустите вакуум, регулируя трехходовой клапан. Мкл 400 1 x щелочной раствор для каждой скважины, содержавшего стандарты и образцы. Подождите 5 минут до повторного применения вакуума для очистки скважины.
      4. Повторно применить вакуум таким же образом (см. шаг 3.6.4.2).
      5. Разберите аппарат блот точка под вакуумом, удалить мембрану и промойте его с 2 x SSC. Место мембраны на чистое бумажное полотенце ДНК прыгните стороной чтобы удалить избыток 2 с x SSC.
      6. УФ crosslink блотирования ДНК мембраны с соответствующей сшивателя УФ; мембрана теперь готов для гибридизации.
        Примечание: Мокрый мембраны может использоваться для УФ сшивки. Сушеные, УФ сшитый мембраны может храниться при комнатной температуре. Дополнительную информацию можно найти в Таблице материалов.
  7. Гибридизация и мытья
    1. Разминка в гибридизации буфер в ванне с водой 65 ° C.
    2. Ферментативно ярлык ДНК зонд с радиоактивными α -32P дЦТФ и очистить его с помощью коммерчески доступные наборы согласно рекомендации производителя.
      Примечание: Мы используем зонд 0,5 – 2,0 в длину от региона усилитель промоутер или последовательности кодирвоания протеина в вирусного генома КБ. Хотя этот протокол использует 32P-меченых радиоактивные датчики для обнаружения сигнала, нерадиоактивных хемилюминесцентный или флуоресцентных зондов может также использоваться (см. раздел " обсуждение ").
    3. Мембраны в бутылке гибридизации с ДНК прыгните стороной вверх, Промойте мембрану с 5 мл подогретую гибридизации буфер и отбросить буфера. Затем добавляют 10 мл подогретую гибридизации буфера и поместите бутылку в вращающейся печи гибридизации на 65 ° C. Вращайте ≥5 мин.
    4. Тепло денатурируют 20 мкл 10 мг/мл стриженый сельди или решения ДНК лосося спермы и 32P-меченых зонд (≥107 cpm) для 5 мин, поместив трубы на наборе блок тепла при 100 ° C. Затем оснастка холод их на льду ≥2 мин, спина кратко и держать на льду до использования.
      Предупреждение: Для радиоактивных ДНК-зонды, должны использоваться 1.5 мл пробирок с винтовой крышкой и уплотнительным кольцом.
    5. Быстро добавить спермы денатурированной ДНК и радиоактивных зонд гибридизации буфер в гибридизации бутылки и встряхнуть бутылку для 10 s смешивать. Вернуться 65 ° C духовке бутылку и инкубировать и бутылка с вращением на 65 ° C для ≥4 h.
    6. После гибридизации, остановить вращение, удалите гибридизации бутылки и затем Залейте раствор радиоактивных зонд в 50 мл Конические трубки с герметичным уплотнением колпачок. Храните зонд в соответствующий контейнер, помещены в холодильник для радиоактивных материалов.
      Примечание: Используется буфер гибридизации с зондом, который хранится при температуре 4 ° C может повторно использоваться по крайней мере 5 раз, поместив 50 мл Конические трубки с герметичным уплотнением колпачок, содержащий буфер гибридизации в ванну воды 100 ° C за 5 мин.
    7. Промойте мембрану мыть буфера, нагревают до 65 ° C. Добавить 20-30 мл буфера мыть бутылки гибридизации и повернуть на 5 мин повторить это мыть 2 еще раз.
      Примечание: Измерения радиоактивности Вымойте решения и записать его, если требуется местных институтом.
    8. Во время стирки мембрана, место светомассы изображений экрана на ластика изображения на 5 мин.
    9. После третьей стирки Удалить мембрану из бутылки гибридизации, удалить излишки буфера на мембрану с бумажными полотенцами и место мембраны в прозрачные пластиковые бумаги держатель. Проверьте радиоактивных сигналов на мембрану с помощью счетчика Гейгера. Разоблачить изображений экрана стирается фосфора мембраны для 10 минут в ночь в зависимости от интенсивности сигнала.
    10. Сканирование на экран с помощью образа фосфора, сканирование системы и получить данные об интенсивности сигнала каждой точки.
  8. Анализ данных
    1. Нарисуйте калибровочной кривой с помощью таблиц и данных анализа программного обеспечения (например, Excel).
      Примечание: Log-log – линейная регрессия использовалась для рисования кривой стандартного.
    2. Определите нанограмм эквивалент (нг экв) для каждого из образцов вирусной ДНК методом интерполяции. Нг eq-это количество плазмида ДНК используется для рисования кривой стандартного, эквивалентное количество вирусных молекул ДНК. Когда плазмидной ДНК длиной 8000 bp, 1 нг eq вирусной ДНК одноцепочечной AAV соответствует 2.275 x 108 частиц.
      Примечание: Нг eq может быть преобразован в число вирусных частиц следующих уравнений:
      Equation 1
      Equation 2
      Количество частиц AAV условно выражена как «вол» (вектор геномов) или «DRP» (я устойчивые частицы DNase).
    3. Вычислите AAV концентрации исходных материалов. Потому что блотирования вирусной ДНК представляет собой 66,7% Equation 3 вирусной ДНК в исходных материалов, 1 нг eq соответствует 1,7 x 109 частиц/мл Equation 4 .
      Примечание: Данное исправление не требуется, если все вирусной ДНК, содержащихся в исходный материал смыл на мембране без потери (см. Рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представитель результат помарки количественных точка для количественный очищенный запасов вектора AAV, производится в крупных масштабах показан на рисунке 1. С этой точкой блот assay титр двунитевая AAV2G9-ЦМВ-GFP вектор фондовой было определено. Вектор был очищен от двух раундов хлорида цезия (CsCl), градиент плотности ultracentrifugation следуют диализа как описано20. В общем очищенный запасов вектора AAV, три различные объемы каждой акции вектора AAV (например, 0,3 мкл, 0.1 мкл и 0,03 мкл) подвергаются точка блот процедурой, описанной выше в двух экземплярах с модификацией. DNase I энзим A используется вместо S. marcescens эндонуклеазы шаге 3.2, и коммерчески доступных комплект для извлечения и очистки вирусных ДНК используется в шаге 3.4 (см. Таблицу материалы). В примере, показанном на рисунке 1значения интенсивности сигнала (произвольный блок), полученные от каждого плазмидной ДНК стандарт (рис. 1A) были заговоре против известных количеств ДНК для рисования кривой стандартного (рис. 1B), показаны корреляции коэффициент 0,998. С помощью этой стандартной кривой, он определяется интерполяции 0,3 и 0,03-0,1 аликвоты мкл AAV2G9 вектора показал 1,487 и 1.522 нг eq (0,3 мкл), 0.487 и 0,507 нг eq (0.1 мкл) и 0,158 и 0,171 нг eq (0,03 мкл). Это дало следующие шесть значений: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 и 5.700 нг eq/мкл для этой конкретной AAV2G9 вектор фондовой, приводит к в среднем 5,16 ± 0,27 нг eq/мкл (среднее ± SD). Поскольку длина плазмида, используется как стандарт (pEMBL ЦМВ-GFP) 5,848 bp, титр данного вектора AAV2G9 был определен 8.0 x 1011 vg/мл по 2 уравнение на шаге 3.8.2. Этот assay повторяется по крайней мере дважды, чтобы определить окончательные титры запасов вектора AAV.

Представитель результат анализов кросс дополнения для оценки зависимостей AAP VP3 капсид Ассамблее и способность для ГПД собрать VP3 белки гетерологичных происхождения отображается на рисунке 2. В vitro исследования AAV часто не требуют очистки вируса делать выводы, и эксперименты с использованием неочищенную вирус препараты, такие как сырое lysates клетки и вирус содержащих культуры средств массовой информации достаточно для получения значимых результатов. В этом эксперименте производство вирусных частиц AAV оценивали от всех возможных комбинаций AAV VP3-АПУ среди AAV5, AAV9 и змея AAV, включая VP3-нет АПУ комбинации анализа помаркой количественной точки. Образцы, полученные в наборе дублируется эксперимента были смыты в 1 x и 10 x разведений (множества A и B установить в рисунок 2A, соответственно). Граф, показано на рисунке 2B кратко количественный анализ точек. Результаты показывают, что: (1) AAV5VP3 собирает независимо от того, является ли AAP была предоставлена в транс, (2) AAP5 и AAP9 могут содействовать Ассамблея капсид AAV9VP3, хотя AAP5 действует менее эффективно, чем AAP9, (3) ни AAP5, ни AAP9 экспонатов сборку, поощрение деятельности на VP3 AAV змея и (4) АПУ змея только способствует Ассамблеи змея AAV VP3. (1) и (2), с учетом предыдущих замечаний6, но однозначно определенных AAV VP3-АПУ взаимодействия в AAV змея – это роман открытие в этом эксперименте. Один недостаток пробирного кросс дополнения, основанные на количественных точка пятно в том, что отрицательный контроль всегда показывает заметных уровней сигналов фона, которые не могут быть полностью уничтожены. Таким образом, точка блот пробирного само по себе нельзя исключать, что капсид собирает до уровня ниже чувствительность assay. В этой связи следует отметить, что, сформировать негативный контроль, условие используется под которой AAV вирусных геномов экспоненциально реплицировать в отсутствие капсид VP3 белка. Такие негативные элементы управления могут быть получены путем transfecting ГЭС 293 клетки с pAAV репортер, pHLP-Rep и pHelper (Таблица 2) и используются для уменьшения ложных срабатываний.

DNase я широко использовался как нуклеиназы точка блот и на основе ПЦР анализов для AAV количественный для удаления остаточного плазмида ДНК и неупакованных вирусных геномов, которые загрязнены AAV препаратов. В противном случае эти загрязнители приведет к завышению титры; Таким образом пищеварение нуклеиназы является очень важным шагом для точного количественного определения вирусного генома титры. DNase я ферменты доступны от различных производителей и коммерческими поставщиками; Однако важность выбора DNase I в AAV количественный представляется были недооценивается. Исследовать, как выбор нуклеиназы может повлиять на результаты анализа помаркой точка, за их способность удалить фон сигналы из AAV вектор содержащих культуры средств массовой информации подготовила как описано выше в шагах 2 были сопоставлены следующие три nucleases и 3: DNase I A фермента, DNase I B фермента и S. marcescens эндонуклеазы (Таблица материалов). Опубликованные исследования использовали бывший два DNase я ферменты13,21,,2223,24 и мы использовали S. marcescens эндонуклеазы в предыдущих и текущих исследования. К нашему удивлению было определено, что DNase I энзим A вовсе не подходящим выбором для assay блот точка, с помощью вируса содержащих средств массовой информации в различных условиях испытания, что приводит к высокой фоновой сигналы от отрицательного контроля, при этом DNase I B фермента и S. marcescens эндонуклеазы эффективно уменьшить фон сигналы с DNase I B фермента, ~ 2 раза эффективнее, чем S. marcescens эндонуклеазы (рис. 3а, B). DNase I фермента C также оказалась весьма эффективной для уменьшения фона сигналов (данные не показаны). Эти данные показывают, что существуют значительные различия в ферментативной активности среди коммерчески доступных nucleases, когда ферментативных реакций выполняются неочищенную AAV препараты хотя нуклеиназы пищеварение должен быть эффективным, когда небольшой Количество очищенных вирусных парфюмерные рассматриваются в рамках оптимизированного состояния. Таким образом эти данные подчеркивают важность правильного выбора нуклеиназы в assay когда неочищенную AAV препараты проходят количественных точка пятно или ПЦР анализа.

Figure 1
Рисунок 1: анализ помаркой представитель точка для определения титра вектора AAV CsCl очищенная. (A) Double-stranded AAV2G9-ЦМВ-GFP вектор был подготовлен в клетках ГЭС 293 по стандартному аденовирусной бесплатно три плазмида transfection метод в крупных масштабах и очищенный двух раундов CsCl градиента ultracentrifugation, следуют диализа. 0,3, 0.1 и 0,03 мкл очищенного запасов вектора AAV (смыты в правой колонке) были подвергнуты блот assay количественных точка в двух экземплярах с двумя наборами дублируется плазмида ДНК стандартов (ЗППП). Пятно было гибридизированных с 32P-меченых GFP зонд (0,77 kb), и изображение было получено с помощью люминофора изображения, система сканирования. (B) A калибровочной кривой показаны отношения между известными плазмида ДНК количествах (нг eq, ось x) и точка света (произвольный блок (АС), ось y). Чисел на оси y были получены с изображением фосфора, сканирование системы. R означает коэффициент корреляции Пирсона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Аав VP3-АПУ кросс дополнения точка блот пробирного. Double-stranded AAV-ЦМВ-GFP вектор частицы производства была протестирована на VP3 белки от AAV5, AAV9 и змея AAV в присутствии или отсутствии их родственных ГПД или при наличии ГПД гетерологичных происхождения. (A) проба была исполнена в биологически дублируется набор экспериментов (множества A и B установить) с 4 h время инкубации с S. marcescens эндонуклеазы и титр вектора AAV, полученные из каждой комбинации определяется количественным точка метод, описанный в разделе протокол помаркой. Каждая точка представляет две трети (5 и 6 строк, 66,7%) или двух-thirtieths (7 и 8 строк, 6,7%) ДНК, оправился от каждого 200 мкл среднего собранных образцов или отрицательного контроля. Лучшие четыре строки (строки 1 – 4) представляют два набора стандартов плазмида ДНК (STD 1 и STD 2) смыты в двух экземплярах (то есть, линеаризованных плазмида pEMBL ЦМВ-GFP, который является плазмид, используемые для производства вектора AAV-ЦМВ-GFP двуцепочечной). Мембраны помаркой точка был исследован с зондом 32P-меченых GFP. Пара точек, отмеченные прямоугольники со скругленными углами являются негативные элементы. Топ две строки (STD 1) от нижней части оригинальной пятно, но были вырезать и переехал в верхней части без изменения интенсивности изображения для отображения обоих стандартов плазмида (STD 1 и STD 2) бок о бок. Эта манипуляция указывается с черной линией на рисунке. (B) вирусный титр определялся для комбинаций VP3 и АПУ белки, точка пятно пробирного. Граф представляет собой биологически quadruplicated набор данных, два от группы A и два из другой дот-блот, которая не отображается. Планки погрешностей указывает среднее + /-SD (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение ферментативных деятельности различных nucleases в неочищенную препараты вектора AAV. (A) A количественных точка блот показаны эффективность каждого нуклеиназы лечения в ликвидации фон сигналов. Подготовка вектор содержащих двуцепочечные AAV9-ЦМВ-GFP («AAV9 вектор») и «без капсид контроль» подготовил ГЭС 293 transfection клетки с плазмида ДНК и подвергается assay. Без капсид управления не содержат вирусные частицы, но содержащиеся экспоненциально усиливается неупакованных геном вектор ЦМВ-GFP. MgCl2 был дополнен на один или три раза рекомендованные суммы (6 мм и 18 мм для DNase I энзим A; и 2,5 мм и 7,5 мм для DNase I фермента B) без учета MgSO 0,8 мм4 , присутствующих в среде. Для лечения с S. marcescens эндонуклеазы был протестирован только одно условие, описанные в разделе протокол. Все образцы были относиться с каждой нуклеиназы за 1 ч. Мембраны помаркой точка был исследован с зондом 32P-меченых GFP. Сразу две колонки (STD 2) находятся слева от оригинальной пятно, но были вырезать и переехал вправо без изменения интенсивности изображения для отображения обеих плазмида стандартов (STD 1 и STD 2) бок о бок. Эта манипуляция указывается с тонкой черной линией на рисунке. (B) точки в без капсид контрольных образцов в группе A, количественно и отображаются как среднее ± | каждое значение — среднее значение |. Семь из 12 образцов, относились с DNase I A фермента (звездочкой) показывают значения, только немного выше, чем высокий стандарт; Таким образом они включены в этот график для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Serratia marcescens Эндонуклеазы буфер
Трис HCl 50 мм
2 мм MgCl2
Приспособиться к рН 8,5 с 4 M NaOH.
10 x буфер протеиназы K
100 мм трис-HCl рН 8,0
100 мм ЭДТА рН 8,0
5% SDS
2 x щелочной раствор
800 мм NaOH
20 мм ЭДТА
20 x SSC (1 Л)
175.3 г NaCl
88.2 g tribasic цитрат натрия (Na3C6H5O7)
Денхардта в раствор 100 x (50 мл)
1 g бычьим сывороточным альбумином (часть V) Примечание: Фильтрация имеет решающее значение для того, чтобы удалить мелкие частицы, как они вызывают сигналы гибридизации фона.
1 g Polysucrose 400
1 g поливинилпирролидона
Растворяют в 20 мл воды в водяной бане 55 ° С.
Настройте конечный объем до 50 мл.
Фильтр стерилизации с 0,22 мкм фильтром.
Гибридизация буфер
1% SDS Примечание: Магазин гибридизации буфер при 4 ° C и тепла до 65 ° C в воде баня до использования.
6 x SSC
5 x Денхардта в решение
10 мм трис-HCl рН 8,0
Вымойте буфера
0,1% SDS
0.1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) раствор (1 мг/мл, 500 мл)
Добавьте 500 мг PEI в 450 мл воды и перемешайте. Примечание: Для более длительного хранения, рекомендуется-80 ° С.
Добавить концентрированной HCl довести рН вниз к < 2.0 распустить Пей (примерно 800 мкл HCl потребуется).
Добавить 10 M NaOH довести рН до 7.0 (примерно 500 мкл 10 M NaOH потребуются).
Отрегулируйте громкость на 500 мл воды.
Фильтр стерилизации с 0,22 мкм фильтром.
Алиготе и хранить при температуре от-20 ° C.
Фенол хлороформ (1:1 смесь) для blotting количественных точка
Добавьте буфер насыщенный фенола (рН 8.0) и хлороформ в соотношении 1:1 в 50 мл полипропиленовые Конические трубки. Примечание: Буфер, охватывающих в органическом слое, если оставить в трубе, могут быть перенесены в образец трубки через закупорить и может сделать assay неточными.
Вихрь трубки энергично перемешивают.
Разрешить для фазы разделения центрифугированием и полностью удалить водный слой.
Хранить при 4 ° C.

Таблица 1: раствор и рецепты буфера. Рецепты для решения и буферов, необходимых для завершения количественных точка пятно протокол.

Плазмиды AAP(+) (мкг) AAP(-) (мкг) Отрицательный контроль (мкг) Трансфекция управления (мкг)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV флаг-AAPx 0.4
pAAV репортер 0.4 0.4 0.4
pHLP-Rep 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (пустая) 0.4 0,8
pCMV-GFP 2,0
Итого 2,0 2,0 2,0 2,0

Таблица 2: плазмида комбинации для AAV VP3-АПУ кросс дополнения assay выполнена в формате 6-ну пластина. Комбинации плазмидной ДНК, которые будут использоваться для ГЭС 293 transfection клеток в каждой экспериментальной группе показываются. pCMV-AAVx-VP3, плазмиды, выражая AAV серотип x (x = 1, 2, 3 и т.д.) VP3 белков под усилитель ЦМВ-IE-промоутер; pCMV флаг-AAPx, плазмиды, выражая AAV серотип x (x = 1, 2, 3 и т.д.) АПУ белков под усилитель ЦМВ-IE-промоутер; pAAV репортер, плазмиды, который имеет два AAV2 Перевернутый терминала повторяется (РМЭ) и предназначен для рекомбинантных вектора AAV производства; pHLP-Rep, плазмиды, выражая белка AAV2 Rep; pHelper, аденовирус вспомогательный плазмиды; pCMV (пустой), пустой плазмида, добавлены для управления в экспериментальных условиях; pCMV-GFP, плазмиды, выражая флуоресценции маркер ген (например, GFP) для проверки успешного transfection. Transfections проводятся в 6-ну пластин и использовать в общей сложности 2 мкг плазмидной ДНК.

Смесь A Для 10 труб (мкл)
Serratia marcescens Эндонуклеазы буфер 91.2
0,1 М NaOH 8.8
Итого 100
Mix B Для 10 труб (мкл)
Serratia marcescens Эндонуклеазы буфер 91.2
1 М MgCl2 7.04
Serratia marcescens Эндонуклеазы (250 единиц/мкл) 0,176
Итого 100
Mix C Для 10 труб (мкл)
10 x буфер протеиназы K 400
Протеиназы K (20 мг/мл) 100
H2O 1300
Итого 1800
Mix D Для 10 труб (мкл)
100% этанола 8000
Ацетат натрия 3 M (рН 5.2) 320
Ойстер гликогена (20 мг/мл) 10
Итого 8,330

Таблица 3: список мастер смеси реагентов. Смесь A и B смеси используются для лечения эндонуклеазы S. marcescens шаге 3.2. Эти две смеси должны быть сделаны отдельно для предотвращения осаждения гидроксида магния. Mix C используется для лечения протеиназы K на шаге 3.3. D сочетание используется для этанола осадков в шаге 3.4.3. Объемы, указанные в таблице, для основной смеси реагентов для 10 трубок.

Плазмида ДНК стандарт (НГ) Тома (мкл) 25 ПГ/мкл плазмида ДНК стандартное решение Тома (мкл) воды Общий объем (мкл)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37,5 562.5 600
0,156 18.8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Таблица 4: количественные точка блот плазмида ДНК стандарты. Приведены необходимые объемы 25 ПГ/мкл плазмида ДНК стандартного раствора и воды или TE подготовить плазмида ДНК стандартов по два раза серийных разведений (600 мкл/трубка). Числа в столбце Стандартная плазмида ДНК (0.039-5 нг) являются количество ДНК в 200 мкл каждого плазмида ДНК стандартные решения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящем докладе описан в полезности анализов помаркой количественных точка для изучения AAV ГПД и их роль в Ассамблее капсида. Знания, полученные от этих исследований может обеспечить подробное понимание врожденной различия в процессе AAV капсид Ассамблеи и функциональной роли ГПД между различными серотипов. В этой связи точка кросс дополнения AAV VP3-АПУ пятно пробирного, показали, что змея AAV VP3 отображается строгих зависимостей на совместное выражение его родственных AAP капсид Ассамблеи и что змея АПУ не поощрять капсид Ассамблеи гетерологичных серотипов . Это наблюдение интригующий, потому что АПУ зависимых AAV серотипов, изучались ранее (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 и 12) все способны обрабатывать Ассамблеи по крайней мере до некоторой степени, используя гетерологичных AAP6.

Количественные точка или слот блот гибридизации является традиционный метод для количественный нуклеиновых кислот, содержащихся в нескольких образцах в то же время в удобной форме25. Метод широко используется для ДНК и РНК количественный пока ПЦР стали распространенными в 1990-х26,27. Хотя ПЦР имеет преимущества по сравнению количественных точка блот и других анализов на основе гибридизации в этом ПЦР экспонаты высокой чувствительностью и более широкий динамический диапазон, она также носит неотъемлемый риск экспоненциально увеличивать ошибки неосознанно, который в случае для титры запасов вектора AAV, определяется ПЦР13,23. Анализов помаркой количественных точка легко настроить с недорогой стоимостью и легко осуществляется до тех пор, как исследователи имеют доступ к количественных молекулярной визуализации системы, которая может приобрести сигналы от мембраны помаркой точка гибридизированных с либо радиоактивных зонд или Нерадиоактивные хемилюминесцентный или флуоресцентный зонд. Хотя этот протокол использует 32P-меченых радиоактивные датчики для обнаружения сигнала, другие успешно используют нерадиоактивные ДНК-зонды, непосредственно помечены коммерчески доступных термостабильные щелочной фосфатазы28. Точка анализов помаркой используют простой принцип и пробирного само по себе не представляют собой технический вызов исполнителей; Таким образом результаты являются как правило воспроизводимости даже неопытными лицами.

Помимо приложений, описанных здесь мы регулярно использовать версию упрощенной и ускоренной процедуры блот точка, которая может частично количественно AAV частиц быстро. Преимущества анализов помаркой точка в этом контексте включают в себя: (1) проба не требует очистки или ферментационная амплификация вирусных геномов, который принимает часов, (2) сочетание тепла и щелочной денатурации достаточно, чтобы сломать AAV частиц в образце решение и выпуска денатурированный вирусных геномов в раствор, которые готовы связать мембраны помаркой точка и (3) присутствие соли на высокой концентрации в пробах не существенно влияет на результаты анализа. Например это можно частично количественно AAV частиц в CsCl богатые решения (например, фракции, полученные путем CsCl градиент плотности ultracentrifugation), поставив небольшой Алиготе (≤10 мкл) образцов в 100 мкл 1 x щелочной раствор, Отопление на 100 ° C за 10 мин и промокательной на мембрану с или без стандартов заранее подготовленные, следуют гибридизации 15 мин, 3 x 3 мин моет и подверженности светомассы изображений экрана 15 мин (или больше при использовании зонд с снижение радиоактивности). Вся процедура может быть завершена через 1 ч после того, как пользователь становится знаком с процедурой. Мы используем этот ускоренный метод, который мы обычно называем «кипящий точка помарка метод», для выявления AAV CsCl фракций частиц-богатые люди во время очистки вектор процесса и примерно определить титры очищенный запасов вектора AAV перед началом обширные процессы для вектор характеристик. Таким образом хотя точка анализов помаркой может рассматриваться как устаревшие метод количественной оценки нуклеиновых кислот и уже были заменены различные методы на основе ПЦР в широком диапазоне научных дисциплин, есть еще ряд преимуществ этого метода, который следует Сделайте исследователи считают, используя его в своих лабораториях.

Наиболее важным этапом в протоколе является лечение нуклеиназы образцов. Если этот шаг не осуществляется в оптимальном состоянии, это вызовет высокий фон сигналов. Мы используем S. marcescens эндонуклеазы во время DNase я ферменты различных источников широко используются в других лабораториях для вирусной ДНК количественной оценки. DNase, я из поджелудочной железы крупного рогатого скота происхождения наиболее широко используется исследователями. Это отчасти потому, что говядину поджелудочной железы DNase, я впервые выявлены и наиболее широко характеризуется биохимически29. DNase я ферментов в настоящее время доступны от коммерческих поставщиков изготавливаются из нескольких различных биологических источников, таких как Pichia сумка (DNase I A фермента), родной форме, очищенного от говядину поджелудочной железы (например, DNase I B фермента), и рекомбинантные энзимы производства дрожжей видов или кишечная палочка (DNase I фермента C). Мы обнаружили, что DNase я ферменты от всех трех этих различных источников были использованы в опубликованных исследований количественный вектора AAV; Однако насколько нам известно, ни одно из предыдущих исследований изучали ли ферменты из различных источников являются столь же эффективно переваривать загрязняющих молекул ДНК в подготовке вектора AAV. Следует отметить, что DNase я часто осуществляется лечение для анализов вектора AAV условиях неоптимизированный вследствие наличия примесей, производный от питательной среды и клетки. Наблюдение, что DNase I энзим A активен только частично в культурной среде, которую мы использовали имеет существенные последствия в проектировании assay для количественный вектора AAV точка блот и ПЦР и предупреждает исследователей этой ранее неизвестные проблемы. В этой связи S. marcescens эндонуклеазы, выраженная в E. coli, является идеальным эндонуклеазы не только для целей производства векторы AAV, но и для вектора AAV количественный. Это потому, что ее Ферментативная активность может быть сохранена более широкий диапазон значений рН и концентрации ионов магния и моновалентной катионов. По этой причине и потому что S. marcescens эндонуклеазы приблизительно 2 раза дешевле, чем DNase I фермента B на основе единицу, мы предпочитаем использовать S. marcescens эндонуклеазы рутинной количественных точка блот анализе.

Таким образом количественные точка анализов помаркой являются относительно простой процедуры, которая легко может предоставить информацию о возможности производить вирусных частиц при различных условиях. По сравнению с titering альтернативные подходы, например ПЦР, этот подход требует мало, если таковые имеются, оптимизации. Он может также легко применяться к векторам любой серотипа и может использоваться для титр, как одно - и двунитевая векторные без изменения протокола. После transfections и урожай образцов AAV вектор содержащие (культуры среднего или клетки) весь протокол может быть завершена в день, таким образом быстро отвечать на вопросы о способности производить вирусных частиц от различных условий, в том числе различные комбинации белков AAV VP3 и АПУ. Помарки количественных точка предлагают целесообразный метод для решения различных без ответа вопросы относительно VP-АПУ взаимодействий и их роли в Ассамблее капсида в широкий спектр различных серотипов AAV и изоляты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Сяо Сяо в университете Северной Каролины в Чапел-Хилл за предоставление нам с pEMBL ЦМВ-GFP плазмиды. Мы благодарим Кристофер Чэн и Samuel J. Хуан для критических чтении рукописи. Эта работа была поддержана предоставляет служба общественного здравоохранения (низ R01 NS088399 и T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Биология выпуск 136 аденоассоциированный вирус (AAV) Ассамблея активация белка (AAP) кросс комплементарности количественные точка блот пробирного вирусный титр генной терапии
Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter