Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ Dot Blot analys för AAV titrering och dess användning för funktionell bedömning av den Adeno-associerade Virus församling-aktiverande protein

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Detta manuskript Detaljer en okomplicerad dot blot analys för kvantitering av adeno-associerade virus (AAV) titrar och dess tillämpning på studera roll församling-aktiverande protein (åtgärdsprogram), en ny klass av icke-strukturella virusproteiner Funna i alla AAV serotyper, att främja montering av förhoppningsvis härrör från cognate och heterologa AAV serotyper.

Abstract

Medan adeno-associerade virus (AAV) är allmänt accepterat som en attraktiv vektor för genterapi, tjänar också som en modell virus för att förstå virus biologi. I det senare avseendet har den senaste upptäckten av ett icke-strukturella AAV protein, kallas församling-aktiverande protein (AAP), kasta nytt ljus på processerna som är inblandade i församlingen av viral kapsid VP proteiner i en kapsid. Trots många AAV serotyperna kräver AAP för montering, vi har nyligen rapporterat att AAV4, 5, och 11 finns undantag från denna regel. Dessutom visade vi att åtgärdsprogram och sammansatta förhoppningsvis av olika serotyper lokalisera till olika subcellulär fack. Denna oväntade heterogenitet i biologiska egenskaper och funktionella roller av åtgärdsprogram bland olika AAV serotyp understreck vikten av studier på åtgärdsprogram som härrör från olika serotyper. Detta manuskript Detaljer en okomplicerad dot blot analys för AAV kvantifiering och dess tillämpning att bedöma AAP beroende och serotyp specificitet i kapsid församling. För att påvisa nyttan av denna dot blot analys, anges vi för att karakterisera kapsid församling och AAP beroendet av orm AAV, en tidigare uncharacterized reptil AAV, samt AAV5 och AAV9, som tidigare har visat sig vara AAP-oberoende och AAP-beroende serotyp, respektive. Analysen visade att orm AAV kapsid montering kräver orm AAP och inte kan främjas genom åtgärdsprogram från AAV5 och AAV9. Analysen visade också att, till skillnad från många av de vanliga serotypen åtgärdsprogram som främjar heterologa kapsid församlingen genom cross-komplettering, orm AAP inte främja montering av AAV9 förhoppningsvis. Dessutom visar vi att valet av nuclease avsevärt påverkar avläsningen av dot blot analysen, och att välja en optimal enzym är således avgörande för framgångsrik bedömning av AAV titrar.

Introduction

Adeno-associerade virus (AAV) är en liten, icke-höljebärande, enkelsträngat DNA-virus med en arvsmassa av ungefärligt 4.7 kilobases (kb). AAV genomet innehåller öppna-läsning ramar (ORFs) för rep och cap generna. I 2010, en tidigare oidentifierad ickestrukturella protein som kodas av en + 1 ram-skiftat ORF inom AAV2 cap genen upptäcktes av Sonntag et al. och befunnits spelar en avgörande roll i församlingen av AAV2 kapsid VP monomer proteiner till en viral kapsid1. Denna roman protein har utsetts församling-aktiverande protein (AAP) efter vilken roll den spelar för att främja kapsid församling1.

ORFs för AAP har varit identifierade bioinformatically i genomen hos alla parvovirus i släktet Dependoparvovirus, men inte inom genomen hos virus av olika släkten av parvovirus familj1,2. Funktionella studier av denna roman protein var ursprungligen inriktat på AAP från prototypen AAV2 (AAP2), som har etablerat den viktiga rollen som AAP2 i inriktning omonterad VP proteiner till nucleolus för deras ackumulering och bildning i fullt monterade förhoppningsvis1,3,4. De AAV2 förhoppningsvis oförmåga att montera i avsaknad av AAP uttryck har varit självständigt bekräftas av flera grupper, inklusive vår1,2,3,4,5 . Senare undersökningar på AAV serotyperna 1, 8 och 9 bekräftade åtgärdsprogram kritiska roll i kapsid församling, som VP3 monomer proteiner av AAV1, 8, och 9 kunde inte bilda en färdigmonterad kapsid i avsaknad av samtidig uttryck för AAP2.

Nyligen, genom strategier som omfattar användningen av kvantitativa dot blot analyser, vi undersökte AAV1 förmåga att 12 VP3 monomerer att montera in förhoppningsvis i avsaknad av AAP uttryck och AAP1 förmåga till 12 att främja montering av VP3 monomerer från heterologa serotyper. Denna studie har visat att AAV4, 5, och 11 VP3 monomerer kan montera utan AAP. Dessutom konstaterades att åtta av de tolvna AAP serotyperna vi granskat (dvsalla utom AAP4, 5, 11 och 12) visas en bred förmåga att stödja kapsid montering av heterologa AAV serotyp förhoppningsvis, medan AAP4, 5, 11 och 12 visas en väsentligen begränsad förmåga i detta hänseende6. Dessa fyra serotyperna är fylogenetiskt avlägsen från andra AAP serotyper2,3. Studien har dessutom avslöjat betydande heterogenitet i subcellulär lokaliseringar av olika åtgärdsprogram6. Studien har vidare föreslagit att snäva associering av AAP med sammansatta förhoppningsvis och nucleolus, kännetecknet för AAV2 kapsid församling, nödvändigtvis inte kan utvidgas till andra serotyper inklusive AAV5, 8 och 9, som visar nukleolära uteslutande av sammansatta förhoppningsvis6. Således, information från studien av någon särskild serotyp AAP inte är allmänt tillämpliga på alla AAP biologi. Sådan förbryllande karaktär av AAP biologi understryker behovet av att undersöka den roll och funktion av varje AAP från både kanoniska och icke-kanoniska AAV serotyper.

AAP biologiska roll i kapsid församlingen kan bedömas genom att var fullt-förpackade AAV-virus-partikeln titrarna produceras i mänskliga embryonala njurar (HEK) 293 celler, den vanligaste cellinje för AAV vektor produktion, med eller utan AAP protein uttryck. Standardmetoderna för AAV kvantitering är kvantitativ PCR (qPCR)-baserade analyser7,8 och kvantitativa dot blot-baserade analyser9. Andra metoder för AAV virus-partikeln kvantitering såsom glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys10,11 eller optisk densitet mätning12 är inte idealiska för prover från många olika AAV serotyper eller prover förorenade med orenheter (rå lysates eller kultur media), som ofta är de prover som används för AAV forskning. För närvarande, används qPCR mest för AAV kvantitering; Det är dock nödvändigt att erkänna potentiella varningar för qPCR-baserad analys, som analysen kan leda till systemfel och betydande titer variationer13,14. PCR-baserade analyser påverkas av ett antal potentiellt störande faktorer, såsom förekomsten av kovalent stängt terminal hårnålar i PCR-mallar som hämmar förstärkning13. Även erfarna individ kan införa potential störfaktorer i en qPCR-baserade assay omedvetet13. Kvantitativa dot blot analyser finns däremot en klassisk molekylärbiologisk teknik som innebär inte genomet förstärkning och använder en mycket enklare princip med en minimal risk för fel jämfört med qPCR-baserade analyser. Metoden är mindre tekniskt utmanande; Analysens resultat är därför rimligen reproducerbara även av oerfarna personer.

I den här rapporten beskriver vi de metodologiska detaljerna för en kvantitativ dot blot analys vi rutinmässigt använder för AAV vektor kvantifiering och ge ett exempel på hur att tillämpa den analysmetod för att studera åtgärdsprogram församling-främjande roll gemensamt serotyp (AAV5 och AAV9) och tidigare uncharacterized AAP från Snake AAV14. I naturen, AAV VP proteiner och AAP proteiner uttrycks i cis från en enda gen (dvs, VP-AAP cis-komplettering), medan i analysen beskrivs här, VP och AAP proteiner levereras i trans från två separata plasmider (dvs.VP-AAP Trans-komplettering). Eftersom varje VP eller AAP protein från olika serotyper kan uttryckas från varje oberoende plasmid, blir det möjligt att testa heterologa VP-AAP kombinationer för kapsid församling (dvs, VP-AAP cross-komplettering). Kort, AAV VP3 från olika serotyper uttrycks i HEK 293 celler av plasmid DNA transfection att paketera en AAV vektor arvsmassa i närvaro eller frånvaro av cognate serotypen AAP eller i närvaro av ett heterologt serotyp AAP. Efter produktion, kultur media och cell lysates utsätts för en dot blot analys att kvantifiera det virala genomet inom kapsid skalet. Det första steget för dot blot analys är att behandla prover med en nuclease bort kontaminerande kontrollplasmid-DNA och oförpackade AAV genomen i prover. Underlåtenhet att göra detta skulle öka bakgrunden signalerna i synnerhet när orenat prover har analyserats. Detta följs sedan av en proteas behandling att bryta viral förhoppningsvis och släppa nuclease-resistenta virala genomer i provlösning. Nästa, virala arvsmassan är denaturerad, utplånas på ett membran och hybridiseras med en viral arvsmassa-specifika DNA sond för kvantitering. I exempel analysen redovisas här, visar vi att orm AAV VP3 kräver orm AAP för kapsid församling och att orm AAP inte främja montering av AAV9 förhoppningsvis till skillnad från många av de åtgärdsprogram som härrör från AAP-beroende serotyper som kan också främja montering av heterologa serotyp förhoppningsvis. Slutligen, Vi rapporterar en viktig varning till qPCR eller dot blot-baserade AAV kvantitering analyser att valet av nuclease avsevärt påverkar analysens resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Recept för lösningar och buffertar som behövs för detta protokoll finns i tabell 1. Protokollet beskrivs nedan är för VP-AAP cross-komplettering dot blot analysen att studera rollerna av AAP proteiner i kapsid församling. Metoden för den mer allmänna kvantitativa dot blot assay för renat AAV vektor titrering förklaras i avsnittet Representativt resultat .

1. konstruktion av VP3, AAP och AAV2 Rep uttrycker plasmider

  1. Byggandet av pCMV-AAVx-VP3 (x = serotyperna)
    1. PCR-Förstärk hela VP3 ORF (1,6 kb) använder en HiFi-DNA-polymeras och följande primer par: VP3 framåt, CTAA-RE1-CACC-N25 (de första 25 nukleotiderna av VP3 ORF); VP3 bakåt, TCTT-RE2-N25 (de senaste 25 nukleotiderna av VP3 ORF).
      Obs: RE1 och RE2 finns platser för restriktionsenzym (REs) för kloning. CTAA och TCTT är terminalen 5' och 3' tetranukleotider för att underlätta restriktionsenzym matsmältningen nära slutet av dubbelsträngat DNA. CACC är en Kozak samförstånd sekvens.
    2. Klona RE-digested PCR produkterna mellan motsvarande RE platser av en däggdjur uttryck vektor som använder human cytomegalovirus omedelbart-tidigt (CMV-IE) förstärkare-promotorn för high-level uttryck.
      Obs: För molekylär kloning, smälta 5 µg av ryggraden plasmid DNA med en restriction enzyme(s) vid en koncentration av 4 U/µg DNA för 1 h vid en optimal temperatur. För PCR-fragmenten, öka viktenheter enzymer som används (t.ex., 10 U/µg av 1,6 kb VP3 ORF PCR-produkten) och en längre inkubationstid (t.ex., 4 h) på grund av en ökning av antalet restriktionsenzym erkännande platser per längdenhet. Bra information i molekylärbiologi enzymer och kloning förfaranden inklusive bakteriell omvandling kan hittas någon annanstans15,16,17.
  2. Byggandet av pCMV-flaggan-AAPx (x = serotyperna)
    1. PCR-Förstärk hela AAP ORF (0,6 kb) utom den första aminosyra med en HiFi-DNA-polymeras och följande primer par: AAP framåt, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (av 25 nukleotider från den 4: e nukleotid i den AAP ORF); AAP bakåt, TCTT-RE2-N25 (de senaste 25 nukleotiderna av AAP ORF).
      Obs: GACTACAAGGACGACGATGACAAA koder en flagga tagg, som har visat sig ha några skadliga effekter4,5 men kan utelämnas om onödiga.
    2. Klona RE-digested PCR produkterna mellan motsvarande platser i en däggdjur uttryck vektor med CMV-IE enhancer-promotorn15,16,17.
  3. Byggandet av pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg pAAV-RC2 plasmiden (7,3 kb) med 20 enheter varje Xho jag och Xcm, och rena DNA med en kommersiell DNA rening kit eller fenol-kloroform extraktion.
      Obs: Borttagning av på 1.8 kb Xho jag-Xcm jag fragment från 7,3 kb pAAV-RC2 plasmid resulterar i en förlust av kapsid VP proteinuttryck samtidigt bevara den Rep proteinuttryck.
    2. Slö-DNA som avslutas med 6 enheter av T4 DNA-polymeras, agaros gel-rena det 5,5 kb DNA-fragmentet, och själv ligera renat fragmentet med 50 till 100 ng av DNA och 400 enheter av T4 DNA-ligase enligt tillverkarens rekommendation15.
    3. Följ standard bakteriell omvandling proceduren refereras i steg 1.1.2 Obs.
  4. Verifiera plasmiden konstruktioner av restriktionsenzym matsmältningen och sekvensering15,18.
  5. Utföra plasmiden minipreps eller maxipreps som använder kommersiellt tillgängliga kit för att erhålla en tillräcklig mängd av plasmid DNA för nedströms AAV produktion experiment.

2. produktion av AAV i HEK 293 celler av Plasmid DNA Transfection (Cross-komplettering Assay)

  1. Kultur HEK 293 celler i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM)-hög glukos (4,5 g/L) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% Penicillin & Streptomycin Mix, och 1 mM L-glutamin, en 37 ° C inkubator med 5% koldioxid (CO2).
    Obs: AAV titrar variera avsevärt beroende på källan till HEK 293 celler.
    Varning: Även om AAV kan hanteras på biosäkerhet nivå 1 (BSL1) inneslutning, BSL2 inneslutning rekommenderas för HEK 293 cell arbete.
  2. Dag -1 (24 h före transfection), platta 6 – 7 x 105 HEK 293 celler per brunn i 2 mL av det kompletta medium som beskrivs i steg 2.1 i en 6-väl skylt(ar). Detta uppnår allmänt ~ 90% konfluens nästa dag.
  3. Dag 0: Transfection
    1. Förberedelse för DNA transfection
      1. Se till att celler har nått ~ 90% konfluens.
      2. Värm upp DMEM kompletteras med 1% Penicillin & Streptomycin Mix och 1 mM L-glutamin men utan 10% FBS (dvsserumfritt medium) i 37 ° C vattenbad.
      3. Låt polyethylenimine (PEI) lösningen uppnå rumstemperatur.
    2. Beredning av plasmid DNA blandning
      1. Blanda plasmidsna 96 µL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan CaCl2 eller MgCl2 i sterila 1,5 mL mikrocentrifugrör som anges i tabell 2. Den totala mängden DNA är 2 µg per brunn.
        Obs: Volymer för plasmid DNA lösning kan beaktas om de är nominella. Volymjustering rekommenderas om den totala volymen av plasmid DNA lösningar är ≥10 µL.
    3. PEI transfection
      1. Tillsätt 4 µL av PEI lösning (1 mg/mL) till PBS-plasmid DNA mixen (beredd enligt ovan). Den slutliga volymen är ca 100 µL (5% volym odlingssubstrat). Vortex rören kort och inkubera DNA: PEI blandningen under 15 minuter vid rumstemperatur.
      2. Väntan på 15 min ruvning att slutföra, ersätta odlingssubstratet med förvärmd serumfritt medium som beskrivs i steg 2.3.1.2.
      3. En gång 15-min inkubering av DNA: PEI blandningen är klar, kort snurra rören med en mikrocentrifug att samla vätska till botten av rören och Lägg DNA: PEI blandningen droppvis till odlingsmediet i varje brunn av HEK 293 kultur plattan. Försiktigt agitera plattorna och återföra dem till en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
      4. Behålla cellerna i detta transfection medium till skörden på dag 5 (ingen medium förändring krävs).
  4. På dag 1 och dag 2, Observera celler transfekterade med pCMV-GFP plasmiden under en inverterad fluorescens Mikroskop för att bedöma transfection effektivitet.
    Obs: för fluorescensmikroskopi, här 10 X / 0,25 numeriska bländaröppningen mål i kombination med ett 10 × okular användes, och 450 – 490 nm excitation bandpassfilter och 515 – 565 nm bandpassfilter utsläpp var anställda. Villkoret ovan ger normalt mer än 70% transfection effektivitet. Celler kan uppvisa vissa morfologiska förändringar (t.ex. celler har blivit smal) på grund av villkoret serumfritt.
  5. Dag 3 – 5, fortsätta att odla transfekterade cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  6. På dag 5, samla in både celler och virus-innehållande medium i 15 mL polypropylen koniska rör genom pipettering upp och ned eller genom att skrapa med en cell skrapa.
  7. Lagra proverna vid-80 ° C fram till användning.

3. dot Blot analys för AAV kvantitering

  1. Återvinning av viruspartiklar
    1. Snabbt Tina frysta rören i 37 ° C vattenbad. Vortex rören kraftigt i 1 min att maximera återvinning av AAV från celler.
    2. Pellet cellfragment genom centrifugering vid 3 700 x g vid 4 ° C i 10 min. Ta 200 µL av supernatanten från varje rör och överföra den till en märkt mikrocentrifug rör med skruvlock för dot blot analysen.
      Obs: Alikvot återstående supernatanten i mikrocentrifug rör och lagra dem fryst vid-80 ° C för framtida bruk. Här polypropylen mikrocentrifugrör fäst med skruvlock och en O-ring användes. Tight tätning krävs att förhindra spill av AAV och fenol-kloroform.
  2. Behandling med Serratia marcescens Amiiiiin
    1. Förbereda Mix A och Mix B reagenser (tabell 3). Lägg till 10 µL av Mix A och 10 µL Mix B i varje rör. Vortex rören för 5 s, kort snurra rören för att samla vätska till botten av rören och minst Inkubera rören vid 37 ° C 1 h.
      Obs: Blandning A innehåller NaOH och optimerar pH för behandling med S. marcescens Amiiiiin. Blandning B tillskott magnesium. Koncentrationen av S. marcescens Amiiiiin i kommersiellt tillgängliga enzym bestånd kan variera. Volymen av S. marcescens Amiiiiin behöver justeras för att göra 200 U/mL efter tillägger Mix A och Mix B in rören i steg 3.2.1.
      Obs: En längre inkubationstid, upp till 4 h, kan minska bakgrund signaler.
    2. I slutet av ruvning, kort snurra rören med en bänkmonterade centrifug samla kondens och lösning från toppen och sidorna av rören.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Proverna kan förvaras fryst vid-20 ° C eller -80 ° C.
  3. Proteinas K behandling
    1. Förbereda Mix C reagens (tabell 3). Tillsätt 180 µL av Mix C i varje rör. Vortex rören för 5 s, kort snurra rören och inkubera rören vid 55 ° C för 1 h.
      Obs: EDTA i Mix C reagensen kelater gratis magnesium joner och inaktiverar S. marcescens Amiiiiin.
    2. Vid slutet av ruvning, tillåta prover nå rumstemperatur och kort snurra rören med en bänkmonterade centrifug samla kondens och lösning från toppen och sidorna av rören.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Proverna kan förvaras fryst vid-20 ° C eller -80 ° C. För att återuppta protokollet, inkubera rören vid 55 ° C i 5-10 min att upplösa SDS kristaller som finns i bufferten helt.
  4. Fenol-kloroform utvinning och etanol nederbörd
    1. Tillsätt 200 µL av fenol-kloroform till prover och vortex dem för 1 min. snurra proverna i en mikrocentrifug på ≥16, 100 x g i ≥5 min i rumstemperatur.
      FÖRSIKTIGHET: Fenol-kloroform bör hanteras i dragskåp kemiska med lämplig personlig skyddsutrustning (PPE; dvs, nitrilhandskar, skyddsglasögon eller ansiktsskärm och labbrock med långa ärmar).
    2. Över 320 µL av vattenskiktet (160 µL två gånger med P200 pipett) till en ny standard mikrocentrifug rör (80% av Vattenhaltigt flytande volym).
      Obs: Det är livsviktigt att ta samma volym av vattenlösning mellan prover, annars förlorar analysen kvantitativ noggrannhet.
    3. Förbereda Mix D reagens (tabell 3). Tillsätt 833 µL av Mix D i varje rör. Vortex rören för 5 s, och inkubera rören vid-80 ° C för ≥20 min.
      Obs: Mix D är en blandning av etanol, natriumacetat och glykogen för bekväm etanol utfällning av DNA. Prover kan förvaras vid-80 ° C vid detta steg och protokollet kan återupptas senare.
    4. Centrifugera proverna med en mikrocentrifug på ≥16, 100 x g vid 4 ° C för ≥15 min. Häll av supernatanten och blot en gång på en ren pappershandduk. Sätta ca 500 µL av 70% etanol till varje rör, vortex rören för 5 s och centrifugera rören med en bänkmonterade mikrocentrifug på ≥16, 100 x g vid 4 ° C för ≥ 5 min.
    5. Häll av supernatanten och blot en gång på en ren pappershandduk. Torra pellets vid 65 ° C; pellets kan torkas helt.
      Obs: Använd inte en pipett ta bort överflödig etanol som återstår efter blotting rören. Pellets kan också torkas i rumstemperatur över natten. Protokollet kan pausas här och torkade DNA pellets kan förvaras vid rumstemperatur i flera dagar med tube locket stängt.
  5. Resuspension av virus-DNA i TE buffert
    1. Lös DNA pellets i 120 µL varje TE buffert genom att skaka varje tub för 30 min till 1 tim i rumstemperatur.
  6. Dot blot
    1. Utarbetandet av plasmid DNA standarder
      1. Späd AAV vektor genomet plasmid DNA på 10 ng/µL i vatten eller Tris-HCl buffert (10 mM, pH 8,0). Ta 25 µL av denna utspädning och sammanfattad med en lämplig restriktionsenzym för 1 h till linjär plasmiden DNA, i en reaktionsvolym 50 µL.
        Obs: Vi gör en dubblerad uppsättning matsmältningen (se steg 3.6.4.1). Enzymet lämpliga bör vara en som skär plasmid DNA utanför regionen dot blot sond-bindande. För bekvämlighet, utspädda plasmid DNA kan vara aliquoted (25 µL/rör) och förvaras fryst vid-20 ° C för framtida bruk. Smälta plasmiden DNA medan rören skakar i steg 3.5.1. Inte alltför smälta plasmiden DNA standard.
      2. Tillsätt 450 µL av vatten eller TE till röret som innehåller den smält plasmiden DNA standard och blanda väl. Över 70 µL av denna blandning till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör med 1 330 µL av vatten eller TE att göra en utspädd plasmid standard (25 pg/µL).
      3. Följ tabell 4 för att skapa en uppsättning tvåfaldiga seriella utspädningar (600 µL/rör). Blanda utspädningarna av vortexa för 5 s.
    2. Denaturering av standarder och virala DNA-prover
      1. Lägga till 600 µL av 2 x alkaliska lösning till varje standard utspädning. Blanda väl genom vortexa för 5 till 10 s. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
      2. Tillsätt 120 µL av 2 x alkaliska lösning till varje virala DNA-provet. Blanda väl genom vortexa för 5 till 10 s. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
    3. Ställa in dot blot apparaten
      1. Med sax, klippa ett blotting (t.ex., zeta-probe) membran till lämplig storlek för antalet prover och standarder. Blötlägg membranet med vatten i ca 10 min innan du placerar den på en dot blot apparatur. Täcka oanvända brunnar på membran apparaten.
        Obs: Hantera membranet med ren pincett. För att täcka tomma brunnar, kan ljus blå skydd bladet som kommer med membranet användas. Tillåt inte membranet torka före bindande prover och standarder. För mer information om montering och användning av apparater, hänvisas till användaren manuell19.
      2. Tillsätt vatten till brunnarna som prover kommer att laddas. Tillämpa vakuum och dra vatten genom brunnarna till felkontroll och testa igen när fast. Dra åt skruvarna samtidigt ansöker vakuum för att säkerställa tät försegling.
        Obs: Ofullständig tätning kan orsaka prov läckage mellan brunnarna.
      3. När vatten dras helt igenom, frigör vakuumet helt (dvsvakuum grenröret ska vara öppen för lufttryck).
    4. Lastning standarder och prover på dot blot apparaten
      1. Gälla varje brunn 400 µL av varje utspätt plasmid DNA standard och kör fyra körfält för standard utspädningar. Använda två separata portioner av standard digest och ladda varje i två exemplar. Applicera 200 µL per brunn av varje virala DNA-provet.
        Obs: Använda den återstående ~ 40 µL av denaturerat prover, kan utspädda prover förberedas (t.ex., 10-faldig utspädda prover med 20 µL prov plus 180 µL av 1 x alkaliska lösning) och utplånas om det behövs.
      2. Tillämpa skonsamt vakuum för att dra de DNA-lösningarna genom brunnen.
        Obs: Vakuum trycket behöver justeras genom att delvis öppna en trevägs ventil så att vakuum trycket appliceras till pricken blot apparater liksom atmosfären (dvs.med Avstängningskranen armarna placerade på ett ungefär 45 ° vinkel där det gör en starkare sug buller).
      3. När alla brunnarna har tömt, frigör vakuumet genom att justera de tre-vägs ventilen. Tillsätt 400 µL av 1 x alkaliska lösning till varje brunn som innehöll normer och prover. Vänta 5 min innan du åter använder vakuum för att tömma brunnarna.
      4. Applicera nytt vakuum på samma sätt (se steg 3.6.4.2).
      5. Demontera dot blot apparaten under vakuum, ta bort membranet och skölj den med 2 x SSC. Placera membranet på en ren pappershandduk med DNA-bundna vänd ta bort överflödig 2 x SSC.
      6. UV-crosslink skrynkligt DNA till membranet med en lämplig UV crosslinker; membranet är nu redo för hybridisering.
        Obs: Våta membran kan användas för UV crosslinking. Den torkade, UV-tvärbunden membran kan förvaras vid rumstemperatur. Ytterligare information kan hittas i Tabellen för material.
  7. Hybridisering och tvätt
    1. Värm upp hybridisering bufferten i 65 ° C vattenbad.
    2. Enzymatiskt etikett en DNA sond med radioaktiva α -32P dCTP och rena det med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit enligt tillverkarens rekommendation.
      Obs: Vi använder en sond av 0,5 – 2,0 kb i längd från en förstärkare-promotorn region eller en protein-kodande sekvens i det virala genomet. Även om detta protokoll använder 32P-märkt radioaktiva sonder för signaldetektion, icke-radioaktiva Kemiluminiscens eller fluorescerande sonder kan också användas (se diskussionsavsnittet ).
    3. Placera membranet i en hybridisering flaska med DNA-bundna Sidan upp, skölj membranet med 5 mL föruppvärmd hybridisering buffert och kassera bufferten. Tillsätt 10 mL av förvärmd hybridisering buffert och placera flaskan i en roterande hybridisering ugn inställd på 65 ° C. Rotera i ≥5 min.
    4. Värme-denaturera 20 µL av 10 mg/mL klippt sill eller lax spermier DNA lösning och 32P-märkt sonden (≥107 cpm) för 5 min genom att placera rören på en värme block vid 100 ° C. Sedan snapin-chill dem på is för ≥ 2 min, spin kort, och hålla på is fram till användning.
      Försiktighet: För radioaktiva DNA sonder, 1,5 mL provrör med skruvlock och O-ring måste användas.
    5. Snabbt lägga till de denaturerat spermier DNA och radioaktiva sond till hybridisering bufferten på hybridisering flaska och skaka flaskan för 10 s att blanda. Tillbaka flaskan till 65 ° C ugn och inkubera flaskan med rotation vid 65 ° C för ≥4 h.
    6. När hybridisering är klar, stoppa rotationen, ta bort hybridisering flaskan och sedan Häll över radioaktiva sonden lösningen i en 50 mL konisk tub med en läckagesäker plug tätning cap. Förvara sonden i en lämplig behållare placeras i ett kylskåp som utsetts för radioaktivt material.
      Obs: Används hybridisering buffert med en sond som lagras vid 4 ° C kan återanvändas minst 5 gånger genom att placera 50 mL koniska röret med en läckagesäker plug tätning cap som innehåller hybridisering buffert i 100 ° C vattenbad för 5 min.
    7. Tvätta membranet med tvätta buffert värms upp till 65 ° C. Tillsätt 20-30 mL av tvättlösning till hybridisering flaskan och rotera för 5 min. Upprepa detta tvätta 2 gånger.
      Obs: Mäta radioaktivitet tvätta lösningar och spela in den om så krävs av lokala institute.
    8. När du tvättar membranet, placera en fosfor imaging skärmen på en bild Radergummi för 5 min.
    9. Efter den tredje tvätten, bort membranet från flaskan med hybridisering, ta bort överflödig buffert på membranet med pappershanddukar och placera membranet i en genomskinlig plast pappershållaren. Kontrollera radioaktiva signaler på membranet med en geigermätare. Utsätta skärmen raderas fosfor imaging att membranet i 10 min till över natten beroende på signal intensiteten.
    10. Skanna skärmen med hjälp av en fosfor bild scanning system och få data på signalintensitet för varje punkt.
  8. Analys av data
    1. Rita en standardkurva med kalkylblad och data analys programvara (t.ex., Excel).
      Obs: Log-log linjär regression användes för att rita en standardkurva.
    2. Bestämma nanogram-ekvivalenter (ng-eq) för varje virala DNA prov genom interpolation. Ng-eq är mängden av plasmid DNA används för att rita en standardkurva som motsvarar antalet virala DNA-molekyler. När längden på plasmiden DNA är 8.000 bp, 1 ng-eq enkelsträngat AAV virus-DNA motsvarar 2.275 x 108 partiklar.
      Obs: Ng-eq kan omvandlas till antal viruspartiklar av följande ekvationer:
      Equation 1
      Equation 2
      Antalet AAV partiklar är konventionellt uttryckt som ”vg” (vector genomen) eller ”DRP” (DNAS jag-resistenta partiklar).
    3. Beräkna AAV koncentrationerna av utgångsmaterial. Eftersom skrynkligt virala DNA representerar 66,7% Equation 3 av virala DNA i utgångsmaterialet, 1 ng-eq motsvarar 1,7 x 109 partiklar/mL Equation 4 .
      Obs: Denna korrigering behövs inte om alla virala DNA som finns i utgångsmaterialet är utplånas på ett membran utan förlust (se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat av kvantitativa dot blotting för kvantitering av renat AAV vektor bestånd produceras i stor skala visas i figur 1. Med denna dot blot analys, var antikroppnivåns på en dubbelsträngat AAV2G9-CMV-GFP vektor stock beslutsam. Vektorn renades av två rundor av cesium klorid (CsCl) täthetlutning ultracentrifugering följt av dialys som tidigare beskrivits20. I allmänhet för renat AAV vektor bestånd utsätts tre olika volymer av varje AAV vektor bestånd (t.ex., 0,3 µL, 0.1 µL och 0,03 µL) för dot blot proceduren ovan i två exemplar med en modifiering. DNAS I enzym A används i stället för S. marcescens Amiiiiin i steg 3,2 och ett kommersiellt tillgängliga kit att extrahera och rena virala DNA används i steg 3,4 (se Tabell för material). I exemplet som visas i figur 1var signal intensitetsvärden (godtyckliga unit) som erhålls från varje plasmid DNA standard (figur 1A) plottas mot de kända DNA-kvantiteterna rita en standardkurva (figur 1B), som visar en korrelation koefficienten för 0.998. Använder denna standardkurvan, bestämdes genom interpolation att 0.3, 0.1 och 0,03 µL portioner av AAV2G9 vector visade 1,487 och 1.522 ng-eq (0,3 µL), 0.487 och 0.507 ng-eq (0.1 µL) och 0.158 och 0.171 ng-eq (0,03 µL). Detta gav följande sex värden: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 och 5.700 ng-eq/µL för denna särskilda AAV2G9 vektor stock, leder till ett genomsnitt på 5.16 ± 0,27 ng-eq/µL (genomsnitt ± SD). Eftersom längden av Plasmiden används som standard (pEMBL-CMV-GFP) är 5,848 bp, antikroppnivåns på denna AAV2G9 vector fastställdes vara 8,0 x 1011 vg/mL enligt ekvation 2 i steg 3.8.2. Denna analys upprepas minst två gånger för att avgöra de slutliga titrarna av AAV vektor bestånd.

Representativa resultat av cross-komplettering analyser att bedöma AAP beroendet i VP3 kapsid montering och möjligheten för åtgärdsprogram för att montera VP3 proteiner av heterologa ursprung visas i figur 2. In vitro studier av AAV ofta kräver inte virus rening att göra slutsatser och experiment med orenat virus preparat såsom rå cell lysates och virusinnehållande kultur media är tillräckliga för att ge meningsfulla resultat. I detta experiment bedömdes AAV virus-partikeln produktion från alla möjliga AAV VP3-AAP kombinationer bland AAV5, AAV9 och orm AAV inklusive VP3-no AAP kombinationer av en kvantitativ dot blot analys. De prover som erhållits i en dubblerad uppsättning ett experiment var utplånas på 1 x och 10 x utspädningar (serie A och serie B i figur 2A, respektive). Grafen visas i figur 2B sammanfattar kvantitativ analys av prickar. Resultaten visar att: (1) AAV5VP3 monterar oavsett om AAP var förutsatt i trans, (2) AAP5 och AAP9 kan främja AAV9VP3 kapsid församlingen även om AAP5 fungerar mindre effektivt än AAP9, (3) varken AAP5 eller AAP9 uppvisar en församling att främja aktivitet på orm AAV VP3, och (4) orm AAP främjar endast montering av orm AAV VP3. (1) och (2) är i linje med tidigare observationer6, men unikt specifika AAV VP3-AAP interaktion i Snake AAV är en ny upptäckt i detta experiment. En svaghet i cross-komplettering analysen utifrån kvantitativa dot blot är att den negativa kontrollen visar alltid märkbara nivåer av bakgrunden signaler som inte kan vara helt elimineras. Därför dot blot analysen av sig själv kan inte utesluta möjligheten att kapsid monterar till en nivå under analysens känslighet. I detta avseende bör det noteras att generera de negativa kontrollerna, används ett villkor under vilka AAV virala genomer exponentiellt replikera i avsaknad av kapsid VP3 protein. Sådana negativa kontroller kan genereras av transfecting HEK 293 celler med pAAV-Reporter, pHLP-Rep och pHelper (tabell 2), och används för att minska falska positiva.

DNAS jag har använts som en nuclease i dot blot och qPCR-baserade analyser för AAV kvantitering att ta bort kvarvarande kontrollplasmid-DNA och oförpackade virala arvsmassan som har förorenat AAV preparat. Dessa föroreningar skulle annars leda till en överskattning av titrar; Därför är den nuclease-nedbrytning ett mycket viktigt steg för att exakt kvantifiera virusgenom titrar. DNAS jag enzymer är tillgängliga från olika tillverkare och kommersiella leverantörer; vikten av valet av DNAS I AAV kvantitering tycks dock ha varit undervärderade. För att undersöka hur valet av nuclease kan påverka resultaten av dot blot analysen, jämfördes de följande tre nukleaser för deras förmåga att ta bort bakgrunden signaler från AAV vektor-innehållande kultur media förberedd som beskrivs ovan i steg 2 och 3: DNAS enzym a, DNase I enzymet B och S. marcescens Amiiiiin (Tabell för material). Publicerade studier har använt den tidigare två DNAS jag enzymer13,21,22,23,24 och vi har använt S. marcescens Amiiiiin i tidigare och nuvarande studier. Till vår förvåning identifierades det att DNAS I enzym A är inte alls ett lämpligt val för dot blot analysen med hjälp av virusinnehållande medier i de olika villkor som testas, vilket resulterar i hög bakgrund signaler från den negativa kontrollen, medan DNAS I enzymet B och S. marcescens Amiiiiin effektivt minska bakgrund signalerna med DNAS I enzymet B är ~ 2 gånger effektivare än S. marcescens Amiiiiin (figur 3A, B). DNAS I enzym C konstaterades också vara mycket effektivt för att minska bakgrunden signalerna (inga data anges). Dessa data visar att det finns betydande skillnader i Enzymaktiviteter bland kommersiellt tillgängliga nukleaser när enzymreaktioner utförs i orenat AAV preparat även nuclease-nedbrytning bör vara effektiv när en liten mängden renat viral preps behandlas en optimerad villkor. Således belysa dessa data vikten av rätt val av nuclease i analysen när orenat AAV preparat genomgår en kvantitativ dot blot eller qPCR-analys.

Figure 1
Figur 1: en representativ dot blot analys för att fastställa antikroppnivåns på en CsCl-renat AAV vektor. (A) dubbelsträngat AAV2G9-CMV-GFP vektor producerades i HEK 293 celler av en standard adenovirus-gratis tre plasmid transfection metoden i stor skala, och renas genom två rundor av CsCl gradient ultracentrifugering, följt av dialys. 0,3, 0,1 och 0,03 µL av renat AAV vektor beståndet (utplånas på kolumnen längst till höger) utsattes för kvantitativa dot blot analysen i två exemplar med två uppsättningar av duplicerade plasmid DNA standarder (könssjukdomar). Blot var hybridiseras med en 32P-märkt GFP sond (0,77 kb), och bilden erhölls använder en fosfor bild scanning system. (B) en standardkurvan visar förhållandet mellan kända plasmid DNA kvantiteter (ng-eq, x-axeln) och dot stödnivåer (godtyckliga unit (AU), y-axeln). Siffrorna på y-axeln erhölls med fosfor bilden scanning system. R visar Pearsons korrelationskoefficient. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: AAV VP3-AAP cross-komplettering dot blot assay. Dubbelsträngat AAV-CMV-GFP vektor partikel produktion testades för VP3 proteinerna från AAV5, AAV9 och orm AAV i närvaro eller frånvaro av deras cognate åtgärdsprogram eller i närvaro av åtgärdsprogram heterologa ursprung. (A) analysen utfördes i en biologiskt duplicerade uppsättning experiment (serie A och serie B) med 4 h inkubationstiden med S. marcescens Amiiiiin och AAV vektor titern erhålls från varje kombination bestämdes genom en kvantitativ prick Blot metod som beskrivs i avsnittet protokoll. Varje prick representerar två tredjedelar (5th och 6th raderna, 66,7%) eller två-trettiondelar (7-8 rader, 6,7%) av DNA som återhämtat sig från varje 200 µL av medium som samlats in från proverna eller den negativa kontrollen. Det översta fyra rader (1 till 4 rader) föreställer två uppsättningar av plasmid DNA standarder (STD 1 och STD 2) utplånas i duplikat (dvs, linearized plasmid pEMBL-CMV-GFP, som plasmiden används för dubbelsträngat AAV-CMV-GFP vektor produktion). Dot blot membranet var utforskad med en 32P-märkt GFP sond. Par av punkter anges med rundade rektanglar är negativa kontroller. De översta två raderna (STD 1) ha är från botten av ursprungliga blot men styckats och flyttade till toppen utan att ändra bild intensitet att visa både plasmid-standarder (STD 1 och STD 2) sida vid sida. Denna manipulation indikeras med en svart linje i figuren. (B) Viral titer bestämdes för kombinationer av VP3 och AAP proteiner av dot blot analys. Diagrammet representerar en biologiskt quadruplicated uppsättning data, två från Panel A och två från en annan dot blot som inte visas. Felstaplar visar medelvärde +/-SD (n = 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: en jämförelse av enzymatiska aktiviteter av olika nukleaser i orenat AAV vektor preparat. (A) A kvantitativa dot blot visar effekten av varje nukleotid att eliminera bakgrund signaler. En dubbelsträngat AAV9-CMV-GFP vektor-innehållande förberedelse (”AAV9 vector”) och en ”no-kapsid control” var producerad av HEK 293 cell transfection med plasmid DNAs och utsätts för analysen. Nr-kapsid kontrollen innehöll inte viruspartiklar men innehöll exponentiellt förstärkta oförpackade CMV-GFP vektor genomen. MgCl2 kompletterades på en eller tre gånger de rekommenderade mängderna (6 mM och 18 mM för DNAS I enzym A; och 2,5 mM och 7,5 mM för DNAS I enzymet B) utan att beakta den MgSO 0,8 mM4 finns i medium. För behandling med S. marcescens Amiiiiin testades bara ett tillstånd som beskrivs i avsnittet protokoll. Alla prover behandlades med varje nuclease för 1 h. Dot blot membranet var utforskad med en 32P-märkt GFP sond. Just två kolumner (STD 2) ha är från vänster om den ursprungliga blot men styckats och flyttade till höger utan att ändra bild intensitet att visa både plasmid standarder (STD 1 och STD 2) sida vid sida. Denna manipulation indikeras med en tunn svart linje i figuren. (B) prickar i nr-kapsid kontroll proverna i Panel A är kvantifierade och visas som medelvärde ± | varje värde — medelvärde |. Sju av de 12 prover behandlade med DNAS I enzymet A (anges med en asterisk) visar värden endast något högre än den högsta standarden. Därför ingår de i denna graf för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Serratia marcescens Amiiiiin buffert
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Justera till pH 8,5 med 4 M NaOH.
10 x proteinas K buffert
100 mM Tris-HCl pH 8,0
100 mM EDTA pH 8,0
5% SDS
2 x alkaliska lösning
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175.3 g NaCl
88,2 g natriumcitrat tribasisk (Na3C6H5O7)
Denhardts lösning 100 x (50 mL)
1 g bovint serumalbumin (fraktion V) Obs: Filtrering är kritisk för att ta bort små partiklar som de orsakar bakgrund hybridisering signaler.
1 g Polysucrose 400
1 g polyvinylpyrrolidon
Lös i 20 mL vatten i 55 ° C vattenbad.
Anpassa den slutliga volymen till 50 mL.
Filter-sterilisera med 0,22 μm filter.
Hybridisering buffert
1% SDS Obs: Store hybridisering buffert vid 4 ° C och värmen till 65 ° C i ett vatten bad före användning.
6 x SSC
5 x Denhardts lösning
10 mM Tris-HCl pH 8,0
Tvättbuffert
0,1% SDS
0,1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) lösning (1 mg/mL, 500 mL)
Tillsätt 500 mg PEI i 450 mL vatten och rör om. Obs: För längre lagring,-80 ° C rekommenderas.
Tillsätt koncentrerad HCl för att få pH ner till < 2.0 att upplösa PEI (det kommer att krävas ungefär 800 µL av HCl).
Lägga till 10 M NaOH för att få pH upp till 7.0 (cirka 500 µL 10 M NaOH kommer att krävas).
Justera volymen till 500 mL vatten.
Filter-sterilisera med 0,22 μm filter.
Delprov och förvaras vid-20 ° C.
Fenol-kloroform (1:1 blandning) för kvantitativ dot blotting
Lägg till buffert-mättade fenol (pH 8,0) och kloroform i förhållandet 1:1 i ett 50 mL polypropylen koniska rör. Obs: Den buffert som täcker det organiska lagret, om kvar i röret, kan föras till provrör genom pipettering och kan göra analysen felaktig.
Vortex röret kraftigt för att blanda.
Möjliggöra fasseparation genom centrifugering och ta sedan bort vattenskiktet helt.
Förvaras vid 4 ° C.

Tabell 1: lösning och buffert recept. Recept för lösningar och buffertar som behövs för att slutföra den kvantitativa pricken blot protokoll.

Plasmid AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negativ kontroll (μg) Transfection kontroll (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0,4 0,4
pCMV-flagga-AAPx 0,4
pAAV-Reporter 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
pCMV (tom) 0,4 0,8
pCMV-GFP 2.0
Totalt 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabell 2: Plasmid kombinationer för AAV VP3-AAP cross-komplettering assay utförs i ett 6-well platta format. Kombinationer av Plasmiden DNAs skall användas för HEK 293 cell transfection i varje experimentella gruppen visas. pCMV-AAVx-VP3, en plasmid uttrycker AAV serotyp x (x = 1, 2, 3, etc.) VP3 protein under CMV-IE enhancer-arrangören; pCMV-flagga-AAPx, en plasmid uttrycker AAV serotyp x (x = 1, 2, 3, etc.) AAP protein under CMV-IE enhancer-arrangören; pAAV-Reporter, en plasmid som har två AAV2 inverterad terminal repetitioner (ITRs) och är utformad för rekombinant AAV vektor produktion. pHLP-Rep, en plasmid uttrycker AAV2 Rep protein; pHelper, ett adenovirus helper plasmid; pCMV (tom), en tom plasmid lagt till att styra de experimentella förhållandena; pCMV-GFP, en plasmid som uttrycker en fluorescens markörgen (t.ex., GFP) för att verifiera framgångsrik transfection. Transfections genomförs i 6-bra plattor och använda sammanlagt 2 µg av Plasmiden DNAs.

Blandning A För 10 tuber (μL)
Serratia marcescens Amiiiiin buffert 91,2
0,1 M NaOH 8,8
Totalt 100
Blandning B För 10 tuber (μL)
Serratia marcescens Amiiiiin buffert 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Amiiiiin (250 enheter/μL) 0.176
Totalt 100
Mix C För 10 tuber (μL)
10 x proteinas K buffert 400
Proteinas K (20 mg/mL) 100
H2O 1 300
Totalt 1 800
Mix D För 10 tuber (μL)
100% etanol 8.000
3 M natriumacetat (pH 5.2) 320
Oyster glykogen (20 mg/mL) 10
Totalt 8,330

Tabell 3: lista av master mix reagenser. Blandning A och Mix B används för S. marcescens Amiiiiin behandling i steg 3,2. Dessa två blandningar bör göras separat för att förhindra utfällning av magnesiumhydroxid. Mix C används för proteinas K behandling i steg 3.3. Mix D används för etanol nederbörd i steg 3.4.3. De volymer som anges i tabellen är för huvudmixen reagenser för 10 tuber.

Plasmid DNA standard (ng) Volymer (µL) 25 pg/µL plasmid DNA standardlösning Volymer (µL) vatten Total volym (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1,25 150 450 600
0,625 75 525 600
0.313 37,5 562.5 600
0,156 18,8 581.2 600
0,078 9,4 590,6 600
0,039 4.7 595,3 600

Tabell 4: kvantitativa dot blot plasmid DNA standarder. Nödvändiga volymer 25 pg/µL plasmid DNA standardlösning och vatten eller TE att förbereda plasmid DNA standarder genom tvåfaldiga seriella utspädningar (600 µL/tub) visas. Numren i kolumnen plasmid DNA standard (0,039 till 5 ng) är mängden DNA i 200 µL av varje standardlösning för plasmid-DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna rapport beskrivs nyttan av kvantitativa dot blot analyser att studera AAV åtgärdsprogram och deras roll i kapsid församling. Kunskap från dessa studier kan ge detaljerade insikter om medfödda skillnader håller på att AAV kapsid församling och den funktionella rollen för åtgärdsprogram mellan olika serotyper. I detta avseende AAV VP3-AAP cross-komplettering dot blot analys visade att orm AAV VP3 visas ett strikt beroende på samtidig uttryckt av dess cognate AAP för kapsid montering och att orm AAP inte främja kapsid montering av heterologa serotyperna . Denna observation är spännande eftersom den AAP-beroende AAV serotyp som undersöktes tidigare (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 och 12) alla kan bearbeta församling åtminstone till viss del genom att utnyttja ett heterologt AAP6.

Kvantitativa prick eller slot blot hybridisering är en traditionell metod för kvantifiering av nucleic syror som finns i flera prover samtidigt i ett bekvämt sätt25. Metoden som hade använts för DNA och RNA kvantifiering tills qPCR blev förhärskande i 1990-talet26,27. Även om qPCR har fördelar jämfört med kvantitativa dot blot och andra hybridisering-baserade analyser i denna qPCR uppvisar en högre känslighet och bredare dynamisk räckvidd, bär det också en inneboende risk för exponentiellt utöka fel omedvetet, vilket var fallet för titrar av AAV vektor bestånd bestäms av qPCR13,23. Kvantitativa dot blot analyser ställs enkelt in med en billig kostnad och enkelt utföras så länge forskare har tillgång till en kvantitativ molekylär imaging system som kan få signaler från dot blot membran hybridiseras med antingen en radioaktivt sond eller en icke-radioaktiva Kemiluminiscens eller fluorescerande sond. Även om detta protokoll använder 32P-märkt radioaktiva sonder för signaldetektion, använder andra framgångsrikt icke-radioaktiva DNA sonder direkt märkt med en kommersiellt tillgänglig termostabila alkaliskt fosfatas28. Dot blot analyser använder en enkel princip och analysen i sig utgör inte en teknisk utmaning att artister; resultaten är därför generellt reproducerbara även av oerfarna personer.

Förutom de program som beskrivs här, använder vi rutinmässigt en förenklad och skyndsam version av förfarandet dot blot som semi kvantifiera AAV partiklar snabbt. Fördelarna med dot blot analyser i detta sammanhang är: (1) analysen inte kräver rening eller enzymatisk amplifiering av virala genomer som tar timmar, (2) en kombination av värme och alkaliska denaturering räcker att bryta AAV partiklar i ett prov lösning och release denatureras virala genomer i lösningen som är redo att binda till ett dot blot membran, och (3) förekomst av salt vid höga koncentrationer i prover påverkar inte signifikant test resultaten. Det är exempelvis möjligt att kvantifiera semi AAV partiklar i CsCl-rika lösningar (t.ex., fraktioner erhålls genom CsCl täthetlutning ultracentrifugering) genom att sätta en liten alikvot (≤ 10 µL) av prover i 100 µL av 1 x alkalisk lösning, värme vid 100 ° C för 10 min och blotting på ett membran med eller utan standarder beredda i förväg, följt av en 15 min hybridisering, 3 x 3 min tvättar och exponering för en fosfor imaging skärmen under 15 minuter (eller längre när du använder en sond med minskad radioaktivitet). Hela förfarandet kan slutföras i 1 h när användaren blir bekant med förfarandet. Vi använder denna skyndsam metod, som vi vanligen kallar ”kokande dot blot metod”, för att identifiera AAV partikel-rika CsCl fraktioner under vektor rening bearbeta och ungefär bestämma titrar av renat AAV vektor lager innan du börjar den omfattande processer för vektor karakterisering. Således, även om dot blot analyser kan ses som en omodern metod för att kvantifiera nukleinsyror och har redan ersatts med olika PCR-baserade metoder i ett brett spektrum av vetenskapliga discipliner, finns det fortfarande ett antal fördelar med denna metod som bör gör forskare anser sysselsätter det i sina laboratorier.

Det mest kritiska steget i protokollet är nuclease behandling av prover. Om detta steg inte utförs i optimalt skick, skulle det orsaka hög bakgrund signaler. Vi använder S. marcescens Amiiiiin medan DNAS jag enzymer av olika källor används allmänt i andra laboratorier för virala DNA kvantifiering. Den DNAS I av nötkreatur bukspottkörteln ursprung mest har använts av forskare. Detta beror delvis på nötkreatur bukspottskörteln DNAS jag var först identifieras och mest omfattande karakteriseras biokemiskt29. DNAS jag enzymer för närvarande tillgängliga från kommersiella leverantörer produceras från flera olika biologiska källor såsom Pichia pastoris (DNAS I enzym A), native form renas från nötkreatur bukspottkörteln (t.ex., DNase I enzymet B), och rekombinanta enzymer produceras i antingen en jäst arter eller Escherichia coli (DNAS I enzym C). Vi har funnit att DNAS jag enzymer från alla tre av dessa olika källor har använts i publicerade AAV vektor kvantitering studier; dock att vår kunskap, har ingen av de tidigare studierna undersökt huruvida enzymerna från olika källor är lika effektiva i smälta kontaminerande DNA-molekyler i AAV vektor preparat. Det bör noteras att DNAS jag behandling för AAV vektor analyser utförs ofta under icke-optimerade förhållanden på grund av förekomsten av föroreningar som härrör från odlingsmedium och celler. Iakttagelsen att DNAS I enzym A är endast delvis aktivt i odlingsmediet använde vi har betydande konsekvenser i utforma analysen för AAV vektor kvantitering av dot blot och qPCR, och varnar forskare att problemet tidigare oidentifierade. I detta avseende är S. marcescens Amiiiiin uttryckt i E. coli, en idealisk Amiiiiin inte bara i syfte att tillverka AAV vektorer, men också för AAV vektor kvantifieringsmetoden. Detta beror på att dess enzymatiska aktivitet kan behållas över en rad olika pH-värden och koncentrationer av magnesium joner och monovalenta katjoner. Av denna anledning och eftersom S. marcescens Amiiiiin är cirka 2 gånger billigare än DNAS I enzymet B på grundval av per enhet, vi föredrar att använda S. marcescens Amiiiiin i rutinmässiga kvantitativa dot blot analyser.

Sammanfattningsvis finns kvantitativa dot blot analyser en relativt enkel procedur som lätt kan ge information om förmågan att producera viruspartiklar under varierande förhållanden. Jämfört med alternativa patientserumprov tillvägagångssätt, såsom qPCR, kräver detta tillvägagångssätt liten, om någon, optimering. Det kan även appliceras lätt med vektorer av någon serotyp och kan användas till titer både singel - och dubbelsträngat vektorer utan att ändra protokollet. Efter transfections och skörd av AAV vektor-innehållande prover (odlingsmedium och/eller celler), kan hela protokollet fyllas i en dag, således snabbt svara på frågor om förmågan att producera viruspartiklar från olika villkor, inklusive olika kombinationer av AAV VP3 och AAP proteiner. Kvantitativa dot blotting erbjuder en ändamålsenlig metod för att hantera olika obesvarade frågor om VP-AAP interaktioner och deras roller i kapsid församling i en mängd olika AAV serotyper och isolat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Xiao Xiao vid University of North Carolina at Chapel Hill för att förse oss med pEMBL-CMV-GFP Plasmiden. Vi tackar Christopher Cheng och Samuel J. Huang för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av Public Health Service beviljar (NIH R01 NS088399 och T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Biologi fråga 136 Adeno-associerade virus (AAV) montering-aktiverande protein (AAP) cross-komplettering kvantitativa dot blot analys viral titer genterapi
En kvantitativ Dot Blot analys för AAV titrering och dess användning för funktionell bedömning av den Adeno-associerade Virus församling-aktiverande protein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter