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Biology

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.

Abstract

Während Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine attraktive Vektor für die Gentherapie weithin anerkannt ist, dient es auch als Modell für das Verständnis der Biologie Virus Virus. In letzterer Hinsicht hat die jüngste Entdeckung eines nichtbauliche AAV-Proteins, Montage-aktivierende Protein (AAP), bezeichnet ein neues Licht auf die Vorgänge bei Einbau der viralen Kapsid VP Proteine in einem Kapsid vergossen. Obwohl viele AAV Serotypen AAP für die Montage benötigen, wir haben vor kurzem berichtet, dass AAV4, 5, und 11 sind Ausnahmen von dieser Regel. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass AAPs und montierten Capsids der verschiedenen Serotypen zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu lokalisieren. Diese unerwartete Heterogenität in den biologischen Eigenschaften und Funktionsrollen der AAPs unter verschiedenen AAV Serotypen unterstreicht die Bedeutung der Studien über AAPs aus verschiedenen Serotypen abgeleitet. Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für AAV Quantifizierung und seine Anwendung auf AAP Abhängigkeit und Serotyp Spezifität in Kapsid Baugruppe zu beurteilen. Um das Dienstprogramm des Dot-Blot Assays zu demonstrieren, brachen wir um zu charakterisieren, Kapsid Montage- und AAP Abhängigkeit der Schlange AAV, ein zuvor fußgelenkes Reptil AAV, sowie AAV5 und AAV9, die bisher gezeigt wurden, AAP-unabhängige und AAP-abhängige Serotypen, beziehungsweise. Der Test ergab, dass die Schlange AAV Kapsid Montage erfordert Schlange AAP und kann nicht durch AAPs aus AAV5 und AAV9 gefördert werden. Der Test zeigte auch, dass im Gegensatz zu vielen gemeinsamen Serotyp AAPs, die Förderung der heterologen Kapsid Montage durch Kreuz-Ergänzung, Schlange AAP Versammlung des AAV9 Capsids nicht fördert. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wahl der Nuklease erheblich das Auslesen des Dot-Blot Assays beeinträchtigt, und somit eine optimale Enzym Auswahl entscheidend für erfolgreiche Beurteilung der AAV-Titer ist.

Introduction

Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein kleines, unbehüllte, einzelsträngige DNA-Virus mit einem Genom von ca. 4,7 Kilobases (kb). Die AAV-Genom enthält offene Lesung Frames (ORFs) für die Rep und GAP Gene. Im Jahr 2010 wurde eine bislang nicht identifizierte Elementoptionen Protein kodiert, indem ein + 1 Rahmen verschoben ORF im AAV2 GAP gen von Sonntag Et Al. entdeckt und festgestellt, dass eine entscheidende Rolle bei der Montage des AAV2 Kapsid VP Monomer Proteine in einer viralen Kapsid1. Dieses neuartige Protein wurde Montage-aktivierende Protein (AAP) nach der Rolle benannt spielt es bei der Förderung von Kapsid Montage1.

ORFs für AAP schon identifizierten Bioinformatically in den Genomen von allen Parvoviren innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, aber nicht in das Genom der Viren von verschiedenen Gattungen des Parvovirus Familie1,2. Funktionelle Studien dieses neuartigen Proteins konzentrierten sich zunächst auf der AAP vom Prototyp AAV2 (AAP2), die die wesentliche Rolle der AAP2 etabliert hat, bei der Ausrichtung unmontiert VP Proteine der Nukleolus für ihre Ansammlung und Bildung in vollem Umfang Capsids1,3,4montiert. Die Unfähigkeit der AAV2 Capsids zusammenzubauen in Ermangelung von AAP Ausdruck wurde unabhängig von mehreren Gruppen, einschließlich der unsrigen bestätigt1,2,3,4,5 . Nachfolgende Studien zur AAV Serotypen 1, 8 und 9 bestätigt die wichtige Rolle der AAPs im Kapsid Montage als VP3 Monomer Proteine AAV1, 8 und 9 waren nicht in der Lage, eine komplett montierte Kapsid bei fehlender Co Ausdruck von AAP2zu bilden.

Vor kurzem, durch Ansätze, die die Verwendung des quantitativen Dot blot Assays, untersuchten wir die Fähigkeit der AAV1, 12 VP3 Monomere zusammenzubauen in Capsids in der Abwesenheit von AAP Ausdruck und die Fähigkeit des AAP1 bis 12 Montage VP3 Monomere von zu fördern heterologen Serotypen. Diese Studie hat ergeben, dass AAV4, 5 und 11 VP3 Monomere können ohne AAP zusammenstellen. Darüber hinaus ergab, dass acht von zwölf AAP-Serotypen wir untersuchten (d.h.alle außer AAP4, 5, 11 und 12) angezeigt eine breite Fähigkeit, Kapsid Montage der heterologen AAV Serotyp Capsids, während AAP4, 5, 11 und 12 angezeigt unterstützen eine wesentlich begrenzten Möglichkeiten in dieser Hinsicht6. Diese vier Serotypen sind phylogenetisch weit entfernt von den anderen AAP Serotypen2,3. Darüber hinaus hat die Studie erhebliche Heterogenität in subzellulären Lokalisierungen von verschiedenen AAPs6aufgedeckt. Darüber hinaus die Studie hat vorgeschlagen, dass der enge Vereinigung von AAP mit montierten Capsids und Nukleolus, das Markenzeichen der AAV2 Kapsid Versammlung, nicht unbedingt zu anderen Serotypen, einschließlich AAV5, verlängert werden 8 und 9, die Nukleolus Ausschluss von anzeigen montierte Capsids6. Deshalb der Erkenntnissen aus der Studie bestimmten Serotyp AAP nicht breit anwendbar auf alle AAP Biologie. Solch rätselhafte Natur der AAP Biologie unterstreicht die Notwendigkeit, die Rolle und Funktion der einzelnen AAP von kanonischen und nicht-kanonischen AAV-Serotypen zu untersuchen.

Die biologische Rolle von AAP in Kapsid Baugruppe kann beurteilt werden, durch die Bestimmung, dass vollständig verpackt AAV Viruspartikel Titer in menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293-Zellen, die am häufigsten verwendeten Zelllinie für AAV Vektor Produktion, mit oder ohne AAP Protein produziert Ausdruck. Die Standardmethoden für AAV Quantifizierung sind quantitative PCR (qPCR)-basierte Assays7,8 und quantitative Dot-Blot-basierte assays9. Andere Methoden zur AAV Viruspartikel Quantifizierung wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay10,11 oder optische Dichte Messung12 sind nicht ideal für Proben, die aus vielen verschiedenen AAV-Serotypen abgeleitet oder Proben mit Verunreinigungen (grobe Lysates oder Kultur, Medien), die oft für AAV Forschung verwendeten Proben kontaminiert. QPCR wird derzeit am häufigsten für AAV Quantifizierung verwendet; Allerdings ist es notwendig zu erkennen, mögliche Vorbehalte des qPCR basierende Assays, als der Test Systemfehler und bedeutende Titer Variationen13,14führen können. PCR-basierte Testsysteme betroffen sind eine Reihe von potenziell Störfaktoren, wie das Vorhandensein von kovalent geschlossenen terminal Haarnadeln in PCR-Vorlagen, die Verstärkung13hemmen. Sogar eine erfahrene Person Potenzial einführen kann Störfaktoren in einer qPCR-basierten Test unwissentlich13. Im Gegensatz dazu sind quantitative Dot-Blot Assays eine klassische Molekularbiologie-Technik, die beinhaltet keine Genom Verstärkung und verwendet ein viel einfacheres Prinzip mit einem minimalen Risiko von Fehlern im Vergleich zu qPCR basierende Assays. Die Methode ist weniger technisch anspruchsvoll; die Untersuchungsergebnisse sind daher auch von unerfahrenen Personen einigermaßen reproduzierbar.

In diesem Bericht beschreiben wir die methodischen Details eines quantitativen Dot Blot Assays wir routinemäßig für AAV Vektor Quantifizierung verwenden und geben Sie ein Beispiel von, wie den Test zur Untersuchung der Montage-Förderung der Rolle von AAPs gemeinsam anwenden Serotypen (AAV5 und AAV9) und eine zuvor fußgelenkes AAP von Snake AAV14. In der Natur AAV VP und AAP Proteine werden in der GUS von einem einzigen Gen (d.h., VP-AAP Cis-Ergänzung), während in der hier beschriebenen Test ausgedrückt, VP und AAP Proteine liefern wir in Trans aus zwei separaten Plasmide (d.h., VP-AAP Trans-Ergänzung). Da jede VP oder AAP Protein aus verschiedenen Serotypen von jeder unabhängige Plasmid ausgedrückt werden kann, wird es möglich, Heterologe VP-AAP-Kombinationen für Kapsid Assembly (d.h. VP-AAP Kreuz-Ergänzung) zu testen. Kurz, drückt AAV VP3 aus verschiedenen Serotypen in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion, ein AAV-Vektor-Genom in das Vorhandensein oder Fehlen des cognate Serotyps AAP oder in Anwesenheit einer heterologen Serotyp AAP zu verpacken. Nach der Produktion unterliegen Nährmedien und Zelle Lysates ein Dot Blot Assay, das virale Genom innerhalb der Kapsid Shell zu quantifizieren. Der erste Schritt des Dot-Blot Assays ist zur Behandlung von Proben mit einer Nuklease kontaminierenden Plasmid-DNA und unverpackten AAV Genome in Proben zu entfernen. Andernfalls würde die Hintergrund-Signale insbesondere erhöhen, wenn ungereinigten Proben analysiert werden. Darauf folgt dann durch eine Protease-Behandlung zu brechen viralen Capsids und Nuklease-resistente viraler Genome in Beispiellösungen freisetzen. Nächste, virale Genome sind denaturiert, getupft auf eine Membran und hybridisiert mit eine virale Genom-spezifische DNA-Sonde für die Quantifizierung. In der Beispiel-Test hier berichtet zeigen wir Ihnen, dass Snake AAV VP3 Schlange AAP Kapsid Montage und Schlange AAP fördert nicht die Montage des AAV9 Capsids im Gegensatz zu vielen der AAPs abgeleitet von AAP-abhängige Serotypen, die auch die Montage von fördern können Heterologe Serotyp Capsids. Zu guter Letzt berichten wir eine wichtige Einschränkung, qPCR oder Dot-Blot-basierte AAV Quantifizierung Tests, dass die Wahl der Nuklease die Untersuchungsergebnisse erheblich beeinträchtigt.

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Protocol

Hinweis: Die Rezepte für die Lösungen und Puffer benötigt für dieses Protokoll sind in Tabelle 1zur Verfügung gestellt. Das Protokoll beschrieben ist für die VP-AAP Kreuz-Ergänzung Dot Blot Assay, die Rollen der AAP Proteine in Kapsid Baugruppe zu studieren. Die Methode für allgemeinere quantitative Dot Blot Assays für die gereinigten AAV-Vektor-Titration wird im Abschnitt Vertreter Ergebnisse erklärt.

(1) Bau von VP3, AAP und AAV2 Rep Plasmide zum Ausdruck zu bringen

  1. Bau von pCMV-AAVx-VP3 (x = Serotypen)
    1. PCR-verstärken die gesamte VP3 ORF (1,6 kb) mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase und die folgenden Primerpaar: VP3 vorwärts, CTAA-RE1-CACC-N25 (die ersten 25 Nukleotide des VP3 ORF); VP3 Revers, TCTT-RE2-N25 (die letzten 25 Nukleotide des VP3 ORF).
      Hinweis: RE1 und RE2 sind Standorte für Restriktionsenzyme (REs) zum Klonen. CTAA und TCTT sind das Terminal 5' und 3' Tetranucleotides hinzugefügt, um Beschränkung Enzym Verdauung erleichtern nahe dem Ende der doppelsträngigen DNA. CACC ist eine Konsensussequenz Kozak.
    2. Klonen Sie die RE-digested PCR-Produkte zwischen den entsprechenden RE Seiten von Säugetieren Expressionsvektor, die der menschlichen Zytomegalievirus sofort Anfang (CMV-IE) Enhancer-Promoter für hochrangige Ausdruck verwendet.
      Hinweis: Für Molekulare Klonierung, verdauen Sie 5 µg Rückgrat Plasmid DNA mit einem Restriction enzyme(s) in einer Konzentration von 4 U/µg DNA für 1 h bei einer optimalen Temperatur. Erhöhen Sie für PCR-Fragmente die Einheiten von Enzymen verwendet (z.B., 10 U/µg des 1,6 kb VP3 ORF PCR Produktes) und eine längere Inkubationszeit (z.B., 4 h) durch eine Erhöhung der Anzahl der Anerkennung Beschränkungsenzymsites pro Längeneinheit. An anderer Stelle finden Sie einige hilfreiche Informationen in Molekularbiologie Enzyme und Klonen Verfahren einschließlich bakterielle Umwandlung15,16,17.
  2. Bau von pCMV-FLAG-AAPx (x = Serotypen)
    1. PCR-verstärken die gesamte AAP ORF (0,6 kb) mit Ausnahme der ersten Aminosäure mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase und die folgenden Primerpaar: AAP vorwärts, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 Nukleotide aus der 4. Nukleotid in die AAP-ORF); AAP Revers, TCTT-RE2-N25 (die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF).
      Hinweis: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes einen FLAG-Tag, das nachweislich keine schädlichen Auswirkungen4,5 haben aber kann verzichtet werden, wenn nicht notwendig.
    2. Klonen Sie die RE-digested PCR-Produkte die entsprechenden Standorte des Säugetier-Expressionsvektor mit der CMV-IE Enhancer-Promotor15,16,17.
  3. Bau des pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg des Plasmids pAAV-RC2 (7,3 kb) mit 20 Einheiten der Xho I und Xcm ich, und reinigen die DNA mit einem kommerziellen DNA-Reinigung-Kit oder durch Phenol-Chloroform Extraktion.
      Hinweis: Entfernung von 1,8 kb Xho ich-Xcm, die ich aus den 7,3 kb pAAV-RC2 Plasmid Ergebnissen zu einem Verlust der Kapsid VP Proteinexpression unter Beibehaltung der Rep Proteinexpression fragmentieren.
    2. Stumpfen die DNA endet mit 6 Einheiten des T4-DNA-Polymerase, Agarose-Gel zu reinigen das 5,5 kb-DNA-Fragment und selbst verbinden das gereinigte Fragment mit 50 bis 100 ng DNA und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase laut Hersteller Empfehlung15.
    3. Folgen Sie dem standard bakterielle Umwandlung Verfahren in Schritt 1.1.2 verwiesen Anmerkung.
  4. Überprüfen Sie, ob das Plasmid durch Beschränkung Enzym Verdauung und Sequenzierung15,18konstruiert.
  5. Durchführen Sie Plasmid Minipreps oder Maxipreps mit im Handel erhältlichen Kits zu einer ausreichenden Menge an Plasmid DNA für die nachgelagerten AAV Produktion Experimente.

2. Herstellung von AAV in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion (Cross-Ergänzung Assay)

  1. HEK 293 Kulturzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)-hohe Glukose (4,5 g/L) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin und Streptomycin-Mix und 1 mM L-Glutamin in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
    Hinweis: AAV-Titer variieren erheblich je nach Quelle der HEK-293-Zellen.
    Achtung: Obwohl bei AAV behandelt werden kann Biosafety level 1 (BSL1) Containment, BSL2 Containment empfiehlt sich für HEK 293 Zelle arbeiten.
  2. Am Tag-1 (24 h vor Transfektion)Platte 6 – 7 x 105 HEK 293 Zellen/Brunnen in 2 mL des Mediums komplette im Schritt 2.1 in einem 6-Well Chicoréeblätter beschrieben. Dadurch wird in der Regel ca. 90 % Konfluenz am nächsten Tag.
  3. Tag 0: Transfektion
    1. Vorbereitung zur DNA-Transfektion
      1. Stellen Sie sicher, dass Zellen ca. 90 % Konfluenz erreicht haben.
      2. Wärmen Sie sich DMEM ergänzt mit 1 % Penicillin und Streptomycin-Mix und 1 mM L-Glutamin aber ohne 10 % FBS (d.h.serumfreien Medium) in einem 37 ° C-Wasserbad.
      3. Lassen Sie die Polyethylenimine (PEI) Lösung auf Zimmertemperatur kommen.
    2. Vorbereitung der Plasmid-DNA-Gemisch
      1. Mischen Sie die Plasmiden in 96 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne CaCl2 oder MgCl2 in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 2angegeben. Der Gesamtbetrag der DNA ist 2 µg/Brunnen.
        Hinweis: Die Mengen für Plasmid DNA-Lösung können ignoriert werden, wenn sie geringer sind. Lautstärkeeinstellung wird empfohlen, wenn das Gesamtvolumen der Plasmid-DNA-Lösungen ≥10 µL ist.
    3. PEI Transfektion
      1. Die PBS-Plasmid DNA-Mischung (wie oben beschrieben vorbereitet) fügen Sie 4 µL PEI-Lösung (1 mg/mL hinzu). Der letzte Band ist ca. 100 µL (5 % Volumen des Kulturmediums). Wirbel die Rohre kurz und die DNA: PEI Mischung für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      2. Während des Wartens auf die 15 min Inkubation in Anspruch, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmte serumfreien Medium im Schritt 2.3.1.2 beschrieben.
      3. Einmal die 15-min Inkubation der DNA: PEI Mischung ist abgeschlossen, kurz Drehen der Rohre mit einem Microcentrifuge, die Flüssigkeit auf den Boden der Rohre zu sammeln und die DNA: PEI Mischung tropfenweise hinzufügen das Kulturmedium in jede Vertiefung der HEK-293-Kultur-Platte. Sanft schütteln Sie die Platten und wieder in einen Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.
      4. Pflegen Sie die Zellen in diesem Transfektion Medium bis zur Ernte am Tag 5 (keine mittlere Änderung ist erforderlich).
  4. Am Tag1 und Tag2beobachten Sie, dass transfizierten Zellen mit pCMV-GFP Plasmid unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop Transfektion Effizienz bewerten.
    Hinweis: für die Fluoreszenz-Mikroskopie, hier ein 10 X / 0,25 numerische Apertur-Ziel in Kombination mit einer 10 × Okular verwendet wurde, und 450-490 nm Anregung Bandpassfilter und 515 – 565 nm Emission Bandpassfilter eingesetzt wurden. Die obige Bedingung ergibt normalerweise mehr als 70 % Transfektion Effizienz. Zellen können einige morphologischen Veränderungen (z. B. Zellen sind schlank geworden) aufgrund der Serum-freie Zustand aufweisen.
  5. Auf 3 – 5 Tageweiterhin die transfizierten Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2Kultur.
  6. Am Tag 5sammeln Sie Zellen und Virus-haltigen Medium in 15 mL konische Polypropylenröhrchen pipettieren rauf und runter oder durch kratzen mit einem Schaber Zelle.
  7. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.

(3) Dot-Blot Assay für AAV Quantifizierung

  1. Wiederherstellung der Viruspartikel
    1. Tauen Sie schnell die gefrorenen Rohre in einem 37 ° C-Wasserbad. Wirbel der Rohre kräftig für 1 min um die Rückgewinnung von AAV aus Zellen zu maximieren.
    2. Pellet-die zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 3.700 x g bei 4 ° C für 10 Minuten. 200 µL des Überstands von jedes Rohr nehmen und in einen beschrifteten Microcentrifuge Schlauch mit einem Schraubverschluss für Dot-Blot Assay übertragen werden.
      Hinweis: Aliquot der restlichen überstand in Microcentrifuge Rohre und gefroren bei-80 ° C für eine spätere Verwendung aufbewahren. Hier Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen befestigt mit Schraubverschlüssen und ein o-Ring verwendet wurden. Enge Abdichtung ist erforderlich, um das Austreten von AAV und Phenol-Chloroform zu verhindern.
  2. Behandlung mit Serratia Marcescens Endonuklease
    1. Bereiten Sie Mix A und Mix B Reagenzien (Tabelle 3). Fügen Sie 10 µL Mix a und 10 µL Mix B in jedes Rohr. Wirbel der Rohre für 5 s, kurz Drehen der Rohre, um die Flüssigkeit auf den Boden der Rohre zu sammeln und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C mindestens 1 h.
      Hinweis: Gemisch A enthält NaOH und pH-Wert für die Behandlung mit S. Marcescens Endonuklease optimiert. Mix-B ergänzt Magnesium. Konzentration von S. Marcescens Endonuklease in handelsüblichen Enzym Aktien variieren. Das Volumen der S. Marcescens Endonuklease muss entsprechend angepasst werden, um 200 U/mL zu machen, nach dem Hinzufügen von Mix A und Mix-B in Röhren im Schritt 3.2.1.
      Hinweis: Eine längere Inkubationszeit kann bis zu 4 h, Hintergrund Signale verringern.
    2. Am Ende der Inkubation kurz Drehen der Rohre mit einer Benchtop-Zentrifuge, Kondensation und Lösung von oben und seitlich der Rohre zu sammeln.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben können auf-20 ° C oder-80 ° c eingefroren gelagert werden
  3. Proteinase K Behandlung
    1. Bereiten Sie das Mix C-Reagenz (Tabelle 3). Fügen Sie 180 µL Mix C in jedem Rohr. Wirbel der Rohre für 5 s, kurz Drehen der Rohre und inkubieren Sie die Rohre bei 55 ° C für 1 h.
      Hinweis: Die EDTA in den Mix C-Reagenz bilden freie Magnesium-Ionen und inaktiviert S. Marcescens Endonuklease.
    2. Am Ende der Inkubation lassen Sie Proben auf Zimmertemperatur kommen, und kurz drehen Sie der Rohre mit einer Benchtop-Zentrifuge, Kondensation und Lösung von oben und seitlich der Rohre zu sammeln.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben können auf-20 ° C oder-80 ° c eingefroren gelagert werden Um das Protokoll fortzusetzen, brüten Sie die Rohre bei 55 ° C für 5 bis 10 min, SDS-Kristalle enthalten im Puffer vollständig aufzulösen.
  4. Phenol-Chloroform Extraktion und Ethanol Niederschlag
    1. Fügen Sie 200 µL Phenol-Chloroform zu den Proben und Wirbel, die sie für 1 min. Drehen Sie die Proben in einem Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g ≥5 min bei Raumtemperatur.
      Achtung: Phenol-Chloroform sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA; behandelt werden d. h., Nitril-Handschuhe, Schutzbrille oder Gesichtsschutz und Laborkittel mit langen Ärmeln).
    2. 320 µL der wässrigen Schicht (160 µL zweimal mit einer Pipette P200) auf einen neuen standard Microcentrifuge Schlauch (80 % der wässrigen Flüssigkeitsvolumen) übertragen.
      Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, die gleiche Menge an wässriger Lösung zwischen den Proben zu nehmen, sonst verliert der Assay quantitative Genauigkeit.
    3. Bereiten Sie das Mix D Reagenz (Tabelle 3). 833 µL Mix D in jedes Rohr hinzufügen. Wirbel der Rohre für 5 s, und die Rohre bei-80 ° C ≥20 min inkubieren.
      Hinweis: D-Mix ist eine Mischung aus Ethanol, Natriumacetat und Glykogen für bequeme Ethanol Fällung von DNA. Proben können bei-80 ° C bei diesem Schritt gespeichert werden und das Protokoll kann später wieder aufgenommen werden.
    4. Zentrifuge Proben mit einem Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g bei 4 ° C für ≥15 min. überstand abgießen und einmal auf einem sauberen Papiertuch tupfen. Ca. 500 µL 70 % Ethanol in jedem Röhrchen genommen Wirbel der Schläuche für 5 s und Zentrifuge die Rohre mit einem Benchtop Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g bei 4 ° C für ≥5 min.
    5. Der Überstand abgießen und einmal auf einem sauberen Papiertuch tupfen. Trockene Pellets bei 65 ° C; Pellets können vollständig getrocknet werden.
      Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette nicht überschüssige Ethanol zu entfernen, die bleibt nach Beflecken der Rohre. Pellets können auch über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet werden. Das Protokoll kann hier angehalten und getrockneten DNA-Pellets können bei Raumtemperatur für mehrere Tage mit geschlossenem Rohr Deckel gelagert werden.
  5. Wiederfreisetzung der viralen DNA in TE-Puffer
    1. Lösen Sie die DNA-Pellets in 120 µL TE-Puffer durch Schütteln jedem Röhrchen für 30 min bis 1 h bei Raumtemperatur.
  6. Dot-blot
    1. Erarbeitung von Plasmid DNA-Normen
      1. Verdünnen Sie AAV Vektor Genom Plasmid DNA zu 10 ng/µL in Wasser oder Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,0). Nehmen Sie 25 µL dieser Verdünnung und Digest mit einer entsprechenden Restriktionsenzym für 1 h nach dem Plasmid DNA, in einem Reaktionsvolumen von 50 µL zu linearisieren.
        Hinweis: Wir machen einen doppelten Satz von Verdauung (siehe Schritt 3.6.4.1). Das entsprechende Enzym sollte eine sein, die die Plasmid-DNA außerhalb der Dot-Blot Sonde-Bindung Region schneidet. Der Einfachheit halber kann die verdünnte Plasmid-DNA regelmäñig (25 µL/Rohr) und gespeichert bei-20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren. Das Plasmid DNA zu verdauen, während die Rohre im Schritt 3.5.1 schütteln werden. Das Plasmid DNA standard nicht zu verdauen.
      2. Die Röhrchen mit den verdauten Plasmid DNA standard 450 µL Wasser oder TE hinzufügen und gut mischen. Übertragen Sie 70 µL dieser Mischung zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1.330 µL Wasser oder TE, eine verdünnte Plasmid standard (25 Pg/µL) zu machen.
      3. Folgen Sie Tabelle 4 um eine Reihe von zweifache Verdünnungsreihen (600 µL/Rohr) zu erstellen. Die Verdünnungen mischen durch Vortexen für 5 s.
    2. Denaturierung der Standards und virale DNA-Proben
      1. Jeder standard Verdünnung 600 µL 2 x alkalische Lösung hinzufügen. Mischen Sie gut durch Vortexen für 5 bis 10 S. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
      2. Jede virale DNA-Probe 120 µL 2 x alkalische Lösung hinzufügen. Mischen Sie gut durch Vortexen für 5 bis 10 S. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
    3. Das Dot-Blot Gerät einrichten
      1. Mit Schere, Schnitt eine Membran blotting (z.B. Zeta-Sonde) auf eine geeignete Größe für die Anzahl der Proben und Standards. Genießen Sie die Membran mit Wasser für 10 min vor dem Inverkehrbringen ein Dot-Blot-Apparat. Ungenutzte Brunnen auf der Membran Apparat zu decken.
        Hinweis: Behandeln Sie die Membran mit einer sauberen Pinzette. Um leere Brunnen zu decken, kann die leichte blaue Schutzfolie, die mit der Membran kommt verwendet werden. Lassen Sie sich nicht die Membran zum Trocknen vor dem verbindlichen Muster und Normen. Weitere Informationen über die Montage und Nutzung des Geräts finden Sie in der Benutzer manuell19.
      2. Fügen Sie Wasser in die Vertiefungen, die Samples geladen werden. Gelten Sie Vakuum und ziehen Wasser durch die Brunnen auf Fehler zu überprüfen und erneut testen, wenn feste. Festziehen Sie Schrauben wieder beim Einsatz von Vakuum zu enge Abdichtung zu gewährleisten.
        Hinweis: Unvollständige Abdichtung kann Probe zwischen den Wells austreten.
      3. Sobald Wasser komplett durchgezogen, lassen Sie das Vakuum vollständig (d. h., das Vakuum mannigfaltige sollte offen für Luftdruck).
    4. Laden von Standards und Proben auf den Dot-Blot-Apparat
      1. Gelten Sie 400 µL jeder verdünnte Plasmid DNA standard für jedes gut, und führen Sie vier Fahrspuren der standard Verdünnungen. Verwenden Sie zwei separate Aliquote des standard Digest und laden Sie jeweils in zweifacher Ausfertigung. 200 µL/Well jeder virale DNA-Probe anwenden.
        Hinweis: Wenn Sie die restlichen ~ 40 µL denaturierten Proben, verdünnte Proben (z.B.10-divisibel verdünnten Proben mit 20 µL Probe plus 180 µL 1 x Lauge) vorbereitet und ausgelöscht, wenn nötig.
      2. Wenden Sie sanfte Vakuum ziehen die DNA-Lösungen durch den Brunnen an.
        Hinweis: Vakuum Druck muss angepasst werden, durch teilweise ein drei-Wege-Ventil öffnen, so dass der Unterdruck auf den Punkt angewendet wird blot Apparate sowie die Atmosphäre (d. h.mit den Absperrhahn Armen positioniert ein ca. 45° Winkel wo es macht ein lauter Saug Geräusch).
      3. Sobald alle Brunnen geleert haben, lassen Sie das Vakuum durch Anpassen der drei-Wege-Ventil. Fügen Sie 400 µL 1 x alkalische Lösung in jede Vertiefung, die Standards und Proben enthalten. Warten Sie 5 min vor der Anwendung wieder Vakuum um den Brunnen zu leeren.
      4. Wenden Sie erneut das Vakuum in der gleichen Weise (siehe Schritt 3.6.4.2).
      5. Dot-Blot-Apparat unter Vakuum zu zerlegen, die Membran zu entfernen und spülen Sie ihn mit 2 X SSC. Legen Sie die Membran auf einem sauberen Papiertuch mit der DNA-gebundene Seite nach oben entfernen überschüssige 2 X SSC.
      6. UV-Crosslink getupft DNA auf der Membran mit einem entsprechenden UV-Vernetzer; die Membran ist jetzt bereit für die Hybridisierung.
        Hinweis: Für UV-Vernetzung können nasse Membranen verwendet werden. Die getrocknet, UV-vernetzte Membranen können bei Raumtemperatur gelagert werden. Weitere Informationen finden in der Tabelle der Materialien.
  7. Hybridisierung und waschen
    1. Die Hybridisierung-Puffer in einem 65 ° C Wasserbad erwärmen.
    2. Enzymatisch beschriften einer DNA-Sonde mit radioaktiven α -32P dCTP und reinige es mit handelsüblichen Kits nach Empfehlung des Herstellers.
      Hinweis: Wir verwenden eine Sonde von 0,5-2,0 kb in der Länge von einem Enhancer-Promotor-Region oder einer Protein-kodierenden Sequenz in das virale Genom. Obwohl dieses Protokoll 32P-markierten radioaktiven Sonden für Signalerkennung nutzt, nicht radioaktiv Chemolumineszenz oder fluoreszierende Sonden können auch verwendet werden (siehe Abschnitt Diskussion ).
    3. Legen Sie die Membran in einer Hybridisierung-Flasche mit der DNA-gebundene Seite nach oben, Spülen der Membran mit 5 mL vorgewärmt Hybridisierung Puffer und den Puffer zu verwerfen. Dann fügen Sie 10 mL vorgewärmte Hybridisierung Puffer und stellen Sie die Flasche in einem rotierenden Hybridisierung Ofen bei 65 ° C. Für ≥5 min drehen.
    4. Denaturieren Sie Hitze-20 µL 10 mg/mL geschert Hering oder Lachs Spermien-DNA-Lösung und die 32P-markierten Sonde (≥107 cpm) für 5 min, indem die Rohre auf einen Block Heatset bei 100 ° C. Dann Snap-Chill sie auf Eis für ≥2 min, kurz, Spin und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
      Achtung: Für radioaktive DNA-Sonden müssen 1,5 mL Röhrchen mit Schraubverschluss und o-Ring verwendet werden.
    5. Fügen Sie schnell die denaturierten Spermien-DNA und radioaktiven Sonde auf die Hybridisierung-Puffer in der Hybridisierung Flasche und schütteln Sie die Flasche für 10 s zu mischen. 65 ° C Ofen die Flasche wieder und inkubieren Sie die Flasche mit Rotation bei 65 ° C ≥4 h.
    6. Sobald Hybridation abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation, herausnehmen Sie die Hybridisierung Flasche und Gießen Sie dann die radioaktiven Sonde Lösung in ein 50 mL konische Röhrchen mit einer auslaufsicheren Stecker Dichtungskappe. Speichern Sie die Sonde in einen geeigneten Behälter, platziert in einem Kühlschrank für radioaktive Stoffe bezeichnet.
      Hinweis: Gebrauchte Hybridisierung Puffer mit einer Sonde, die bei 4 ° C gelagert wird kann mindestens 5 Mal wiederverwendet werden indem man die 50 mL konische Rohr mit einer auslaufsicheren Stecker Dichtungskappe, die Hybridisierung Puffer im Wasserbad 100 ° C für 5 min enthält.
    7. Waschen Sie die Membran mit waschen Puffer auf 65 ° c erhitzt Die Hybridisierung Flasche 20 bis 30 mL Waschpuffer hinzufügen und für 5 min. wiederholen dies Waschen 2 weitere Male drehen.
      Hinweis: Messen Sie Radioaktivität Waschlösungen und zeichnen Sie es ggf. vom örtlichen Institut.
    8. Legen Sie beim Waschen der Membran eine imaging-Bildschirm auf ein Bild-Radiergummi für 5 min Phosphor.
    9. Entfernen Sie nach der dritten Wäsche die Membran aus der Hybridisierung Flasche zu, entfernen Sie überschüssigen Puffer auf der Membran mit Papiertüchern und legen Sie die Membran in einem durchsichtigen Kunststoff Papierhalter. Überprüfen Sie die radioaktiven Signale auf der Membran mit einem Geigerzähler. Setzen Sie die gelöschten Phosphor bildgebenden Bildschirm an die Membran für 10 min, je nach der Intensität des Signals zu übernachten.
    10. Scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphor-Bild Scan-System und erhalten Sie die Daten auf Signalintensität jedes Punktes zu.
  8. Datenanalyse
    1. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit Tabelle und Daten-Analyse-Software (z.B.Excel).
      Hinweis: Log-Log-linearer Regression wurde verwendet, um eine standard Kurve zeichnen.
    2. Nanogramm-Äquivalent (ng-Eq) für jede der viralen DNA-Proben durch Interpolation zu bestimmen. Der ng-Eq ist die Menge an das Plasmid DNA verwendet, um eine Standardkurve zu zeichnen, die die Anzahl der viralen DNA-Moleküle entspricht. Wenn die Länge der das Plasmid DNA ist 8.000 bp, 1 ng-Eq einsträngige AAV virale DNA entspricht 2.275 x 108 Partikel.
      Hinweis: Die ng-Eq kann die Zahl der Viruspartikel durch die folgenden Gleichungen konvertiert werden:
      Equation 1
      Equation 2
      Die Anzahl der AAV Partikel werden herkömmlich als "Vg" (Vektor Genome) oder "DRP" (DNase ich beständig Teilchen) ausgedrückt.
    3. Berechnen Sie die AAV-Konzentrationen der Ausgangsstoffe. Weil die gepunkteten virale DNA 66,7 % stellt Equation 3 die virale DNA in den Ausgangsstoffen, 1 ng-Eq entspricht 1,7 x 109 Partikel/mL Equation 4 .
      Hinweis: Diese Korrektur ist nicht erforderlich, wenn die virale DNA in das Ausgangsmaterial enthaltenen auf eine Membran ohne Verlust ausgelöscht wird (siehe Abbildung 1).

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Representative Results

Ein repräsentatives Ergebnis der quantitativen Dot Flecken für die Quantifizierung der gereinigten AAV Vektor Bestände in großem Maßstab produziert ist in Abbildung 1dargestellt. Mit dieser Dot-Blot Assay war der Titer einer doppelsträngigen AAV2G9-CMV-GFP Vektor Aktie ermittelt. Der Vektor wurde durch zwei Runden der Cäsiumchlorid (CsCl) gereinigt-Dichtegradienten Ultrazentrifugation durch Dialyse als zuvor beschriebenen20gefolgt. In der Regel für gereinigte AAV-Vektor-Bestände, drei unterschiedliche Volumina der einzelnen AAV-Vektor-Aktien (z. B.0,3 µL, 0,1 µL und 0,03 µL) Dot-Blot oben beschrieben in zweifacher Ausfertigung mit einer Änderung unterliegen. DNase I Enzym A ist anstelle von S. Marcescens Endonuklease im Schritt 3.2 verwendet, und im Handel erhältlichen Bausatz zu extrahieren und zu reinigen virale DNA wird in Schritt 3.4 (siehe Tabelle der Materialien) verwendet. Im Beispiel in Abbildung 1dargestellt wurden Signal Intensitätswerte (willkürliche Einheit) gewonnenen jedes Plasmid DNA standard (Abbildung 1A) aufgetragen gegen die bekannteren DNA-Mengen eine Standardkurve (Abbildung 1 b), zeigen eine Korrelation zu zeichnen Koeffizient der 0.998. Mit diesem standard Kurve, wurde durch Interpolation festgestellt, dass 0,3, 0,1 und 0,03 µL-Aliquots des AAV2G9 Vektors 1.487 und 1.522 ng-Eq (0,3 µL), 0.487 und 0.507 ng-Eq (0,1 µL) und 0,158 und 0.171 ng-Eq (0,03 µL) zeigte. Dies gab die folgenden sechs Werte: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 und 5.700 ng-Eq/µL für dieses besondere AAV2G9 Vektor-Lager, führt zu einem Durchschnitt von 5.16 ± 0.27 ng-Eq/µL (Mittelwert ± SD). Da die Länge des Plasmids verwendet, da der Standard (pEMBL-CMV-GFP) 5.848 ist bp, die Titer dieses Vektors AAV2G9 war entschlossen, 8.0 x 1011 Vg/mL nach Gleichung 2 in Schritt 3.8.2 sein. Dieser Assay wird mindestens zweimal wiederholt, um die endgültige Titer von AAV Vektor Bestände zu bestimmen.

Ein repräsentatives Ergebnis von Kreuz-Ergänzung Assays die AAP-Abhängigkeit in VP3 Kapsid Montage und die Möglichkeit für AAPs zusammenzubauen VP3 Proteine heterologen Herkunft zu beurteilen ist in Abbildung 2angezeigt. In-vitro- Studien der AAV oft benötigen keine Virus-Reinigung, Schlüsse, und Experimente mit ungereinigten Virus Präparate wie Rohöl Zelle Lysates und Virus-haltigen Nährmedien sind ausreichend, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. In diesem Experiment wurde eine quantitative Dot-Blot Assay AAV Viruspartikel Produktion aus alle möglichen AAV VP3-AAP Kombinationen zwischen AAV5, AAV9 und Schlange AAV einschließlich VP3-Nr. AAP Kombinationen anhand. Die Proben in einer doppelten Reihe von ein Experiment wurden ausgelöscht, auf 1 X und 10 X Verdünnungen (Serie A und Serie B in Abbildung 2A, beziehungsweise). Das Diagramm in Abbildung 2 b gezeigt wird die Quantitative Analyse der Punkte zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass: (1) AAV5VP3 montiert, unabhängig davon, ob AAP vorausgesetzt in Trans, (2) AAP5 und AAP9 AAV9VP3 Kapsid Versammlung fördern können zwar AAP5 weniger effektiv als AAP9, (3 Funktionen) weder AAP5 noch AAP9 zeigt eine Baugruppe, die Förderung der Aktivität über die Schlange AAV VP3 und (4) Schlange AAP fördert nur Montage der Schlange AAV VP3. (1) und (2) im Einklang mit früheren Beobachtungen6, aber die eindeutig bestimmte AAV VP3-AAP Interaktion in Schlange AAV ist eine neuartige Entdeckung in diesem Experiment. Eine Schwäche des Kreuz-Ergänzung Assays basieren auf quantitativen Dot-Blot ist, dass die negative-Kontrolle immer spürbaren Hintergrund Signale zeigt, die gänzlich eliminiert werden können. Daher Dot-Blot Assay alleine kann nicht ausschließen, dass Kapsid montiert auf ein Niveau unterhalb der Empfindlichkeit des Tests. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass um den Negativkontrollen zu generieren, eine Bedingung unter dem AAV virale Genome exponentiell replizieren in Ermangelung das Kapsid VP3 Protein verwendet wird. Solche negativen Kontrollen durch transfecting HEK-293-Zellen mit pAAV-Reporter, pHLP-Rep und pHelper (Tabelle 2) erzeugt werden können, und werden verwendet, um Fehlalarme zu reduzieren.

DNase ich verbreitet hat als eine Nuklease in Dot-Blot und qPCR basierende Assays für die Quantifizierung der AAV um residual Plasmid-DNA und unverpackten viraler Genome, die AAV Vorbereitungen kontaminiert sind zu entfernen. Diese Verunreinigungen führen würde sonst zu einer Überschätzung der Titer; Daher ist die Nuklease Verdauung ein sehr wichtiger Schritt für die präzise Quantifizierung virale Genom-Titer. DNase ich Enzyme gibt es von verschiedenen Herstellern und kommerzielle Anbieter; scheint jedoch die Bedeutung der Auswahl der DNase I AAV Quantifizierung unterschätzt worden. Um zu untersuchen, wie die Wahl der Nuklease, die Ergebnisse des Dot-Blot Assays auswirken wird, wurden die folgenden drei Nukleasen für ihre Fähigkeit, Hintergrund Signale aus der AAV Vektor-haltigen Nährmedien zubereitet wie oben in Schritt 2 beschrieben entfernen verglichen. und 3: DNase I Enzym A, DNase I Enzym B und S. Marcescens Endonuklease (Table of Materials). Veröffentlichte Studien haben die ehemaligen zwei DNase verwendet ich Enzyme13,21,22,23,24 und wir benutze S. Marcescens Endonuklease in früheren und aktuellen Studien. Zu unserer Überraschung wurde festgestellt, dass DNase I Enzym A überhaupt keine geeignete Wahl für die Dot-Blot Assay mit Hilfe der Virus-haltigen Medien in den verschiedenen Bedingungen getestet, was zu hohen Hintergrund-Signale von der negativen Kontrolle während der DNase I Enzym B und S. Marcescens Endonuklease reduziert effektiv die Hintergrund-Signale mit DNase I Enzym b ~ 2-fach effektiver als S. Marcescens Endonuklease (Abb. 3A, B). Enzym DNase I C auch erwies sich sehr effektiv, um die Hintergrund-Signale (Daten nicht gezeigt) zu reduzieren. Diese Daten zeigen, dass es erhebliche Unterschiede im Enzym-Aktivitäten unter den handelsüblichen Nukleasen wenn die Enzymreaktionen im ungereinigten AAV Vorbereitungen durchgeführt werden, obwohl Nuklease Verdauung sollte wirksam, wenn Sie ein kleines Menge des gereinigten virale Preps wird unter einer optimierten Zustand behandelt. Damit unterstreichen diese Daten die Bedeutung der richtigen Auswahl der Nuklease im Test bei ungereinigten AAV Vorbereitungen eine quantitative Dot Blot oder qPCR Test unterziehen.

Figure 1
Abbildung 1: eine repräsentative Dot Blot Analyse der Titer von CsCl-gereinigte AAV Vektor bestimmen. (A) Double-Stranded AAV2G9-CMV-GFP Vektor wurde in HEK 293 Zellen standardmäßig drei Adenovirus-freie Plasmid Transfektion Methode in großem Maßstab hergestellt und durch zwei Runden von CsCl Gradienten Ultrazentrifugation, gefolgt von Dialyse gereinigt. 0,3, 0,1 und 0,03 µL der gereinigten AAV Vektor Aktie (getupft auf der rechten Spalte) wurden die quantitativen Dot Blot Assay in zweifacher Ausfertigung mit zwei Sätzen von duplizierten Plasmid DNA-Standard (Std) unterzogen. Der Fleck war mit einer 32-P-Label GFP-Sonde (0,77 kb) hybridisiert, und das Bild wurde mit einem Phosphor-Image scanning-System erreicht. (B) ein standard Kurve zeigt die Beziehung zwischen bekannten Plasmid DNA-Mengen (ng-Eq, X-Achse) und Punkt Intensitäten (willkürliche Einheit (AU), Y-Achse). Die Zahlen auf der Y-Achse wurden mit dem Phosphor-Bild Scan-System erhalten. R steht für Pearsons Korrelationskoeffizient. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot-Blot Assay. Doppelstrang-AAV-CMV-GFP Vektor partikelherstellung wurde für die VP3 Proteine aus AAV5, AAV9 und Schlange AAV in das Vorhandensein oder Fehlen von ihren Verwandten AAPs oder in Gegenwart von AAPs heterologen Herkunft getestet. (A) die Probe in einem biologisch doppelte Reihe von Experimenten (Serie A und Serie B) mit 4 h Inkubationszeit mit S. Marcescens Endonuklease durchgeführt wurde, und der AAV-Vektor-Titer gewonnenen jede Kombination wurde durch einen quantitativen Punkt bestimmt Blot Methode im Abschnitt Protokoll beschrieben. Jeder Punkt steht für zwei Drittel (der 5. und 6. Zeilen, 66,7 %) oder zwei-Thirtieths (der 7. und 8. Zeilen, 6,7 %) der DNA von jeweils 200 µL Medium erholt von Proben oder der negativen Kontrolle gesammelt. Die oberen vier Zeilen (Zeilen 1 bis 4) stellen zwei Sätze von Plasmid DNA-Standards (STD 1 und 2 STD) ausgelöscht in zweifacher Ausfertigung (d.h. linearisierten pEMBL-CMV-GFP-Plasmid, die das Plasmid doppelsträngige AAV-CMV-GFP-Vektor-Herstellung verwendet wird). Die Dot-Blot-Membran wurde mit einer 32-P-Label GFP-Sonde sondiert. Die beiden Punkte mit abgerundete Rechtecke gekennzeichnet sind Negativkontrollen. Die ersten zwei Zeilen (1 STD) haben sind von der Unterseite des ursprünglichen Fleck aber geschnitten und unbeschadet Bildintensität beide Plasmid-Standards (STD 1 und 2 STD) nebeneinander anzeigen nach oben verschoben. Diese Manipulation wird durch eine schwarze Linie in der Abbildung angezeigt. (B) virale Titer war entschlossen, für die Kombinationen von VP3 und AAP Proteine durch das Dot blot Assay. Das Diagramm stellt einen biologisch quadruplicated Satz von Daten, zwei zentrale A und zwei aus einer anderen Dot-Blot, der nicht angezeigt wird. Fehlerbalken zeigt Mittelwert +/-SD (n = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich der enzymatischen Aktivitäten der verschiedenen Nukleasen bei ungereinigten AAV Vektor Vorbereitungen. (A) A quantitative Dot-Blot, die die Wirksamkeit jeder Nuklease-Behandlung bei der Beseitigung von Hintergrund-Signale. Ein Doppelstrang-AAV9-CMV-GFP Vektor-haltige Präparat ("AAV9-Vektor") und ein "keine-Kapsid-Steuerelement" wurden von HEK 293 Zelle Transfektion mit Plasmid DNA produziert, und der Test unterzogen. Die keine-Kapsid Kontrolle enthielt keine Viruspartikel aber exponentiell verstärkt unverpackten CMV-GFP-Vektor-Genome enthalten. MgCl2 wurde an einem oder bis zu dreimal die empfohlenen Mengen (6 mM und 18 mM für DNase I Enzym A; und 2,5 mM und 7,5 mM für Enzym DNase I B) ergänzt, ohne Berücksichtigung der 0,8 mM MgSO4 in das Medium vorhanden. Für die Behandlung mit S. Marcescens Endonuklease wurde nur eine Bedingung, die im Abschnitt Protokoll beschrieben getestet. Alle Proben wurden mit jedem Nuklease für 1 h behandelt. Die Dot-Blot-Membran wurde mit einer 32-P-Label GFP-Sonde sondiert. Die zwei rechten Spalten (2 STD) haben sind vom linken Rand der ursprünglichen Fleck aber geschnitten und zog auf der rechten Seite ohne Änderung Bildintensität beide Plasmid-Standards (STD 1 und 2 STD) nebeneinander anzeigen. Diese Manipulation wird mit einer dünnen schwarzen Linie in der Abbildung angezeigt. (B) Punkte in die keine-Kapsid Kontrollproben in zentrale A werden quantifiziert und als Mittelwert ± | jeden Wert – Mittelwert |. Sieben von 12 Proben behandelt mit DNase I Enzym A (gekennzeichnet mit einem Sternchen) zeigen Werte nur geringfügig höher als der höchste Standard; Deshalb sind sie in diesem Diagramm zum Vergleich enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Serratia marcescens Endonuklease Puffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Bis pH 8,5 mit 4 M NaOH einstellen.
10 x Proteinase K-Puffer
100 mM Tris-HCl pH 8.0
100 mM EDTA pH 8.0
5 % SDS
2 x alkalische Lösung
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 X SSC (1 L)
175,3 g NaCl
88,2 g Natriumcitrat tribasic (Na3C6H5O7)
Denhardt Lösung 100 x (50 mL)
1 g Rinderserumalbumin (Teil V) Hinweis: Filterung ist wichtig, um kleine Partikel zu entfernen, da sie Hintergrund Hybridisierung Signale verursachen.
1 g Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidon
In 20 mL Wasser in einem 55 ° C-Wasserbad auflösen.
Endgültige Lautstärke bis 50 mL.
Sterilisieren Sie Filter-mit einen 0,22-μm-Filter.
Hybridisierung Puffer
1 % SDS Hinweis: Store Hybridisierung Puffer bei 4 ° C und Hitze bis 65 ° C in einer Wasser-Bad-vor dem Gebrauch.
6 X SSC
5 x Denhardt Lösung
10 mM Tris-HCl pH 8.0
Waschpuffer
0,1 % SDS
0,1 X SSC
Polyethylenimine (PEI) Lösung (1 mg/mL, 500 mL)
500 mg PEI in 450 mL Wasser hinzufügen und umrühren. Hinweis: Bei längerer Lagerung empfiehlt-80 ° C.
Fügen Sie konzentrierter HCl pH nach unten zu bringen < 2.0 PEI aufzulösen (ca. 800 µL HCl wird erforderlich sein).
Fügen Sie 10 M NaOH pH-Wert bis zu 7,0 zu bringen (ca. 500 µL 10 M NaOH wird erforderlich sein).
Stellen Sie die Lautstärke auf 500 mL Wasser.
Sterilisieren Sie Filter-mit einen 0,22-μm-Filter.
Aliquoten und Store bei-20 ° C.
Phenol-Chloroform (1:1 Mischung) für quantitative Dot Blot
Fügen Sie Puffer gesättigt Phenol (pH 8,0) und chloroform im Verhältnis 1:1 in ein 50 mL Polypropylen konischem Rohr. Hinweis: Der Puffer organische Deckschicht bleibt in der Röhre in Probenröhrchen durch pipettieren übertragen werden kann und kann den Test ungenau machen.
Vortex Rohr kräftig zu mischen.
Phasentrennung durch Zentrifugation ermöglichen und dann die wässrige Schicht vollständig entfernen.
Shop bei 4 ° C.

Tabelle 1: Lösung und Puffer Rezepte. Rezepte für Lösungen und Puffer mußte vervollständigen den quantitativen Dot blot Protokoll.

Plasmid AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negativkontrolle (μg) Transfektion Kontrolle (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0,4 0,4
pCMV-Flagge-AAPx 0,4
pAAV-Reporter 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
pCMV (leer) 0,4 0,8
pCMV-GFP 2.0
Insgesamt 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabelle 2: Plasmid-Kombinationen für AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Assay durchgeführt in einem 6-Well-Plattenformat. Kombinationen von Plasmid DNA für HEK 293 Zelle Transfektion in jeder Versuchsgruppe zu verwendende werden angezeigt. pCMV-AAVx-VP3, ein Plasmid mit dem Ausdruck AAV Serotyp X (X = 1, 2, 3, etc.) VP3 Protein unter der CMV-IE-Enhancer-Veranstalter; pCMV-Flagge-AAPx, ein Plasmid mit dem Ausdruck AAV Serotyp X (X = 1, 2, 3, etc.) AAP Protein unter der CMV-IE-Enhancer-Veranstalter; pAAV-Reporter, ein Plasmid, das zwei AAV2 inverted terminal Repeats (ITRs) und richtet sich an rekombinanten AAV-Vektor-Produktion; pHLP-Rep, ein Plasmid mit dem Ausdruck AAV2 Rep Protein; pHelper, ein Adenovirus-Helfer-Plasmid; pCMV (leer), eine leere Plasmid hinzugefügt, um die experimentellen Bedingungen zu steuern; pCMV-GFP, ein Plasmid mit dem Ausdruck einer Fluoreszenz Marker-gen (z. B.GFP) um zu überprüfen, erfolgreiche Transfektion. Transfektionen erfolgen in 6-Well Platten und insgesamt 2 µg Plasmid DNA.

Mix A Für 10 Röhrchen (μL)
Serratia marcescens Endonuklease Puffer 91,2
0,1 M NaOH 8.8
Insgesamt 100
Mix B Für 10 Röhrchen (μL)
Serratia marcescens Endonuklease Puffer 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonuklease (250 Einheiten/μL) 0,176
Insgesamt 100
Mix C Für 10 Röhrchen (μL)
10 x Proteinase K-Puffer 400
Proteinase K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
Insgesamt 1.800
Mix D Für 10 Röhrchen (μL)
100 % Ethanol 8.000
3 M Natriumacetat (pH 5,2) 320
Auster Glykogen (20 mg/mL) 10
Insgesamt 8.330

Tabelle 3: Liste der master-Mix Reagenzien. Mix A und Mix-B sind für die S. Marcescens Endonuklease Behandlung im Schritt 3.2 verwendet. Diese zwei Mischungen sollten separat erfolgen Niederschlag des magnesiumhydroxids zu verhindern. Mix C dient zur Proteinase K Behandlung im Schritt 3.3. Mix D dient Ethanol Niederschlag im Schritt 3.4.3. Die in der Tabelle angegebenen Mengen sind für master-Mix Reagenzien für 10 Röhrchen.

Plasmid DNA-Standard (ng) Volumen (µL) 25 Pg/µL Plasmid DNA-Standardlösung Wassermengen (µL) Gesamtvolumen (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0,625 75 525 600
0.313 37,5 562,5 600
0.156 18,8 581.2 600
0,078 9.4 590.6 600
0,039 4.7 595.3 600

Tabelle 4: Quantitative Dot-Blot Plasmid DNA Normen. Benötigte Menge an 25 Pg/µL Plasmid DNA-Standardlösung und Wasser oder TE vorzubereitende Plasmid DNA Normen durch zweifache Verdünnungsreihen (600 µL/Rohr) werden angezeigt. Die Zahlen in der Plasmid-DNA-standard-Spalte (0,039 bis 5 ng) sind die Menge an DNA in 200 µL jedes Plasmid-DNA-standard-Lösung.

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Discussion

In diesem Bericht wird die Nützlichkeit des quantitativen Dot-Blot Assays AAV AAPs und ihre Rolle im Kapsid Montage studieren beschrieben. Erkenntnisse aus diesen Studien bieten detaillierte Einblicke in die angeborenen Unterschiede in den Prozess der AAV Kapsid Montage und die funktionale Rolle der AAPs zwischen verschiedenen Serotypen. In dieser Hinsicht der AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot blot Test ergab, dass die Schlange AAV VP3 eine strenge Abhängigkeit auf die Co Expression von seinen Verwandten AAP Kapsid Montage angezeigt und Schlange AAP Kapsid Montage der heterologen Serotypen nicht fördert . Diese Beobachtung ist faszinierend, denn die AAP-abhängige AAV, die Serotypen wurden bisher untersucht (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 und 12) sind alle in der Lage, Montage zumindest zu einem gewissen Grad zu verarbeiten, durch die Verwendung einer heterologen AAP-6.

Quantitative Punkt oder Slot-Blot-Hybridisierung ist eine traditionelle Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren enthalten in mehrere Proben gleichzeitig in einer geeigneten Weise25. Die Methode hatte für DNA und RNA Quantifizierung verbreitet bis qPCR in den 1990er Jahren26,27verbreitet wurde. Obwohl qPCR Vorteile gegenüber quantitativen Dot-Blot hat und andere Hybridisierung basierende Assays in diesem qPCR weist eine höhere Empfindlichkeit und einen größeren Dynamikumfang, trägt es auch eine Risiko der exponentiell vermehren Fehler, ohne es zu wissen, die was der Fall war für die Titer der AAV Vektor Bestände von qPCR13,23bestimmt. Quantitative Dot-Blot Assays sind einfach eingerichtet mit sehr preiswerten Kosten und leicht ausgeführt, solange die Forscher auf eine quantitative Molekulare imaging-System zugreifen, die Signale von Dot-Blot-Membranen mit entweder einer radioaktiven Sonde hybridisiert erwerben können oder einer nicht-radioaktiven Chemolumineszenz oder fluoreszierende Sonde. Obwohl dieses Protokoll 32P-markierten radioaktiven Sonden für Signalerkennung nutzt, nutzen andere erfolgreich nichtradioaktiven DNA-Sonden mit einer handelsüblichen thermostabile alkalische Phosphatase28direkt beschriftet. Dot-Blot Assays verwenden eines einfachen Prinzips und der Test an sich stellt eine technische Herausforderung für die Darsteller; die Ergebnisse sind daher in der Regel auch von unerfahrenen Personen reproduzierbar.

Neben den hier beschriebenen Anwendungen verwenden wir routinemäßig eine vereinfachte und beschleunigte Version der Dot Blot Verfahren, das Semi-Quantifizierung AAV Partikel können schnell. Vorteile von Dot-Blot Assays in diesem Zusammenhang sind unter anderem: (1) der Test erfordert keine Reinigung oder enzymatische Amplifikation viraler Genome die dauert Stunden, (2) eine Kombination aus Wärme und alkalischen Denaturierung genügt, AAV Partikel in einer Probe zu brechen Lösung und Freigabe denaturiert viraler Genome in die Lösung, die bereit sind, binden an eine Dot-Blot-Membran und (3) die Gegenwart von Salz bei hohen Konzentrationen in Proben wirkt sich nicht deutlich die Untersuchungsergebnisse. Beispielsweise ist es möglich, Semi-Quantifizierung AAV Partikel im CsCl-reiche Lösungen (z.B. von CsCl-Dichtegradienten Ultrazentrifugation erhaltenen Fraktionen) indem man eine kleine aliquoten (≤10 µL) Proben in 100 µL 1 x Lauge, bei 100 ° c erhitzen C für 10 min, und auf eine Membran mit oder ohne Standards bereit im voraus, gefolgt von einer Hybridisierung von 15 min, 3 x 3 min Waschungen und Exposition gegenüber einem Phosphor imaging-Bildschirm für 15 min (oder länger bei einer Sonde mit verminderter Radioaktivität) Beflecken. Die ganze Prozedur kann in 1 h abgeschlossen werden, sobald der Benutzer mit dem Verfahren vertraut wird. Wir verwenden dieses beschleunigte Verfahren, das wir gewöhnlich "kochende Dot-Blot-Methode" nennen, AAV identifizieren Partikel-reiche CsCl Fraktionen während der Vektor-Reinigung verarbeiten und grob bestimmen Titer von gereinigten AAV-Vektor-Aktien vor Beginn der umfangreichen Verfahren zur Charakterisierung der Vektor. So, obwohl Dot-Blot Assays angesehen werden könnten, als eine veraltete Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren und sind bereits mit verschiedenen PCR-basierte Methoden in den unterschiedlichsten wissenschaftlichen Disziplinen ersetzt worden, gibt es noch eine Reihe von Vorteilen dieser Methode, die Forscher in ihren Laboratorien erwägen zu machen.

Der wichtigste Schritt im Protokoll ist die Nuklease Behandlung der Proben. Wenn dieser Schritt nicht in einem optimalen Zustand durchgeführt wird, würde es hohen Hintergrund Signale führen. Wir verwenden S. Marcescens Endonuklease während DNase ich Enzyme aus verschiedenen Quellen sind weit verbreitet in anderen Labors für die virale DNA-Quantifizierung. Die DNase I des bovinen Bauchspeicheldrüse Herkunft von Forschern am häufigsten verwendet worden ist. Dies ist zum Teil weil die bovine pancreatic DNase ich erstmals identifiziert und ausführlichsten biochemisch29 charakterisiert. Die DNase ich Enzyme derzeit von kommerziellen Anbietern entstehen aus verschiedenen biologischen Quellen wie Pichia Pastoris (DNase I Enzym A) die nativen Form von Rindern Bauchspeicheldrüse (z.B.Enzym DNase I B), gereinigt und rekombinante Enzyme produziert in einem Hefearten oder Escherichia coli (DNase I Enzym C). Wir haben festgestellt, dass die DNase ich Enzyme aus allen drei dieser unterschiedlichen Quellen werden in veröffentlichten AAV Vektor Quantifizierung Studien; jedoch haben nach unserer Kenntnis keine der bisherigen Studien untersucht, ob die Enzyme aus verschiedenen Quellen ebenso wirksam bei der Verdauung von kontaminierende DNA-Moleküle in AAV Vektor Vorbereitungen. Es sei darauf hingewiesen, dass DNase ich Behandlung für AAV Vektor Assays erfolgt oft unter nicht-optimierten Bedingungen aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen Kulturmedium und Zellen abgeleitet. Die Beobachtung, dass DNase I Enzym A nur teilweise aktiv in das Kulturmedium verwendeten wir hat erhebliche Auswirkungen bei der Gestaltung der Assay für AAV Vektor Quantifizierung von Dot-Blot und qPCR und warnt Forscher hierzu bislang nicht identifizierte. In diesem Zusammenhang ist S. Marcescens Endonuklease ausgedrückt in E. Coli, eine ideale Endonuklease nicht nur für die Zwecke der Herstellung von AAV-Vektoren, sondern auch für AAV Vektor Quantifizierung. Und zwar deshalb, weil seine enzymatische Aktivität über eine breite Palette von pH-Werten und Konzentrationen von Magnesium-Ionen und monovalente kationen beibehalten werden kann. Aus diesem Grund und weil S. Marcescens Endonuklease ca. 2 mal weniger teuer als DNase I Enzym B auf einer Basis pro Einheit ist, bevorzugen wir, S. Marcescens Endonuklease in Routine quantitative Dot-Blot Analysen zu verwenden.

Zusammenfassend sind quantitative Dot-Blot Assays ein relativ einfaches Verfahren, das ohne weiteres auf die Fähigkeit, virale Partikel unter den unterschiedlichsten Bedingungen informieren kann. Im Vergleich zu alternativen verschoben Ansätzen, wie qPCR, erfordert dieser Ansatz wenig, wenn überhaupt, Optimierung. Es kann auch ohne weiteres auf Vektoren jedes Serotyps angewendet werden und kann verwendet werden, um beide Einzel und doppelsträngige Vektoren ohne Änderung des Protokolls Titer. Nach Transfektionen und Ernte der AAV Vektor-haltigen Proben (Kulturmedium und/oder Zellen) kann das gesamte Protokoll an einem Tag erfolgen so schnell beantworten Fragen über die Fähigkeit, virale Partikel aus unterschiedlichen Bedingungen, einschließlich produzieren verschiedene Kombinationen von AAV VP3 und AAP Proteine. Quantitative Dot-Blot bieten eine sinnvolle Methode um verschiedene offene Fragen, VP-AAP Interaktionen und ihre Rolle im Kapsid Montage in einer Vielzahl von verschiedenen AAV Serotypen und Isolate zu beheben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken für die Bereitstellung von uns mit dem pEMBL-CMV-GFP-Plasmid Xiao Xiao an der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken Christopher Cheng und Samuel J. Huang für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service (NIH R01 NS088399 und T32 EY232113) gewährt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

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Biologie Ausgabe 136 Adeno-assoziierte Virus (AAV) Montage-aktivierende Protein (AAP) Kreuz-Ergänzung quantitative Dot-Blot Assay virale Titer Gentherapie
Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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