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Biology

Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Este manuscrito detalla un análisis de blot punto sencillo para la cuantificación de los títulos de virus adeno-asociado (AAV) y su aplicación para estudiar la función de activación de montaje proteínas (AAPs), una nueva clase de proteínas virales no estructurales en los AAV serotipos, en la promoción de la Asamblea de cápsida derivado de serotipos AAV cognados y heterólogos.

Abstract

Mientras que virus adeno-asociado (AAV) es ampliamente aceptado como un atractivo vector para terapia génica, también sirve como un virus modelo para entender la biología del virus. En este último sentido, el reciente descubrimiento de una proteína AAV no estructural, denominado proteína activadora de Asamblea (AAP), ha arrojado nueva luz sobre los procesos implicados en el ensamblaje de las proteínas de la cápside viral VP en una cápside. Aunque muchos serotipos AAV requieren AAP para la Asamblea, recientemente hemos reportado que AAV4, 5, y 11 son excepciones a esta regla. Además, demostramos que la AAPs y cápsida montado de diferentes serotipos localiza a diferentes compartimentos subcelulares. Este inesperada heterogeneidad en las propiedades biológicas y papeles funcional de Fiscalizacion entre AAV diferentes serotipos subraya que la importancia de los estudios sobre fiscalizacion derivada de diversos serotipos. Este manuscrito detalla un análisis de blot de punto sencillo para cuantificación de AAV y su aplicación para evaluar la especificidad de dependencia y serotipo AAP en el ensamblaje de la cápside. Para demostrar la utilidad de este análisis de dot blot, nos propusimos para caracterizar el conjunto de cápside y la dependencia de la AAP de AAV de la serpiente, un reptil previamente desacostumbrado AAV, así como AAV5 y AAV9, que previamente han demostrado ser independiente de la AAP y dependiente de la AAP serotipos, respectivamente. El análisis reveló que AAV serpiente cápside Asamblea requiere serpiente AAP y no puede ser promovido por Fiscalizacion de AAV5 y AAV9. El análisis también demostró que, a diferencia de muchos del serotipo común fiscalizacion que promover el montaje del cápside heteróloga por Cruz-complementación, serpiente AAP no promover el montaje de AAV9 cápsida. Además, nos muestran que la elección de nucleasa afecta significativamente la lectura de la prueba de dot blot, y así, elegir una enzima óptima es crítica para la exitosa evaluación de títulos AAV.

Introduction

Virus adeno-asociado (AAV) es un pequeño, no envuelto, monocatenario DNA virus con un genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). El genoma AAV contiene marcos de lectura abierta (ORFs) para los genes rep y cap . En 2010, una proteína no estructural previamente no identificada codificada por una ORF de marco-cambiado de puesto + 1 dentro del gene de la tapa de AAV2 fue descubierta por Sonntag et al. y encontrada para desempeñar un papel decisivo en el conjunto de proteínas del monómero de la VP de la cápsida de AAV2 en un viral de la cápside1. Esta nueva proteína nombre proteína activadora de Asamblea (AAP) el papel que desempeña en la promoción de cápside de montaje1.

Los ORFs para AAP han sido identificado bioinformatically en el genoma del parvovirus todos dentro del género Dependoparvovirus, pero no dentro de los genomas de los virus de diferentes géneros de la parvovirus familia1,2. Estudios funcionales de esta nueva proteína se centraron inicialmente en la AAP del prototipo AAV2 (AAP2), que ha establecido el papel esencial de AAP2 en contra completamente desmontadas proteínas VP al nucleolo para su acumulación y la formación en montado cápsida1,3,4. La incapacidad de la cápsida de AAV2 para montar en la ausencia de expresión de la AAP ha sido independientemente confirmada por varios grupos, incluido el nuestro1,2,3,4,5 . Estudios posteriores en los serotipos 1, 8 y 9 de AAV corroboraban el papel crítico de Fiscalizacion en la Asamblea de la cápsida, como proteínas de monómero de VP3 de AAV1, 8, y 9 eran incapaces de formar una cápside completamente montada en la ausencia de coexpresión de AAP2.

Recientemente, a través de enfoques que incluyen el uso de cuantitativo dot blot ensayos, investigamos la capacidad de AAV1 12 monómeros VP3 de montar en la cápsida en la ausencia de expresión de la AAP y la capacidad de la AAP1 12 de promover el montaje de VP3 monómeros de serotipos heterólogos. Este estudio ha revelado que AAV4, 5 y 11 VP3 monómeros pueden montar sin AAP. Además, se encontró que ocho de los doce serotipos AAP examinamos (es decir, todos menos AAP4, 5, 11 y 12) muestran una capacidad amplia para apoyar el conjunto de cápside de cápsida de serotipo heterólogo AAV, mientras AAP4, 5, 11 y 12 muestran un substancialmente capacidad limitada en este sentido6. Estos cuatro serotipos son filogenéticamente distantes de los AAP serotipos2,3. Por otra parte, el estudio ha descubierto una heterogeneidad significativa en localizaciones subcelulares de AAPs diferentes6. Además, el estudio ha sugerido que la asociación estrecha de AAP con cápsida montado y el nucleolo, el sello de la Asamblea de capsid AAV2, necesariamente no puede extenderse a otros serotipos incluyendo AAV5, 8 y 9, que mostrar la exclusión nucleolar de cápsida montado6. Así, la información obtenida del estudio de cualquier serotipo particular AAP no es ampliamente aplicable a la biología PAA todos. Tal naturaleza sorprendente de la biología de la AAP recalca la necesidad de investigar el papel y la función de cada PDA de serotipos AAV canónicos y no canónica.

La función biológica de la AAP en el ensamblaje de la cápside puede valorarse mediante la determinación de que los títulos de partícula viral AAV empaquetado completamente producción en riñón embrionario humano (HEK) 293 células, la línea celular más utilizados para la producción del vector AAV, con o sin proteína AAP expresión. Los métodos estándar para cuantificación de AAV son PCR cuantitativa (qPCR)-basado en ensayos7,8 y cuantitativa dot blot basado en ensayos de9. Otros métodos para la cuantificación de partículas virales AAV como densidad óptica medida12 de10,de análisis enzima-ligado del inmunosorbente11 no son ideales para muestras procedentes de muchos serotipos diferentes de AAV o muestras contaminados con impurezas (lisados crudos o medios de cultivo), que son a menudo las muestras utilizadas para la investigación AAV. En la actualidad, qPCR es más ampliamente utilizado para la cuantificación de la AAV; sin embargo, es necesario reconocer posibles advertencias de la prueba de la qPCR, como el ensayo pueden resultar en errores sistémicos y significativo título variaciones13,14. Ensayos de PCR son afectados por una serie de factores de confusión potencialmente factores como la presencia de horquillas terminales covalentemente cerrados en plantillas PCR que inhiben la amplificación13. Incluso un individuo experimentado puede presentar potencial de factores de confusión en qPCR-basado del análisis sin saberlo13. Por el contrario, cuantitativa dot blot ensayos son una técnica de biología molecular clásica que no implica la amplificación del genoma y utiliza un principio mucho más sencillo con un mínimo riesgo de errores en comparación con ensayos de qPCR. El método es menos técnicamente difícil; por lo tanto, los resultados del ensayo son razonablemente reproducibles incluso por personas sin experiencia.

En este informe, describimos los detalles metodológicos de un ensayo de blot dot cuantitativa utilizamos rutinariamente para cuantificación del vector AAV y proporcionar un ejemplo de cómo aplicar el análisis para estudiar el papel de promoción de la Asamblea de Fiscalizacion en común serotipos (AAV5 y AAV9) y un previamente desacostumbrada AAP de serpiente AAV14. En la naturaleza, proteínas VP de AAV y AAP proteínas se expresan en cis de un solo gen (es decir, VP-AAP cis-complementación), mientras que en el análisis aquí descrito, proteínas VP y AAP se suministran en el transporte de dos plásmidos separados (es decir, VP-AAP Trans-complementación). Puesto que cada proteína VP o AAP de diferentes serotipos puede expresarse de cada plásmido independiente, es posible probar combinaciones de VP-AAP heterólogas para el ensamblaje de la cápside (es decir, VP-AAP Cruz-complementación). Brevemente, AAV VP3 de varios serotipos se expresa en las células de HEK 293 por la transfección de DNA de plásmido para empaquetar un genoma del vector AAV en la presencia o ausencia del serotipo cognado AAP, o en presencia de un serotipo heterólogo AAP. Después de la producción, medios de cultivo y lysates de la célula son sometidos a un análisis de dot blot para cuantificar el genoma viral dentro de la cáscara de la cápside. El primer paso de la prueba de dot blot es tratar las muestras con una nucleasa para eliminar contaminantes plásmido DNAs y genoma AAV sin envasar en las muestras. No hacerlo aumentaría las señales de fondo en particular cuando se analizan muestras no purificadas. Esto es seguido por un tratamiento con proteasas para romper la cápsida viral y liberan genomas virales nucleasa resistente a soluciones de muestra. Genomas virales, siguiente son desnaturalizados, borrados en una membrana y cruzado por hibridación con una sonda de DNA específicos del genoma viral para la cuantificación. En el análisis del ejemplo divulgado aquí, demostramos que la serpiente AAV VP3 requiere serpiente AAP para el ensamblaje de la cápside y que serpiente AAP no promueve a la Asamblea de AAV9 cápsida a diferencia de muchos de los AAPs derivados de serotipos de AAP-dependiente que también pueden promover el montaje de cápsida de serotipo heterólogo. Por último, se reporta una importante ADVERTENCIA para qPCR o ensayos de cuantificación de AAV basado en blot dot que la elección de nucleasa afecta significativamente los resultados del ensayo.

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Protocol

Nota: Recetas para las soluciones y buffers necesarios para este protocolo son proporcionados en la tabla 1. El protocolo que se describe a continuación es para que el ensayo de blot de punto de Cruz-complementación VP-AAP para el estudio de las funciones de las proteínas de la AAP en el ensamblaje de la cápside. El método para el ensayo de blot cuantitativo punto más genérico para purificada valoración del vector AAV se explica en la sección de Resultados de representante .

1. construcción de VP3, AAP y Rep de AAV2 expresando plásmidos

  1. Construcción de pCMV-AAVx-VP3 (x = serotipos)
    1. PCR-amplificar todo VP3 ORF (1,6 kb) usando una ADN polimerasa de alta fidelidad y el siguiente par de cartilla: VP3 adelante, CTAA-RE1-CACC-N25 (los primeros 25 nucleótidos de la ORF de VP3); VP3 inversa, TCTT-RE2-N25 (los últimos 25 nucleótidos de la ORF de VP3).
      Nota: RE1 y RE2 son sitios para enzimas de restricción (REs) para la clonación. CTAA y TCTT son el terminal 5' y 3' tetranucleótidos añadidos para facilitar la digestión de la enzima de restricción cerca del final del ADN de doble hebra. CACC es una secuencia de consenso de Kozak.
    2. Clonar los productos de PCR de RE-digested entre las correspondientes RE sitios de un vector de expresión mamífero que usa el citomegalovirus humano inmediatamente temprana (CMV-IE) potenciador-promotor para la expresión de alto nivel.
      Nota: Para la clonación molecular, digerir 5 μg del ADN de plásmido de columna vertebral con una restriction enzyme(s) a una concentración de 4 U/μg de ADN por 1 h a una temperatura óptima. Para fragmentos PCR, aumentar las unidades de enzimas (por ejemplo, 10 U/μg de producto de PCR de ORF VP3 de 1,6 kb) y un tiempo de incubación más largo (p. ej., 4 h) debido a un aumento del número de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción por unidad de longitud. Información útil en las enzimas de la biología molecular y clonación procedimientos incluyendo transformación bacteriana se puede encontrar en otra parte15,16,17.
  2. Construcción de pCMV-bandera-AAPx (x = serotipos)
    1. PCR-amplificar todo AAP ORF (0,6 kb) excepto el primer aminoácido mediante una ADN polimerasa de alta fidelidad y el siguiente par de cartilla: AAP adelante, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (los 25 nucleótidos de los 4 nucleótidos en el AAP ORF); AAP inversa, TCTT-RE2-N25 (los últimos 25 nucleótidos de la ORF de la AAP).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA códigos de una etiqueta de la bandera, que se ha demostrado que no hay efectos perjudiciales4,5 pero puede omitirse si innecesarios.
    2. Clonar los productos de PCR de RE-digested entre los sitios correspondientes de un vector de expresión mamífero con el CMV-IE promotor enhancer15,16,17.
  3. Construcción de pHLP-Rep
    1. Digest 5 μg de plásmido pAAV-RC2 (7,3 kb) con 20 unidades de Xho I y Xcm y purificar el ADN utilizando un kit comercial de purificación de DNA o por extracción con fenol-cloroformo.
      Nota: Retiro de la 1,8 kb Xho-Xcm que fragmento de los resultados de plásmido de 7,3 kb pAAV-RC2 en la pérdida de expresión de la proteína de cápside VP conservando la expresión de la proteína Rep.
    2. Embotado el ADN termina con 6 unidades de polimerasa de la DNA T4, agarose gel-purificar el fragmento de ADN de 5,5 kb y uno mismo-ligar el fragmento purificado con 50 a 100 ng de ADN y 400 unidades de ligase de la DNA de T4 según recomendación15 del fabricante de la.
    3. Siga el procedimiento de transformación bacteriana estándar referenciado en la paso 1.1.2 Nota.
  4. Verifique que el plásmido se construye por digestión de la enzima de restricción y secuenciación15,18.
  5. Realizar plásmido minipreps o maxipreps utilizando kits disponibles en el mercado para obtener una cantidad suficiente de ADN de plásmido para los experimentos de producción de AAV aguas abajo.

2. producción de AAV en HEK 293 células por transfección de DNA de plásmido (ensayo de complementación de la Cruz)

  1. Las células de HEK 293 en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) de la cultura-glucosa alta (4,5 g/L) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina y estreptomicina y 1 mM L-glutamina, en una incubadora de 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2).
    Nota: Títulos AAV varían significativamente dependiendo de la fuente de las células de HEK 293.
    PRECAUCIÓN: Aunque AAV puede manejarse en bioseguridad nivel 1 (BSL1) contención, contención BSL2 se recomienda para trabajos de célula de HEK 293.
  2. Día -1 (24 h antes de la transfección), placa de 6 – 7 x 105 HEK 293 células/pozo en 2 mL del medio completo que se describe en el paso 2.1 en una placa de 6 pozos. Esto generalmente consigue confluencia de ~ 90% al día siguiente.
  3. Día 0: transfección
    1. Preparación para la transfección de DNA
      1. Asegúrese de que las células han alcanzado ~ 90% de confluencia.
      2. Calentamiento de DMEM complementado con 1% de penicilina y estreptomicina Mix 1 mM L-glutamina sin 10% FBS (es decir, medio libre de suero) en un baño de agua de 37 ° C.
      3. Deje que la solución de polietilenimina (PEI) alcance la temperatura ambiente.
    2. Preparación de mezcla de ADN de plásmido
      1. Mezclar la plásmidos en 96 μl de tampón fosfato salino (PBS) sin CaCl2 o MgCl2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril como se indica en la tabla 2. La cantidad total de ADN es de 2 μg/pocillo.
        Nota: Los volúmenes de solución de ADN de plásmido pueden tenerse en cuenta si son nominales. Se recomienda el ajuste de volumen si el volumen total de las soluciones de DNA de plásmido es ≥ 10 μl.
    3. Transfección de PEI
      1. Añadir 4 μL de solución de PEI (1 mg/mL) a la mezcla de ADN de plásmido de PBS (preparada como se indica arriba). El volumen final es de aproximadamente 100 μl (5% del volumen de medio de cultivo). Vortex brevemente los tubos e incubar la mezcla de ADN: PEI durante 15 min a temperatura ambiente.
      2. La espera para que la incubación de 15 minutos completar, sustituir el medio de cultivo con medio libre de suero precalentado que se describe en el paso 2.3.1.2.
      3. Una vez que la incubación de 15 minutos de la DNA: mezcla de PEI es completa brevemente girar los tubos con una microcentrífuga para recoger el líquido a la parte inferior de los tubos y agregar gota a gota la mezcla de ADN: PEI al medio de cultivo en cada pocillo de la placa de cultivo de HEK 293. Suavemente agite las placas y los devuelva a una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.
      4. Mantener las células en este medio de transfección hasta la cosecha en el día 5 (no hay cambio de medio se requiere).
  4. El día 1 y día 2, observar las células transfected con el plásmido pCMV-GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido para evaluar eficiencia de transfección.
    Nota: para microscopía de fluorescencia, aquí un 10 X / 0.25 objetivo de apertura numérica en combinación con un ocular de 10 × fue utilizado, y filtro de banda de excitación de 450-490 nm y filtro de emisión de paso de banda de 515 – 565 nm fueron empleados. La condición anterior normalmente rinde más que la eficiencia de la transfección de 70%. Las células pueden presentar algunos cambios morfológicos (por ejemplo, las células se han convertido en slim) debido a la condición libre de suero.
  5. Día 3 – 5, continúan las células transfected en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2de la cultura.
  6. El día 5, recoger células y medio que contiene el virus en tubos cónicos de polipropileno de 15 mL mediante pipeteo arriba y abajo o raspando con un raspador celular.
  7. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso.

3. dot Blot análisis para la cuantificación de AAV

  1. Recuperación de partículas virales
    1. Rápidamente descongelar los congelados tubos en un baño de agua de 37 ° C. Vórtex los tubos vigorosamente durante 1 minuto maximizar la recuperación de la AAV de las células.
    2. De pellets los restos celulares por centrifugación a 3.700 x g a 4 ° C durante 10 minutos. Tomar 200 μL del sobrenadante de cada tubo y transferir a un tubo de microcentrífuga etiquetados con un tapón de rosca para el ensayo de dot blot.
      Nota: Alícuota el sobrenadante restante en microcentrífuga tubos y almacenarlos congelados a-80 ° C para su uso futuro. Aquí, tubos de microcentrífuga de polipropileno atado con tapones de rosca y una junta tórica se utilizaron. Sellado firmemente es necesaria para evitar que los derrames de AAV y fenol-cloroformo.
  2. Tratamiento con la endonucleasa de marcescens del Serratia
    1. Preparar los reactivos de la mezcla A y B de la mezcla (tabla 3). Añadir 10 μl de la mezcla A y 10 μl de la mezcla B en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s, brevemente girar los tubos para recoger el líquido en la parte inferior de los tubos e incubar los tubos a 37 ° C al menos durante 1 hora.
      Nota: Mezcla A contiene NaOH y optimiza el pH para el tratamiento con la endonucleasa de S. marcescens . B mezcla de suplementos de magnesio. Concentración de S. marcescens endonucleasa en la acción de la enzima comercialmente disponibles puede variar. El volumen de S. marcescens endonucleasa debe ajustarse en consecuencia para hacer 200 U/mL después de agregar la mezcla A y B de la mezcla en tubos en el paso 3.2.1.
      Nota: Un tiempo de incubación, hasta a 4 h, puede disminuir las señales de fondo.
    2. Al final de la incubación, brevemente girar los tubos con una centrífuga de mesa para recoger la condensación y solución de la parte superior y lados de los tubos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras pueden almacenarse congeladas a-20 ° C o -80 ° C.
  3. Tratamiento de proteinasa K
    1. Preparar el reactivo de la mezcla C (tabla 3). Añadir 180 μl de mezcla de C en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s, girar los tubos brevemente e incubar los tubos a 55 ° C por 1 h.
      Nota: El EDTA en el reactivo de mezcla C quelatos de iones magnesio libres e inactiva endonucleasa de S. marcescens .
    2. Al final de la incubación, muestras alcancen la temperatura ambiente y brevemente girar los tubos con una centrífuga de mesa para recoger la condensación y solución de la parte superior y lados de los tubos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras pueden almacenarse congeladas a-20 ° C o -80 ° C. Para continuar el protocolo, incubar los tubos a 55 ° C por 5 a 10 min a disolver cristales de SDS contenidas en el buffer completo.
  4. Precipitación de extracción y etanol de fenol-cloroformo
    1. Añadir 200 μL de fenol-cloroformo a las muestras y de vortex por 1 minuto girar las muestras en una microcentrífuga en ≥16, 100 g x ≥ 5 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: Fenol-cloroformo debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal (EPI; es decir, guantes de nitrilo, anteojos o careta y bata con mangas largas).
    2. Transferencia de 320 μl de la capa acuosa (160 μl dos veces con una pipeta de P200) a un tubo nuevo de microcentrífuga estándar (80% del volumen de líquido acuoso).
      Nota: Es de vital importancia tomar el mismo volumen de solución acuosa entre las muestras, de lo contrario la prueba pierde exactitud cuantitativa.
    3. Preparar el reactivo de mezcla D (tabla 3). Añadir 833 μl de mezcla en cada tubo. Vórtex los tubos durante 5 s e incubar los tubos a-80 ° C ≥ 20 minutos.
      Nota: Mezcla D es una mezcla de etanol, acetato de sodio y glucógeno para la precipitación del etanol conveniente del ADN. Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C en este paso y el protocolo puede ser reasumido más adelante.
    4. Centrifugar las muestras con una microcentrífuga en ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 15 minutos retirar el sobrenadante y secar una vez sobre una toalla de papel limpia. Poner aproximadamente 500 μl de etanol al 70% en cada tubo vórtice los tubos durante 5 s y centrifugar los tubos con una microcentrífuga de sobremesa en ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 5 minutos.
    5. Retirar el sobrenadante y secar una vez sobre una toalla de papel limpia. Pellets seco a 65 ° C; pellets se pueden secar completamente.
      Nota: No utilice una pipeta para extraer etanol sobrante que queda después de borrar los tubos. Pellets se pueden también secar a temperatura ambiente durante la noche. El protocolo se puede detener aquí y secados pellets de ADN pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días con la tapa de tubo cerrada.
  5. Resuspensión del DNA viral en tampón TE
    1. Disolver los pellets de ADN en 120 μl de tampón TE agitando cada tubo por 30 min a 1 h a temperatura ambiente.
  6. Blot dot
    1. Elaboración de normas de DNA plásmido
      1. Diluir el AAV vector genoma ADN plásmido a 10 ng/μL en agua o tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Tomar 25 μl de esta dilución y digestión con enzima de restricción apropiada durante 1 h para linealizar el plásmido de ADN en un volumen de reacción de 50 μl.
        Nota: Hacemos un conjunto duplicado de digestión (ver paso 3.6.4.1). La enzima adecuada debe ser aquella que corta el ADN plásmido fuera de la región de unión a prueba dot blot. Para mayor comodidad, el ADN plásmido diluido puede ser alícuotas (25 μl/tubo) y almacenado congelado a-20 ° C para su uso futuro. Digerir el ADN plásmido mientras que los tubos están sacudiendo en paso 3.5.1. No demasiado las digieren el plasmid DNA estándar.
      2. Añadir 450 μl de agua o TE para el tubo que contiene el plásmido digerido ADN estándar y mezclar bien. Transferencia de 70 μl de esta mezcla a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL con 1.330 μl de agua o TE para hacer un plásmido diluido estándar (25 pg/μL).
      3. Siga la tabla 4 para crear una serie de diluciones dobles en serie (600 μl/tubo). Mezclar bien las diluciones con un vórtex durante 5 s.
    2. Desnaturalización de los estándares y las muestras de ADN virales
      1. Añadir 600 μl de 2 x solución alcalina a cada dilución estándar. Mezclar bien todo con un vórtex para 5 a 10 s. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
      2. Añadir 120 μl de 2 x solución alcalina a cada muestra de ADN viral. Mezclar bien todo con un vórtex para 5 a 10 s. incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    3. Configurar el aparato de dot blot
      1. Con unas tijeras, corte una membrana borrar (por ejemplo, zeta-sonda) a un tamaño apropiado para el número de muestras y patrones. Remoje la membrana con agua durante 10 minutos antes de colocarlo en un aparato de dot blot. Cubrir los pocillos no utilizados en el aparato de membrana.
        Nota: La manija la membrana con pinzas limpias. Para cubrir pozos vacíos, puede utilizarse la hoja de protección de la luz azul que viene con la membrana. No permita que la membrana se seque antes de atar las muestras y estándares. Para más detalles sobre el montaje y uso de los aparatos, consulte el manual de usuario19.
      2. Añadir agua a los pozos a los que se cargarán las muestras. Aplicar vacío y tire el agua a través de los pozos para comprobar errores y vuelva a probar cuando se. Vuelva a apretar los tornillos mientras se aplica vacío para asegurar el lacre apretado.
        Nota: Cierre incompleto puede causar fugas de la muestra entre los pozos.
      3. Una vez que el agua es totalmente tirado a través, liberar completamente el vacío (es decir, el colector de vacío debe estar abierto a la presión de aire).
    4. Carga de estándares y muestras en el aparato de dot blot
      1. 400 μL de cada plásmido diluido ADN estándar se aplican a cada pocillo y ejecutar a cuatro carriles de diluciones estándar. Utilice dos alícuotas separadas del Resumen estándar y cargar cada uno por duplicado. Aplique 200 μL/pocillo de cada muestra de ADN viral.
        Nota: Usando los restantes ~ 40 μl de muestras desnaturalizadas, las muestras diluidas pueden ser preparadas (por ejemplo, las muestras diluidas 10 veces usando 20 μl de muestra más 180 μl de solución alcalina 1 x) y borradas si es necesario.
      2. Aplique vacío suave para sacar las soluciones de ADN a través del pozo.
        Nota: Necesidades de presión de vacío ajustarse abriendo parcialmente una válvula de tres vías para que la presión del vacío se aplica a la dot blot aparato así como la atmósfera (es decir, con las armas de llave de paso colocada en un ángulo aproximado de 45 ° donde se hace un ruido de succión más fuerte).
      3. Una vez que han vaciado todos los pozos, libere el vacío mediante el ajuste de la válvula de tres vías. Añadir 400 μL de solución alcalina 1 x a cada pocillo que contiene estándares y muestras. Espere 5 minutos antes de volver a aplicar el vacío para vaciar los pozos.
      4. Vuelva a aplicar el vacío de la misma manera (ver paso 3.6.4.2).
      5. Desmontar el aparato de dot blot bajo vacío, retire la membrana y enjuague con 2 x SSC. Coloque la membrana sobre una toalla limpia de papel con el lado de ADN-limite hacia arriba para quitar el exceso 2 x SSC.
      6. UV-reticulación blotted ADN a la membrana con un crosslinker UV apropiado; la membrana está ahora lista para la hibridación.
        Nota: Las membranas húmedas pueden utilizarse para la reticulación UV. El secado, UV-reticulado membranas pueden almacenarse a temperatura ambiente. Para obtener más información puede encontrarse en la Tabla de materiales.
  7. Hibridación y lavado
    1. El tampón de hibridación en un baño de agua de 65 ° C de calentamiento.
    2. Enzimáticamente etiqueta una sonda de DNA con radiactivo α -32P dCTP y purificar mediante kits disponibles en el mercado según las recomendaciones del fabricante.
      Nota: Utilizamos una sonda de 0,5 – 2,0 kb en longitud desde una región enhancer-promotor o una secuencia de codificación de la proteína en el genoma viral. Aunque este protocolo utiliza sondas radiactivas marcadas con P de 32para detección de señal, también se pueden utilizar sondas fluorescentes o quimioluminiscente no radiactivo (véase la sección discusión ).
    3. La membrana en una botella de hibridación con el lado de ADN-limite para arriba, enjuague la membrana con 5 mL precalentado tampón de hibridación y desechar el tampón. Luego añadir 10 mL de tampón de hibridación precalentado y coloque la botella en un horno rotante de hibridación a 65 ° C. Gire durante ≥5 min.
    4. Calor-desnaturalizar 20 μl de 10 mg/mL esquilada arenque o solución de ADN de esperma de salmón y la 32etiqueta P sonda (≥107 cpm) durante 5 min mediante la colocación de los tubos en un conjunto de bloque de calor a 100 ° C. Snap-chill les en hielo para ≥ 2 min, vuelta brevemente y no en hielo hasta su uso.
      PRECAUCIÓN: Para sondas de DNA radioactivas, deben usarse tubos de 1,5 mL con tapón de rosca y junta tórica.
    5. Agregar rápidamente el ADN de esperma de desnaturalizada y sonda radiactiva para el tampón de hibridación en la hibridación de la botella y agitar la botella para 10 s para mezclar. Coloque la botella en el horno de 65 ° C e incubar el frasco con la rotación a 65 ° C para ≥4 h.
    6. Una vez completo la hibridación, detener la rotación, sacar la botella de hibridación y luego verter la solución de sonda radiactiva en un tubo cónico de 50 mL con un tapón de sellado hermético. Guarde la sonda en un recipiente adecuado colocado en un refrigerador para materiales radiactivos.
      Nota: Usado tampón de hibridación con una sonda que se almacena a 4 ° C puede ser reutilizado al menos 5 veces colocando el tubo cónico de 50 mL con un hermético sello de tapón que contiene el tampón de hibridación en un baño de agua de 100 ° C por 5 min.
    7. Lavar la membrana con tampón de lavado a 65 ° C. Agregar 20 a 30 mL de tampón de lavado a la botella de hibridación y gire para 5 minutos repetir esto lavar 2 veces más.
      Nota: Medir la radiactividad de soluciones de lavado y grabar si es requerido por el Instituto local.
    8. Mientras se lava la membrana, coloque un fósforo imagen pantalla sobre un borrador de imagen durante 5 minutos.
    9. Después del tercer lavado, retire la botella de hibridación de la membrana, elimine el exceso de tampón sobre la membrana con toallas de papel y coloque la membrana en un porta papel plástico transparente. Compruebe las señales radioactivas en la membrana usando un contador Geiger. Exponer la pantalla proyección de imagen de fósforo borrados a la membrana durante 10 minutos hasta toda la noche dependiendo de la intensidad de la señal.
    10. Exploración de la pantalla mediante una imagen de fósforo sistema de exploración y obtener los datos de intensidad de la señal de cada punto.
  8. Análisis de datos
    1. Dibujar una curva estándar utilizando hoja de cálculo y datos software de análisis (por ejemplo, Excel).
      Nota: Regresión lineal Log-log se utiliza para dibujar una curva estándar.
    2. Determinar el equivalente de nanogramo (ng-eq) para cada una de las muestras de ADN virales por interpolación. Ng-eq es la cantidad de plásmido ADN se utiliza para dibujar una curva estándar que equivale al número de moléculas de ADN virales. Cuando la longitud del ADN del plásmido es 8.000 bp, 1 eq de ng de ADN viral AAV corresponde a 2.275 x 108 partículas.
      Nota: Ng-eq se puede convertir en el número de partículas virales por las siguientes ecuaciones:
      Equation 1
      Equation 2
      El número de partículas AAV se expresa convencionalmente como "vg" (vector genomas) o "DRP" (partículas resistente a la DNasa).
    3. Calcular las concentraciones de la AAV de las materias primas. Porque el ADN viral blotted representa 66.7% Equation 3 de la DNA viral en las materias primas, ng-1 eq corresponde a 1.7 x 109 partículas/mL Equation 4 .
      Nota: Esta corrección no es necesaria si todo el ADN viral contenido en el material de partida es borrado en una membrana sin pérdida (ver figura 1).

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Representative Results

Un resultado representativo de lacras punto cuantitativo para cuantificación de purificada vector AAV las reservas producidas a gran escala se muestra en la figura 1. Con este ensayo de dot blot, se determinó la concentración de una población de vector de doble hebra AAV2G9-CMV-GFP. El vector se purificó por dos rondas de cloruro de cesio (CsCl) gradiente de densidad ultracentrifugación seguida de diálisis como se describió anteriormente20. En general, para poblaciones de vector AAV purificadas, tres volúmenes diferentes de cada acción del vector AAV (p. ej., 0,3 μl, 0.1 μl y 0.03 μL) se someten a la secuencia de dot blot descrita por duplicado con una modificación. Enzima DNasa I A se utiliza en lugar de endonucleasa de S. marcescens en el paso 3.2, y un kit disponible comercialmente para extraer y purificar el ADN viral se utiliza en el paso 3.4 (véase Tabla de materiales). En el ejemplo mostrado en la figura 1, los valores de intensidad de señal (unidad arbitraria) obtenidos de cada plásmido ADN estándar (figura 1A) se trazaron contra las cantidades de DNA conocidas para dibujar una curva estándar (figura 1B), que muestra una correlación coeficiente de 0.998. Utilizando esta curva estándar, se determinó por interpolación que 0.3, 0.1 y 0.03 alícuotas μl del vector AAV2G9 demostraron 1.487 y 1.522 ng-eq (0,3 μL), 0.487 y 0.507 ng-eq (0,1 μl) y 0,158 y 0.171 ng-eq (0.03 μL). Esto dio los siguientes seis valores: 4.957 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 y 5.700 ng-eq/μL para este particular AAV2G9 vector stock, llevando a una media de 5,16 ± 0.27 ng eq/μl (media ± SD). Desde la longitud del plásmido utilizado como el estándar (pEMBL-CMV-GFP) 5.848 bp, el título de este vector de AAV2G9 fue determinada para ser 8.0 x 1011 vg/mL según la ecuación 2 en el paso 3.8.2. Este ensayo se repite al menos dos veces para determinar los títulos finales de poblaciones del vector AAV.

Un resultado representativo de complementación entre ensayos para evaluar la dependencia de la AAP en Asamblea de capsid VP3 y la capacidad de Fiscalizacion para montar VP3 proteínas de origen heterólogo se muestra en la figura 2. In vitro estudios de AAV a menudo no requieren purificación del virus para establecer conclusiones y experimentos usando preparaciones de virus como lysates de la célula crudo y medios de cultivo que contienen virus son suficientes para producir resultados significativos. En este experimento, evaluaron la producción de partículas virales AAV de todas las combinaciones posibles de AAV VP3-AAP entre AAV5 AAV9 y serpiente AAV incluyendo combinaciones de AAP VP3-no por un análisis de cuantitativo dot blot. Las muestras obtenidas en un conjunto duplicado de un experimento fueron borradas en 1 x y 10 x diluciones (sistema A y sistema B en la figura 2A, respectivamente). El gráfico que se muestra en la figura 2B resume el análisis cuantitativo de los puntos. Los resultados muestran que: (1) AAV5VP3 monta independientemente de si la AAP fue proporcionado en el transporte, (2) AAP5 y AAP9 pueden promover el AAV9VP3 cápside montaje aunque AAP5 funciona menos eficazmente que AAP9, (3) ni AAP5 ni AAP9 exhibe un conjunto de promoción de la actividad en serpiente AAV VP3 y (4) serpiente AAP sólo promueve Asamblea de serpiente AAV VP3. (1) y (2) están en consonancia con anteriores observaciones6, pero el único específico AAV VP3-AAP interacción en serpiente AAV es un nuevo descubrimiento en este experimento. Una debilidad del ensayo de complementación de Cruz basado en blot cuantitativo punto es que el control negativo demuestra siempre apreciables niveles de señales de fondo que no pueden ser totalmente eliminados. Por lo tanto, el ensayo de dot blot por sí mismo no puede excluir la posibilidad que cápside reúne a un nivel inferior a la sensibilidad del ensayo. En este sentido, cabe señalar que, para generar los controles negativos, se utiliza una condición bajo qué genomas virales AAV exponencialmente replicadas en la ausencia de la cápside de proteína VP3. Tales controles negativos pueden ser generados por transfectar las células de HEK 293 con pAAV-periodista, representante de pHLP y pHelper (tabla 2) y se utilizan para reducir falsos positivos.

DNasa I se ha utilizado ampliamente como una nucleasa en dot blot y ensayos de qPCR para cuantificación de AAV para quitar residual plásmido DNAs y sin envasar genomas virales que han contaminado las preparaciones AAV. Estos contaminantes lo contrario llevaría a una sobreestimación de los títulos; por lo tanto, la digestión de la nucleasa es un paso muy importante para cuantificar con precisión el títulos del genoma viral. DNasa I las enzimas están disponibles de varios fabricantes y proveedores comerciales; sin embargo, la importancia de la selección de la ADNsa I en cuantificación de AAV parece haber sido infravalorada. Para investigar cómo la elección de nucleasa podría afectar los resultados de la prueba de dot blot, las siguientes tres nucleasas se compararon por su capacidad eliminar señales de fondo del AAV vector que contiene los medios de cultivo preparado como se describió anteriormente en los pasos 2 y 3: DNasa I A la enzima DNasa I enzima B y S. marcescens endonucleasa (Tabla de materiales). Estudios publicados han utilizado el DNase dos ex I enzimas13,21,22,23,24 y nosotros hemos estado utilizando endonucleasa S. marcescens en anterior y actual estudios. Para nuestra sorpresa, se identificó que enzima DNasa I A no es en absoluto una elección apropiada para el ensayo de dot blot utilizando los medios de comunicación que contiene el virus en las diferentes condiciones probadas, resultando en fondo alto las señales de control negativo, mientras que B de enzima DNasa I y S. marcescens endonucleasa reducido con eficacia las señales de fondo con DNasa I enzima B ser ~ 2 más eficaz que S. marcescens endonucleasa (Figura 3A, B). DNasa I enzima C también fue encontrado para ser muy eficaz para reducir las señales de fondo (datos no mostrados). Estos datos demuestran que existen diferencias significativas en las actividades enzimáticas entre nucleasas comercialmente disponibles cuando las reacciones enzimáticas se llevan a cabo en preparaciones de AAV aunque digestión nucleasa debe ser efectiva cuando una pequeña cantidad de preparaciones virales purificadas es tratado bajo una condición optimizada. Así, estos datos ponen de relieve la importancia de la correcta selección de nucleasas en el ensayo cuando preparados de AAV se someten a un análisis cuantitativo dot blot o qPCR.

Figure 1
Figura 1: un análisis de dot representante blot para determinar la concentración de un vector AAV purificada de CsCl. (A) Double-stranded vector AAV2G9-CMV-GFP fue producida en las células de HEK 293 un estándar libre de adenovirus tres método de transfección de plásmidos a gran escala y purificada por dos rondas de ultracentrifugación gradiente de CsCl, seguido por diálisis. 0.3, 0.1 y 0.03 μl del stock vector AAV purificado (borrado en la columna de la derecha) se sometieron a ensayo cuantitativa dot blot por duplicado con dos conjuntos de estándares de ADN plásmido duplicados (ETS). La mancha fue cruzado por hibridación con una sonda GFP marcado con P 32(0,77 kb), y la imagen fue obtenida usando una imagen de fósforo sistema de escaneo. (B) una curva estándar que muestra la relación entre cantidades de DNA de plásmido conocido (ng-eq, eje x) e intensidades de punto (unidad arbitraria (UA), eje y). Los números en el eje y se obtuvieron con la imagen de fósforo sistema de escaneo. R indica el coeficiente de correlación de Pearson. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ensayo AAV VP3-AAP Cruz-complementación dot blot. Producción de partículas de doble hebra AAV-CMV-GFP vector fue probado para las proteínas de VP3 de AAV5 AAV9 y serpiente AAV en la presencia o ausencia de su fiscalizacion cognado o en presencia de Fiscalizacion de origen heterólogo. (A) el ensayo se realizó en un sistema biológico duplicado de experimentos (sistema A y sistema B) con el tiempo de incubación de 4 h con endonucleasa de S. marcescens , y el título del vector AAV Obtenido de cada combinación se determinó mediante un punto cuantitativo Blot el método descrito en la sección de protocolo. Cada punto representa dos terceras partes (las filas 5ª y 6ª, 66.7%) o dos-thirtieths (las filas 7 y 8, 6.7%) de ADN de cada uno 200 μL de medio de recogida de las muestras o el control negativo. La parte superior cuatro filas (filas 1 a 4) representan dos conjuntos de estándares de ADN plásmido (STD 1 y 2 STD) borrados por duplicado (es decir, lineal pEMBL-CMV-GFP plásmido, que es el plásmido utilizado para la producción de vectores de AAV-CMV-GFP doble hebra). La membrana de dot blot fue sondada con una sonda GFP marcado con P 32. La pareja de puntos indicados por rectángulos redondeados son controles negativos. Las dos filas superiores (STD 1) son de la parte inferior de la mancha original pero han sido corte y se trasladó a la parte superior sin alterar la intensidad de la imagen para mostrar ambos estándares de plásmido (STD 1 y 2 STD) al lado. Esta manipulación se indica con una línea negra en la figura. Título Viral (B) se determinó para las combinaciones de VP3 y proteínas AAP por el dot blot ensayo. El gráfico representa un conjunto biológico quadruplicated de datos, dos del Panel A y dos de otro punto borran que no se muestra. Barras de error indica la media +-SD (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: comparación de actividades enzimáticas de las nucleasas diferentes preparaciones de vector AAV. (A) A blot dot cuantitativa que muestra la eficacia de cada tratamiento de nucleasa para eliminar señales de fondo. Bicatenario AAV9-CMV-GFP que contiene el vector preparación ("vector AAV9") y "no-cápside control" fueron producidos por la transfección de la célula de HEK 293 con el plásmido DNAs y sometidas a ensayo. El control no-cápside no contiene partículas virales pero contiene genomas de vector de CMV-GFP sin envasar amplificadas exponencialmente. MgCl2 fue suplido en una o tres veces las cantidades recomendadas (6 mM y 18 mM de DNasa I enzima A; y 2.5 mM y 7,5 mM de DNasa I enzima B) sin tomar en cuenta el 0,8 mM MgSO4 presentes en el medio. Para el tratamiento con la endonucleasa de marcescens del S. fue probada sólo una condición que se describe en la sección de protocolo. Todas las muestras fueron tratadas con cada nucleasa para 1 h. La membrana de dot blot fue sondada con una sonda GFP marcado con P 32. Las derecha dos columnas (STD 2) son de izquierda a derecha de la mancha original pero se corte y se trasladó a la derecha sin alterar la intensidad de la imagen a mostrar ambos estándares de plásmido (STD 1 y 2 STD) al lado. Esta manipulación se indica con una fina línea negra en la figura. Puntos (B) en las muestras de control no-cápside en Panel A se cuantificó y se muestran como media ± | cada valor — valor medio. Siete de las 12 muestras tratadas con DNasa I enzima A (indicado con un asterisco) muestran valores sólo ligeramente superiores a los del más alto nivel; por lo tanto, se incluyen en este gráfico de comparación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Marcescens del Serratia Buffer de endonucleasa
50 mM Tris-HCl
2 mM de MgCl2
Ajustar a pH 8,5 con NaOH M 4.
10 x Buffer de proteinasa K
100 mM Tris-HCl de pH 8.0
pH de EDTA 100 mM 8.0
5% SDS
2 x solución alcalina
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175,3 g NaCl
88,2 g citrato de sodio tribásico (Na3C6H5O7)
Solución de Denhardt 100 x (50 mL)
1 g albúmina sérica bovina (fracción V) Nota: Filtrado es fundamental para eliminar las partículas pequeñas ya que las señales de hibridación de fondo.
1 g Polysucrose 400
1 g polivinilpirrolidona
Disolver en 20 mL de agua en un baño de agua de 55 ° C.
Ajustar el volumen final de 50 mL.
Esterilizar de filtro con filtro de 0.22 μm.
Tampón de hibridación
SDS 1% Nota: Tienda de tampón de hibridación en 4 ° C y el calor a 65 ° C en un antes de baño de agua a utilizar.
6 x SSC
5 x solución de Denhardt
10 mM Tris-HCl de pH 8.0
Tampón de lavado
0.1% SDS
0.1 x SSC
Polietilenimina (PEI) solución (1 mg/mL, 500 mL)
Agregar 500 mg PEI en 450 mL de agua y revolver. Nota: Para un almacenaje más largo,-80 ° C se recomienda.
Añadir ácido clorhídrico concentrado para llevar pH a < 2.0 para disolver PEI (aproximadamente 800 μl de HCl será necesario).
Añadir 10 M NaOH para llevar el pH a 7.0 (aproximadamente 500 μl de 10 M de NaOH será necesario).
Ajustar el volumen a 500 mL de agua.
Esterilizar de filtro con filtro de 0.22 μm.
Alícuota y almacenar a-20 ° C.
Fenol-cloroformo (mezcla 1:1) para borrar punto cuantitativo
Agregar fenol saturado de tampón (pH 8.0) y cloroformo en una proporción de 1:1 en un tubo cónico de polipropileno 50 mL. Nota: El buffer que cubre la capa orgánica, si se deja en el tubo, puede ser prorrogado en los tubos de muestra a través de pipeteo y puede hacer el análisis inexactos.
Vórtice el tubo vigorosamente para mezclar.
Permite separación de fases por centrifugación y luego retirar la capa acuosa totalmente.
Almacenar a 4 ° C.

Tabla 1: solución y Buffer recetas. Recetas de soluciones y tampones necesarios para completar el punto cuantitativo blot protocolo.

Plásmido AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Control negativo (μg) Control de transfección (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-bandera-AAPx 0.4
pAAV-reportero 0.4 0.4 0.4
pHLP-Rep 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (vacía) 0.4 0,8
pCMV-GFP 2.0
Total 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabla 2: combinaciones de plásmido para ensayo de complementación de Cruz AAV VP3-AAP realizan en un formato de placa de 6 pozos. Aparecen combinaciones de plásmido DNAs para transfección de la célula de HEK 293 en cada grupo experimental. pCMV-AAVx-VP3, un plásmido de expresión serotipo AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) la proteína VP3 bajo el potenciador de CMV-IE-promotor; pCMV-bandera-AAPx, un plásmido de expresión serotipo AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) proteína AAP en el reforzador de CMV-IE-promotor; pAAV-reportero, un plásmido que tiene dos repeticiones terminales invertidas de AAV2 (RTI) y está diseñado para la producción de vectores AAV recombinante; pHLP-Rep, un plásmido que expresan la proteína Rep AAV2; pHelper, un plásmido helper de adenovirus; pCMV (vacía), un plásmido vacío agregado para controlar las condiciones experimentales; pCMV-GFP, un plásmido de expresión de un gen marcador de fluorescencia (p. ej., GFP) para verificar el éxito de la transfección. Transfecciones se llevan a cabo en placas de 6 pocillos y utilizan un total de 2 μg de plásmido DNAs.

Mezcla A Para 10 tubos (μL)
Marcescens del Serratia Buffer de endonucleasa 91,2
0.1 NaOH M 8.8
Total 100
Mezcla B Para 10 tubos (μL)
Marcescens del Serratia Buffer de endonucleasa 91,2
1 M de MgCl2 7.04
Marcescens del Serratia Endonucleasa (250 unidades/μL) 0.176
Total 100
Mezcla C Para 10 tubos (μL)
10 x Buffer de proteinasa K 400
Proteinasa K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
Total 1.800
Mezcla D Para 10 tubos (μL)
100% etanol 8.000
3 M acetato de sodio (pH 5,2) 320
Glucógeno de la ostra (20 mg/mL) 10
Total 8.330

Tabla 3: lista de los reactivos de la mezcla principal. Mezcla A y B de la mezcla se utilizan para el tratamiento de la endonucleasa de S. marcescens en el paso 3.2. Estas dos mezclas deben hacerse por separado para evitar la precipitación de hidróxido de magnesio. Mezcla C se utiliza para el tratamiento de la proteinasa K en el paso 3.3. Mezcla D es utilizado para la precipitación del etanol en el paso 3.4.3. Los volúmenes indicados en la tabla son para reactivos de mix master para 10 tubos.

Estándar de ADN plásmido (ng) Volumen (μL) de 25 pg/μl plásmido ADN solución Volumen (μL) de agua Total volumen (μL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37.5 562.5 600
0.156 18.8 581,2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Cuadro 4: normas de cuantitativa dot blot plásmido ADN. Se muestran los volúmenes necesarios de 25 pg/μl plásmido ADN solución estándar y agua o TE para preparar estándares de ADN de plásmido por diluciones dobles en serie (600 μl/tubo). Los números en la columna estándar de ADN plásmido (0.039 a 5 ng) es la cantidad de DNA en 200 μL de cada solución patrón de DNA de plásmido.

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Discussion

En este informe se describe la utilidad de cuantitativa dot blot ensayos para estudiar AAPs de AAV y su papel en el ensamblaje de la cápside. Conocimiento obtenido de estos estudios puede proporcionar penetraciones detalladas en las diferencias innatas en el proceso de montaje de cápside AAV y el papel funcional de Fiscalizacion entre diferentes serotipos. En este sentido, el punto de Cruz-complementación de AAV VP3-AAP blot ensayo reveló que serpiente AAV VP3 muestra una dependencia estricta de la coexpresión de su cognado PAA para el ensamblaje de la cápside y que serpiente AAP no promueve el ensamblaje de la cápside de los serotipos heterólogos . Esta observación es intrigante porque el AAV dependiente de la AAP serotipos que fueron previamente investigadas (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 y 12) son todos capaces de proceso Asamblea por lo menos hasta cierto punto utilizando un heterólogo AAP6.

Cuantitativa ranura o dot blot hibridación es un método tradicional para la cuantificación de ácidos nucleicos contenidos en varias muestras al mismo tiempo en una manera conveniente de25. El método había sido ampliamente utilizado para la cuantificación de ADN y ARN hasta qPCR se convirtió en la década de 199026,27. Aunque qPCR tiene ventajas sobre el punto cuantitativo borran y otros ensayos de hibridación en qPCR exhibe una mayor sensibilidad y un rango dinámico más amplio, también lleva un riesgo inherente de aumentar exponencialmente errores sin saberlo, que fue el caso para los títulos de las poblaciones de vectores AAV determinados por qPCR13,23. Cuantitativa dot blot ensayos configurar fácilmente con un coste barato y fácilmente llevado a cabo siempre y cuando los investigadores tienen acceso a un sistema de proyección de imagen molecular cuantitativo que puede adquirir señales de dot blot membranas cruzado por hibridación con una sonda ya sea radiactiva o una sonda fluorescente o quimioluminiscente no radiactivo. Aunque este protocolo utiliza sondas radiactivas marcadas con P de 32para detección de señal, otros con éxito utilizan sondas de ADN no radiactivo etiquetadas directamente con una fosfatasa alcalina termoestable disponibles en el mercado28. Dot blot ensayos utilizan un principio sencillo y el análisis por sí mismo no plantea un desafío técnico para los artistas; por lo tanto, los resultados son generalmente reproducibles incluso por personas sin experiencia.

Además de los fines descritos aquí, habitualmente utilizamos una versión simplificada y acelerada del procedimiento dot blot puede semi-cuantificar partículas AAV rápidamente. Ventajas de ensayos de dot blot en este contexto incluyen: (1) el ensayo no requiere purificación o amplificación enzimática de genomas virales que toma horas, (2) una combinación de calor y desnaturalización alcalina es suficiente para romper las partículas AAV en una muestra solución y liberación desnaturalizado genomas virales en la solución que están listos para enlazar a una membrana de dot blot y (3) la presencia de sal en alta concentraciones en muestras no afecta significativamente los resultados del ensayo. Por ejemplo, es posibles cuantificar las partículas AAV en soluciones de CsCl-ricas (por ejemplo, fracciones obtenidas por ultracentrifugación de gradiente de densidad de CsCl) poniendo una pequeña alícuota (≤10 μl) de muestras en 100 μl de solución alcalina, calentar a 100 ° 1 x C para 10 min y borrar en una membrana con o sin estándares preparados de antemano, seguidas de un hibridación de 15 min, lavados de 3 x 3 min y la exposición a un fósforo imagen pantalla durante 15 minutos (o más cuando se usa una sonda con radiactividad disminuida). El procedimiento entero se puede completar en 1 h una vez que el usuario familiarizado con el procedimiento. Utilizamos este método acelerado, que habitualmente llamamos "hirviendo dot blot método", identificar AAV ricos en partículas CsCl fracciones durante la purificación del vector del proceso y determinan más o menos títulos de poblaciones de vectores AAV purificadas antes de comenzar el extenso procesos para la caracterización del vector. Así, aunque dot blot ensayos pueden considerarse como un método anticuado para cuantificar ácidos nucleicos y ya han sido reemplazados con varios métodos de polimerización en cadena-basado en una amplia gama de disciplinas científicas, todavía hay una serie de ventajas a este método que debe hacer a los investigadores considerar emplear en sus laboratorios.

El paso más crítico en el protocolo es el tratamiento de la nucleasa de muestras. Si este paso no se lleva a cabo en condiciones óptimas, que causaría las señales de alto fondo. Utilizamos S. marcescens endonucleasa y la ADNasa I enzimas de diferentes fuentes son ampliamente utilizadas en otros laboratorios para la cuantificación de ADN viral. La DNasa I de origen de páncreas bovino se ha más ampliamente utilizado por los investigadores. Esto es en parte porque la DNasa pancreática bovina era primer identificado y más ampliamente caracterizada bioquímico29. La DNasa I enzimas actualmente disponibles de proveedores comerciales se producen de varias diversas fuentes biológicas como Pichia pastoris (DNasa I enzima A), la forma nativa purificada del páncreas bovino (p. ej., la ADNasa I enzima B), y enzimas recombinantes producidas en una especie de levadura o Escherichia coli (DNasa I enzima C). Hemos encontrado que la DNasa I las enzimas de los tres de estas diferentes fuentes se han utilizado en estudios de cuantificación del vector AAV del publicados; sin embargo, a nuestro conocimiento, ninguno de los estudios anteriores han investigado si las enzimas de diferentes fuentes son igual de eficaces en la digestión las moléculas de ADN contaminantes en los preparativos del vector AAV. Cabe señalar que DNasa I tratamiento para análisis del vector AAV se realiza a menudo en condiciones no optimizadas debido a la presencia de impurezas derivadas de medio de cultivo y las células. La observación que enzima DNasa I A es sólo parcialmente activo en el medio de cultivo que tiene importantes implicaciones en el diseño de lo análisis de cuantificación del vector AAV por qPCR y dot blot y alerta a los investigadores a esta cuestión previamente no identificada. En este sentido, marcescens del S. endonucleasa expresada en e. coli, es una endonucleasa ideal no sólo para la fabricación de vectores AAV, sino también de cuantificación del vector AAV. Esto es porque su actividad enzimática puede ser retenido sobre una amplia gama de valores de pH y concentraciones de los iones de magnesio y cationes monovalentes. Por esta razón, y porque endonucleasa de marcescens del S. es aproximadamente 2 veces menos costosa que B enzima DNasa I en una base por unidad, preferimos utilizar endonucleasa de S. marcescens en análisis de mancha blanca /negra del punto cuantitativo rutinario.

En Resumen, cuantitativa dot blot ensayos son un procedimiento relativamente sencillo que fácilmente puede proporcionar información sobre la capacidad para producir partículas virales en condiciones diferentes. En comparación con los enfoques titering alternativos, como qPCR, este enfoque requiere poco, si cualquiera, optimización. También puede ser fácilmente aplicado a vectores de cualquier serotipo y se puede utilizar para ambos solo y doble hebra vectores sin modificar el protocolo de titulación. Transfecciones y recolección de muestras que contiene el vector AAV (medio de cultivo o las células), el protocolo entero puede ser completado en un día, así rápidamente respondiendo preguntas sobre la capacidad para producir partículas virales de diversas condiciones, incluyendo varias combinaciones de proteínas AAV VP3 y AAP. Cuantitativa dot Blot ofrece un método conveniente para hacer frente a varios interrogantes en cuanto a las interacciones de la VP-AAP y sus funciones en la Asamblea de capsid en una amplia variedad de diferentes serotipos AAV y los aislantes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Xiao Xiao en la Universidad de North Carolina en Chapel Hill para facilitarnos el plásmido pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng y Samuel J. Huang para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública (NIH R01 NS088399 y T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

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Biología número 136 virus Adeno-asociado (AAV) proteína activadora de Asamblea (AAP) punto de Cruz-complementación cuantitativa blot ensayo título viral la terapia génica
Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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