Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ Dot skamplet Assay for AAV titrering og dets anvendelse til funktionel vurdering af Adeno-associeret Virus forsamling-aktivering proteiner

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Dette manuskript detaljer en ligetil dot skamplet assay til kvantitering af adeno-associeret virus (AAV) titers og dens anvendelse til at studere rolle aktivering af forsamling proteiner (AAPs), en roman klasse af ikke-strukturelle virale proteiner, der findes i alle AAV serotyper, fremme samling af capsids stammer fra beslægtet og heterolog AAV serotyper.

Abstract

Mens adeno-associeret virus (AAV) er bredt accepteret som en attraktiv vektor for genterapi, fungerer det også som en model virus for at forstå virus biologi. I sidstnævnte henseende, har den nylige opdagelse af en ikke-strukturelle AAV protein, kaldes forsamling-aktivering protein (AAP), kaste nyt lys over de processer, der er involveret i montage af viral kapsid VP proteiner i en kapsid. Selvom mange AAV serotyper kræver AAP for forsamlingen, har vi for nylig rapporteret, at AAV4, 5, og 11 er undtagelser fra denne regel. Vi viste desuden, at AAPs og samlet capsids af forskellige serotyper lokalisere til forskellige subcellulært rum. Denne uventede heterogenitet i de biologiske egenskaber og funktionelle roller for AAPs blandt forskellige AAV serotyperne understreger betydningen af undersøgelser på AAPs stammer fra forskellige serotyper. Dette manuskript detaljer en ligetil dot skamplet assay for AAV kvantitering og dens anvendelse til at vurdere AAP afhængighed og serotype specificitet i kapsid forsamling. For at påvise nytten af denne dot skamplet assay, satte vi sig for at karakterisere kapsid forsamling og AAP afhængighed af slange AAV, en tidligere uncharacterized krybdyr AAV, samt AAV5 og AAV9, som har tidligere vist sig at være AAP-uafhængig og AAP-afhængige serotyperne, henholdsvis. Analysen viste, at slangen AAV kapsid forsamling kræver slange AAP og ikke kan fremmes ved AAPs fra AAV5 og AAV9. Analysen viste også, at i modsætning til mange af de fælles serotype AAPs, der fremmer heterolog kapsid forsamling af cross-komplementering, slange AAP ikke fremmer forsamling af AAV9 capsids. Derudover viser vi, at valget af nukleasen væsentligt påvirker udlæsning af dot skamplet assay, og således, at vælge en optimal enzym er afgørende for vellykket vurdering af AAV titers.

Introduction

Adeno-associeret virus (AAV) er en lille, ikke-kappebærende, enkeltstrenget DNA virus med en genom af ca 4,7 kilobases (kb). AAV genom indeholder åbne læserammer (ORFs) for rep og cap generne. I 2010, blev en tidligere uidentificerede nonstructural protein kodet af et + 1 frame-skiftet ORF i AAV2 cap genet opdaget af Sonntag et al. og fundet for at spille en afgørende rolle i forsamlingen af AAV2 kapsid VP monomer proteiner i en viral kapsid1. Denne roman protein er blevet udnævnt forsamling-aktivering protein (AAP) efter den rolle, det spiller i fremme af kapsid forsamling1.

ORFs for AAP har været identificeret bioinformatically i genomer af alle parvoviruses inden for slægten Dependoparvovirus, men ikke i genomer af vira af forskellige slægter af parvovirus familie1,2. Funktionelle studier af denne roman protein var oprindeligt fokuseret på AAP fra prototype AAV2 (AAP2), som har etableret AAP2 afgørende rolle i at målrette usamlet VP proteiner til nucleolus for deres ophobning og dannelse i fuldt samlet capsids1,3,4. AAV2 capsids manglende evne til at samle i mangel af AAP udtryk har været uafhængigt bekræftet af flere grupper, herunder vores1,2,3,4,5 . Efterfølgende studier på AAV serotyper 1, 8 og 9 praktikanttid AAPs kritiske rolle i kapsid forsamling, som VP3 monomer proteiner af AAV1, 8 og 9 ikke var i stand til at danne en færdigsamlet kapsid i mangel af fælles udtryk af AAP2.

For nylig, gennem strategier, der omfatter anvendelse af kvantitative dot duppes assays, vi undersøgt AAV1 evne til 12 VP3 monomerer til at samle ind i capsids i mangel af AAP udtryk og mulighed for AAP1 til 12 for at fremme montering af VP3 monomerer fra heterolog serotyper. Denne undersøgelse har vist, at AAV4, 5 og 11 VP3 monomerer kan samle uden AAP. Desuden blev det konstateret, at otte ud af de tolv AAP serotyper vi undersøgt (dvs.alle undtagen AAP4, 5, 11 og 12) vises en bred evnen til at understøtte kapsid forsamling af heterolog AAV serotype capsids, mens AAP4, 5, 11 og 12 vises et væsentligt begrænsede evne i denne henseende6. Disse fire serotyper er Fylogenetisk fjernt fra de andre AAP serotyper2,3. Derudover har undersøgelsen afdækket signifikant heterogenitet i subcellulært lokaliseringer af forskellige AAPs6. Desuden undersøgelsen har foreslået, at den stramme sammenslutning af AAP med samlet capsids og nucleolus, kendetegnende for AAV2 kapsid forsamling, nødvendigvis ikke kan udvides til andre serotyper, herunder AAV5, 8 og 9, som viser nucleolar udelukkelse af samlet capsids6. De oplysninger fra studiet af nogen bestemt serotype AAP er således, ikke generelt gælder for alle AAP biologi. Så gådefuldt karakter af AAP biologi understreger behovet for at undersøge den rolle og funktion af hver AAP fra canonical og ikke-kanoniske AAV serotyper.

AAP biologiske rolle i kapsid forsamling kan vurderes ved at bestemme fuldt pakket AAV viral partikel titers produceret i menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, de mest almindeligt anvendte cellelinie for AAV vektor produktion, med eller uden AAP protein udtryk. Standardmetoder for AAV kvantitering er kvantitativ PCR (qPCR)-baseret assays7,8 og kvantitative dot skamplet-baserede undersøgelser vedrørende9. Andre metoder til AAV viral partikel kvantitering som enzymmaerket assay10,11 eller optisk tæthed måling12 er ikke ideel til prøverne stammer fra mange forskellige AAV serotyper eller prøver forurenet med urenheder (rå lysates eller kultur medier), som ofte prøver anvendes til AAV forskning. I øjeblikket, er qPCR mest udbredt for AAV kvantitering; Det er imidlertid nødvendigt at anerkende potentielle forbehold af qPCR-baseret analysen, som analysen kan resultere i systemisk fejl og væsentlig titer variationer13,14. PCR-baserede analyser er påvirket af en række potentielt forstyrrende faktorer, såsom tilstedeværelsen af kovalent lukkede terminal Hårnåle i PCR-skabeloner, der hæmmer forstærkning13. Selv en erfaren person kan indføre potentiale konfunderende faktorer i en qPCR-baserede assay ubevidst13. Derimod er kvantitative dot skamplet assays en klassisk Molekylærbiologi teknik, der involverer ikke genom forstærkning og bruger en meget enklere princippet med en minimal risiko for fejl i forhold til qPCR-baserede assays. Metoden er mindre teknisk udfordrende; Derfor er assay resultater rimeligt reproducerbare selv af uerfarne personer.

I denne betænkning beskriver vi de metodologiske oplysninger om en kvantitativ dot skamplet assay vi rutinemæssigt brug for AAV vektor kvantitering og Giv et eksempel på, hvordan at anvende assay for at studere rollen forsamling-fremme af AAPs fælles serotyperne (AAV5 og AAV9) og et tidligere uncharacterized AAP fra Snake AAV14. I naturen, AAV VP proteiner og AAP proteiner er udtrykt i cis fra et enkelt gen (dvs., VP-AAP cis-komplementering), mens i analysen beskrives her, VP og AAP proteiner leveres i trans fra to separate plasmider (dvs., VP-AAP Trans-komplementering). Da hver VP eller AAP protein fra forskellige serotyper kan udtrykkes fra hver uafhængig plasmid, bliver det muligt at teste heterolog VP-AAP kombinationer for kapsid Forsamling (dvs., VP-AAP cross-komplementering). Kort, AAV VP3 fra forskellige serotyper udtrykkes i HEK 293 celler af plasmid DNA Transfektion til at pakke en AAV vektor genom i tilstedeværelse eller fravær af den beslægtet serotype AAP, eller i nærværelse af en heterolog serotype AAP. Efter produktion, dyrkningsmedier og cellelysater bliver underkastet en dot skamplet analyse til kvantificering af det virale genom i kapsid shell. Det første trin i dot skamplet assay er at behandle prøver med en nukleasen fjerne forurenende plasmid DNAs og uemballerede AAV genomer i prøver. Undladelse af at gøre det ville øge baggrunden signaler navnlig når urenset prøver er analyseret. Dette efterfølges af en protease behandling at bryde viral capsids og frigive nukleasen-resistente viral genomer i stikprøven løsninger. Næste, viral genomer er denatureret, renset på en membran og hybridiseret med en virale genom-specifikke DNA-sonder til kvantitering. I eksempel assay rapporteret her, vise vi at slange AAV VP3 kræver slange AAP for kapsid forsamling og slange AAP ikke fremmer forsamlingen af AAV9 capsids i modsætning til mange af AAPs stammer fra AAP-afhængige serotyper, der også kan fremme samling af heterolog serotype capsids. Endelig, vi rapporterer en vigtig advarsel til qPCR eller dot skamplet-baserede AAV kvantitering-undersøgelser, at valget af nukleasen væsentligt påvirker assay resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Opskrifter til løsninger og buffere behov for denne protokol er fastsat i tabel 1. Protokollen beskrevet nedenfor er for VP-AAP cross-komplementering dot skamplet analysen at studere roller af AAP proteiner i kapsid forsamling. Metoden til at mere generiske kvantitative dot skamplet assay for renset AAV vektor titrering er forklaret i afsnittet Repræsentant resultater .

1. opførelse af VP3, AAP og AAV2 Rep udtrykker plasmider

  1. Opførelse af pCMV-AAVx-VP3 (x = serotyper)
    1. PCR-Forstærk hele VP3 ORF (1.6 kb) ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase og følgende primer parret: VP3 fremad, CTAA-RE1-CACC-N25 (de første 25 nukleotider af VP3 ORF); VP3 omvendt, TCTT-RE2-N25 (de sidste 25 nukleotider af VP3 ORF).
      Bemærk: RE1 og RE2 er steder for restriktionsenzymer (REs) for kloning. CTAA og TCTT er terminal 5' og 3' tetranucleotide føjet til lette begrænsning enzym fordøjelsen nær slutningen af dobbelt-strenget DNA. CACC er en Kozak konsensus sekvens.
    2. Klon RE-digested PCR-produkter mellem de tilsvarende RE lokaliteter af et pattedyr udtryk vektor, som bruger menneskelige cytomegalovirus straks tidlig (CMV-IE) forstærker-fortaler for højtstående udtryk.
      Bemærk: For Molekylær kloning, fordøje 5 µg rygraden plasmid DNA med en restriction enzyme(s) i en koncentration på 4 U/µg DNA i 1 time på en optimal temperatur. For PCR fragmenter, øge enheder af enzymer anvendes (f.eks.10 U/µg 1.6 kb VP3 ORF PCR produkt) og en længere Inkubationstiden (f.eks.4 h) skyldes en stigning i antallet af begrænsning enzym genkendelsessekvenser pr. enhed længde. Nyttige oplysninger i Molekylærbiologi enzymer og kloning procedurer herunder bakteriel omdannelse kan findes andetsteds15,16,17.
  2. Opførelse af pCMV-FLAG-AAPx (x = serotyper)
    1. PCR-Forstærk hele AAP ORF (0,6 kb) med undtagelse af den første aminosyre ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase og følgende primer parret: AAP fremad, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (de 25 nukleotider fra den 4. nukleotid i den AAP ORF); AAP omvendt, TCTT-RE2-N25 (de sidste 25 nukleotider af AAP ORF).
      Bemærk: GACTACAAGGACGACGATGACAAA koder en FLAG-tag, som har vist sig at have nogen skadelige virkninger4,5 , men kan udelades, hvis unødvendig.
    2. Klon RE-digested PCR-produkter mellem de tilsvarende steder, hvor pattedyr udtryk vektor med CMV-IE enhancer-promotor15,16,17.
  3. Opførelse af pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg for pAAV-RC2 plasmid (7,3 kb) med 20 enheder af Xho jeg og Xcm jeg, og rense DNA ved hjælp af en kommerciel DNA rensning kit eller ved phenol-chloroform ekstraktion.
      Bemærk: Fjernelse af 1,8 kb Xho jeg-Xcm jeg fragment fra 7.3 kb pAAV-RC2 plasmid resulterer i et tab af kapsid VP protein udtryk samtidig bevare Rep protein udtryk.
    2. Stump DNA ender med 6 enheder af T4 DNA Polymerase, Agarosen gel-rense 5.5 kb DNA fragmenter, og selv ligate renset fragmentet bruger 50 til 100 ng af DNA og 400 enheder af T4 DNA ligase ifølge producentens henstilling15.
    3. Følg proceduren standard bakteriel omdannelse henvises til i trin 1.1.2 Note.
  4. Kontrollere plasmidet konstruktioner af begrænsning enzym fordøjelse og sekventering15,18.
  5. Udføre plasmidet minipreps eller maxipreps ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits til at opnå en tilstrækkelig mængde af plasmid DNA for downstream AAV produktion eksperimenter.

2. produktion af AAV i HEK 293 celler af Plasmid DNA Transfektion (Cross-komplementering Assay)

  1. Kultur HEK 293 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM)-høje glukose (4,5 g/L) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 1% Penicillin & Streptomycin Mix, og 1 mM L-glutamin, i et 37 ° C kuvøse med 5% kuldioxid (CO2).
    Bemærk: AAV titers variere betydeligt afhængigt af kilden til HEK 293 celler.
    Forsigtig: Selvom AAV kan håndteres på biosikkerhed på niveau 1 (BSL1) indeslutning, BSL2 indeslutning anbefales til HEK 293 celle arbejde.
  2. På dag -1 (24 h før Transfektion), plade 6 – 7 x 105 HEK 293 celler/brønd i 2 mL af den fuldstændige medium beskrevet i trin 2.1 i en 6-godt skilte. Dette generelt opnår ~ 90% confluency den næste dag.
  3. Dag 0: Transfektion
    1. Forberedelse til DNA Transfektion
      1. Kontroller, at cellerne har nået ~ 90% confluency.
      2. Varm op DMEM suppleret med 1% Penicillin og Streptomycin Mix og 1 mM L-glutamin, men uden 10% FBS (dvs.serumfrit medium) i et 37 ° C vandbad.
      3. Tillad polyethylenimine (PEI) løsningen at nå stuetemperatur.
    2. Forberedelse af plasmid DNA blanding
      1. Bland plasmider i 96 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden CaCl2 eller MgCl2 i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør, som angivet i tabel 2. Det samlede beløb af DNA er 2 µg/godt.
        Bemærk: Diskenheder for plasmid DNA løsning kan tilsidesættes, hvis de er nominelle. Volumen indstilling anbefales, hvis den samlede mængde af plasmid DNA løsninger er ≥10 µL.
    3. PEI Transfektion
      1. Tilføj 4 µL af PEI løsning (1 mg/mL) til PBS-plasmid DNA mix (forberedt som ovenfor). Den endelige rumfang er ca 100 µL (5% volumen af næringssubstratet). Vortex rør kort og inkuberes DNA: PEI blanding i 15 min. ved stuetemperatur.
      2. Mens vi venter 15 min inkubation at fuldføre, erstatte næringssubstratet med forvarmet serumfrit medium beskrevet taktfast 2.3.1.2.
      3. Når den 15-min inkubation af DNA: PEI blanding er færdig, kort spin rør med en microcentrifuge til at indsamle flydende til bunden af rørene, og tilføje DNA: PEI blandingen dråbevis til næringssubstratet i hver brønd af HEK 293 kultur plade. Forsigtigt agitere pladerne og returnere dem til 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
      4. Opretholde cellerne i dette Transfektion medium indtil høst på dag 5 (ingen medium ændring er påkrævet).
  4. På dag 1 og dag 2, observere celler transfekteret med pCMV-NGL plasmid under en inverteret fluorescens mikroskop til at vurdere Transfektion effektivitet.
    Bemærk: til fluorescens mikroskopi, her en 10 X / 0,25 numerisk blænde mål i kombination med en 10 × okular blev brugt, og 450-490 nm excitation bandpass filter og 515-565 nm båndpasfilter emission blev ansat. Denne betingelse giver normalt mere end 70% Transfektion effektivitet. Celler kan udstille nogle morfologiske ændringer (fx celler er blevet slank) på grund af den serumfrit tilstand.
  5. På dage 3 – 5, fortsat kultur de transfected celler i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
  6. På dag 5, Saml både celler og virus-holdige medium ind 15 mL polypropylen koniske rør af pipettering op og ned eller ved at skrabe med en celle skraber.
  7. Gemme prøver på-80 ° C indtil brug.

3. prik skamplet Assay for AAV kvantitering

  1. Inddrivelse af virale partikler
    1. Hurtigt optø frosne rør i et 37 ° C vandbad. Vortex rør kraftigt i 1 min til at maksimere genvinding af AAV fra celler.
    2. Pellet celle debris ved centrifugering ved 3.700 x g ved 4 ° C i 10 min. Tage 200 µL af supernatanten fra hver tube og overføre det ind i en mærket microcentrifuge rør med en dot skamplet assay skruelåg.
      Bemærk: Alikvot resterende supernatanten i microcentrifuge rør og gemme dem frosset ved-80 ° C til fremtidig brug. Her, polypropylen microcentrifuge rør forbundet med skruelåg og en O-ring blev brugt. Stram forsegling er påkrævet for at undgå udslip af AAV og phenol-chloroform.
  2. Behandling med Serratia marcescens liv1975
    1. Forberede blanding A og Mix B reagenser (tabel 3). Tilsæt 10 µL af blanding A og 10 µL af Mix B ind i hvert rør. Vortex rør for 5 s, kort spin rør til at indsamle flydende til bunden af rør og inkuberes rør ved 37 ° C i mindst 1 h.
      Bemærk: Mix A indeholder NaOH og optimerer pH behandling med S. marcescens liv1975. Mix B supplerer magnesium. Koncentrationen af S. marcescens liv1975 i kommercielt tilgængelige enzym bestande kan variere. Volumen af S. marcescens liv1975 skal justeres i overensstemmelse hermed for at gøre 200 U/mL efter tilsætning blanding A og Mix B i rør i trin 3.2.1.
      Bemærk: En længere inkubationstiden, op til 4 h, kan mindske baggrund signaler.
    2. For enden af inkubation spin kort rør med en benchtop centrifuge at indsamle kondens og løsning fra toppen og siderne af rørene.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøverne kan opbevares frosset ved-20 ° C eller-80 ° C.
  3. Proteinase K behandling
    1. Forberede blanding C reagens (tabel 3). Tilføj 180 µL af blanding C i hvert rør. Vortex rør for 5 s, kort spin rør og inkuberes rør ved 55 ° C i 1 time.
      Bemærk: EDTA i Mix C reagens chelaterer gratis magnesiumioner og inaktiverer S. marcescens liv1975.
    2. For enden af inkubation tillade prøver at nå stuetemperatur og kortvarigt spin rør med en benchtop centrifuge at indsamle kondens og løsning fra toppen og siderne af rørene.
      Bemærk: Protokollen kan pause her. Prøverne kan opbevares frosset ved-20 ° C eller-80 ° C. For at genoptage protokollen, der inkuberes rør ved 55 ° C i 5-10 min til at opløse SDS krystaller indeholdt i bufferen helt.
  4. Phenol-chloroform udvinding og ethanol fældning
    1. Tilføje 200 µL af phenol-chloroform til prøver og vortex dem i 1 min. Spin prøver i en microcentrifuge på ≥16, 100 x g for ≥5 min ved stuetemperatur.
      Forsigtig: Phenol-chloroform bør håndteres i en kemisk stinkskab med passende personlige værnemidler (PV; dvs., nitrilhandsker, beskyttelsesbriller eller ansigtsskærm og laboratoriekittel med lange ærmer).
    2. Overføre 320 µL af den vandige lag (160 µL to gange med P200 pipette) til en ny standard microcentrifuge tube (80% for vandige væske volumen).
      Bemærk: Det er meget vigtigt at tage den samme rumfang vandig opløsning mellem prøver, ellers analysen mister kvantitative nøjagtighed.
    3. Forberede Mix D reagens (tabel 3). Tilføje 833 µL af D-Mix i hver tube. Vortex rør for 5 s, og Inkuber rør ved-80 ° C i ≥20 min.
      Bemærk: Mix D er en blanding af ethanol, natriumacetat og glykogen praktisk ethanol fældningen af DNA. Prøver kan opbevares ved-80 ° C på dette trin og protokollen kan genoptages senere.
    4. Centrifuge prøver med en microcentrifuge på ≥16, 100 x g ved 4 ° C for ≥15 min. Hæld supernatanten og duppes engang på et rent stykke køkkenrulle. Sat ca 500 µL af 70% ethanol i hver tube, vortex rør for 5 s, og der centrifugeres rør med en benchtop microcentrifuge på ≥16, 100 x g ved 4 ° C for ≥5 min.
    5. Hæld supernatanten og duppes engang på et rent stykke køkkenrulle. Tør pellets ved 65 ° C; pellets kan være tørret helt.
      Bemærk: Brug ikke en pipette til at fjerne overskydende ethanol, der er tilbage efter blotting rør. Pellets kan også tørres ved stuetemperatur natten over. Protokollen kan stå i pause her og tørrede DNA pellets kan opbevares ved stuetemperatur i flere dage med tube låget lukket.
  5. Ophvirvling af viral DNA i TE buffer
    1. Opløse DNA pellets i 120 µL af TE buffer ved omrystning hver tube for 30 min til 1 time ved stuetemperatur.
  6. Dot skamplet
    1. Forberedelse af plasmid DNA standarder
      1. Fortynd AAV vektor genom plasmid DNA til 10 ng/µL vand eller Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,0). Tage 25 µL af denne fortynding og fordøje med en passende begrænsning enzym til 1 h til linearize plasmid DNA, i en reaktion volumen af 50 µL.
        Bemærk: Vi laver en duplikeret sæt af fordøjelsen (Se trin 3.6.4.1). Den passende enzym bør være en, der skærer plasmid DNA uden for regionen dot skamplet sonde-bindende. For nemheds skyld, fortyndede plasmid DNA kan være aliquoted (25 µL/tube) og opbevares frosset ved-20 ° C til fremtidig brug. Fordøje plasmid DNA, mens rør ryster i trin 3.5.1. Ikke over fordøje plasmid DNA standard.
      2. Tilføje 450 µL vand eller TE at tuben indeholder den fordøjede plasmid DNA standard og blandes grundigt. Overføre 70 µL af denne blanding til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube med 1.330 µL vand eller TE til at gøre en fortyndet plasmid standard (25 pg/µL).
      3. Følg tabel 4 for at oprette et sæt af to-fold serielle fortyndinger (600 µL/tube). Bland Fortyndingerne grundigt af vortexing for 5 s.
    2. Denaturering af standarder og viral DNA-prøver
      1. Tilføje 600 µL af 2 x basisk opløsning til hver standard fortynding. Bland godt ved vortexing for 5-10 s. Incubate ved stuetemperatur i 10 min.
      2. Tilføje 120 µL af 2 x basisk opløsning til hver viral DNA-prøve. Bland godt ved vortexing for 5-10 s. Incubate ved stuetemperatur i 10 min.
    3. Opsætning af dot skamplet apparater
      1. Brug saks, skåret en blotting (fx, zeta-sonde) membran til en passende størrelse for antallet af prøver og standarder. Blød membran med vand i 10 min før du placerer det på en prik skamplet apparater. Dække ubenyttede brønde på apparatet membran.
        Bemærk: Håndtere membranen med en ren pincet. For at dække Tom wells, kan lys blå beskyttelse ark, der kommer med membranen bruges. Tillad ikke membran tørre før bindende prøver og standarder. For flere detaljer om montering og anvendelse af apparatet, henvises til brugeren manuel19.
      2. Tilsæt vand brønde som prøver vil blive indlæst. Anvende vakuum og trækker vand gennem wells til at kontrollere for fejl og retest når fast. Spænd skruerne mens anvender vakuum for at sikre tæt forsegling.
        Bemærk: Ufuldstændige forsegling kan forårsage prøve lækage mellem brøndene.
      3. Når vandet er helt trukket igennem, frigive vakuum helt (dvs.den vakuum manifold bør være åben for lufttryk).
    4. Indlæsning af standarder og prøver til dot skamplet apparater
      1. Anvende 400 µL af hver fortyndet plasmid DNA standard til hver brønd, og køre fire baner af standard fortyndinger. Bruge to separate delprøver af den standard digest og belastning hver i to eksemplarer. Anvende 200 µL/brønd af hver viral DNA-prøve.
        Bemærk: Ved hjælp af de resterende ~ 40 µL af denatureret prøver, kan fortyndede prøver blive forberedt (f.eks.10-fold fortyndede prøver ved hjælp af 20 µL af prøven plus 180 µL 1 x basisk opløsning) og renset hvis nødvendigt.
      2. Anvende blid vakuum til at trække DNA løsninger gennem godt.
        Bemærk: Vakuum pres skal justeres ved delvis åbne en tre-vejs ventil, så det vakuum trykket er anvendt til prik duppes apparater samt atmosfæren (dvs.med stophane armene placeret på en cirka 45 ° vinkel hvor det gør en højere suge støj).
      3. Når alle brøndene har tømt, frigive tomrummet ved at justere de tre-vejs ventil. Tilsæt 400 µL 1 x basisk opløsning til hver brønd, der indeholdt standarder og prøver. Vente på 5 min før re-anvender vakuum for at tømme brøndene.
      4. Re-andrage vakuum på samme måde (Se trin 3.6.4.2).
      5. Adskille dot skamplet apparatet under vakuum, fjerne membranen og skyl det med 2 x SSC. Placer membranen på et rent stykke køkkenrulle med DNA-bundet side opad til at fjerne overskydende 2 x SSC.
      6. UV-bitmapgenkendelse duppes DNA til membran med en passende UV crosslinker; membranen er nu klar til hybridisering.
        Bemærk: Våd membraner kan bruges til UV crosslinking. Den tørrede, UV-crosslinked membraner kan opbevares ved stuetemperatur. Yderligere oplysninger kan findes i Tabel af materialer.
  7. Hybridisering og vask
    1. Varm op hybridisering Buffer i en 65 ° C vandbad.
    2. Enzymatisk mærke en DNA-sonder med radioaktivt α -32P dCTP og rense det ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits ifølge producentens anbefaling.
      Bemærk: Vi bruger en sonde af 0,5-2,0 kb i længde fra en forstærker-promotor-regionen eller en protein-kodende sekvens i det virale genom. Selv om denne protokol udnytter 32P-mærket radioaktiv sonder til signal detection, ikke-radioaktive kemiluminescens eller fluorescerende sonder kan også bruges (der henvises til afsnittet diskussion ).
    3. Placer membranen i en hybridisering flaske med DNA-bundet side op, skyl membran med 5 mL forvarmet hybridisering Buffer, og kassér bufferen. Derefter tilsættes 10 mL af forvarmet hybridisering Buffer og placere flasken i en roterende hybridisering ovn indstillet til 65 ° C. Rotere ≥5 min.
    4. Varme-denaturere 20 µL af 10 mg/mL forskydes sild eller laks sæd DNA løsning og 32P-mærket sonden (≥107 cpm) for 5 min ved at placere rør på en varme blok sæt ved 100 ° C. Derefter snap-chill dem i isbad i ≥2 min, spin kortvarigt, og holde på køl indtil brug.
      Forsigtig: Radioaktivt DNA-sonder, 1,5 mL rør med skruelåg og O-ring skal anvendes.
    5. Hurtigt tilføje denatureret sæd DNA og radioaktive sonde til hybridisering Buffer i hybridisering flaske og Ryst flasken for 10 s at blande. Vende flasken til 65 ºC ovn og inkuberes flaske med rotation på 65 ° C i ≥4 h.
    6. Når hybridisering er færdig, stoppe rotationen, fjerne hybridisering flasken og derefter hælde den radioaktive sonde løsning i en 50 mL konisk slange med en tætte stik seal cap. Opbevar sonden i en passende beholder placeret i køleskab udpeget af radioaktivt materiale.
      Bemærk: Brugte hybridisering Buffer med en sonde, der opbevares ved 4 ° C kan genbruges mindst 5 gange ved at placere 50 mL konisk slange med en tætte stik seal cap, der indeholder hybridisering Buffer i en 100 ° C vandbad i 5 min.
    7. Vaske membranen med vaske Buffer opvarmes til 65 ° C. Tilsættes 20 til 30 mL Wash Buffer til hybridisering flasken og rotere i 5 min. Gentag dette vaske 2 gange.
      Bemærk: Måle radioaktivitet af vask løsninger og optage det, hvis det kræves af den lokale institute.
    8. Mens vaske membranen, placere en fosfor imaging skærmen på viskelæder billede i 5 min.
    9. Efter den tredje vask, fjerne membranen fra hybridisering flaske, fjerne overskydende buffer på membran med papirservietter og placere membranen i en klar plast papirholderen. Kontrollere radioaktive signaler på membranen ved hjælp af en geigertæller. Udsætte slettes fosfor imaging skærmen for at membran for 10 min at overnatte afhængigt af signal intensitet.
    10. Scan skærmen med en fosfor billede scanning system og indhente oplysninger om signal intensiteten af hver prik.
  8. Dataanalyse
    1. Tegne en standardkurve ved hjælp af regneark og data analyse software (fxExcel).
      Bemærk: Log-log lineær regression blev brugt til at tegne en standardkurve.
    2. Bestemme nanogram-ækvivalent (ng-eq) for hvert af de virale DNA-prøver ved interpolation. Ng-eq er mængden af plasmid DNA bruges til at tegne en standardkurve, der svarer til antallet af viral DNA molekyler. Når længden af plasmid DNA er 8.000 bp, 1 ng-eq enkeltstrenget AAV viral DNA svarer til 2.275 x 108 partikler.
      Bemærk: Ng-eq kan konverteres til antallet af viruspartikler af følgende ligninger:
      Equation 1
      Equation 2
      Antallet af partikler, AAV udtrykkes konventionelt som "vg" (vektor genomer) eller "DRP" (DNase jeg-resistente partikler).
    3. Beregne AAV koncentrationer af udgangsmaterialer. Fordi duppes viral DNA repræsenterer 66,7% Equation 3 af det virale DNA i udgangsmaterialer, 1 ng-eq svarer til 1,7 x 109 partikler/mL Equation 4 .
      Bemærk: Denne korrektion er ikke nødvendig, hvis alle viral DNA indeholdt i udgangsmaterialet er renset på en membran uden tab (Se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et repræsentativt resultat af kvantitative dot blotting til kvantitering af renset AAV vektor bestande produceres i stor målestok er vist i figur 1. Med denne dot skamplet assay, blev titer af en dobbelt-strenget AAV2G9-CMV-NGL vektor bestand fastsat. Vektoren blev renset af to runder af caesiumchloridoploesning (CsCl) densitet-gradient ultracentrifugering efterfulgt af dialyse som tidligere beskrevet20. Generelt for renset AAV vektor bestande, er tre forskellige mængder af hver AAV vektor bestand (fx, 0,3 µL, 0,1 µL og 0,03 µL) udsat for dot skamplet proceduren beskrevet ovenfor i to eksemplarer med en ændring. DNase I enzym A bruges i stedet for S. marcescens liv1975 taktfast 3.2, og et kommercielt tilgængeligt kit til at udtrække og rense viral DNA bruges i trin 3.4 (Se Tabel af materialer). I eksemplet vist i figur 1, blev signal intensitetsværdierne (vilkårlig enhed) fra hver plasmid DNA standard (figur 1A) plottes i de kendte DNA mængder til at tegne en standardkurve (figur 1B), viser en korrelation koefficient af 0.998. Brug denne standardkurven, var det bestemmes ved interpolation at 0.3, 0,1 og 0,03 µL delprøver af AAV2G9 vektor viste 1.487 og 1.522 ng-eq (0,3 µL), 0.487 og 0.507 ng-eq (0,1 µL) og 0.158 og 0.171 ng-eq (0,03 µL). Dette gav følgende seks værdier: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 og 5.700 ng-eq/µL for denne særlige AAV2G9 vektor stock, fører til et gennemsnit på 5.16 ± 0,27 ng-eq/µL (gennemsnit ± SD). Da længden af plasmid anvendes som standard (pEMBL-CMV-NGL) er 5,848 bp, titer af denne AAV2G9 vektor var fast besluttet på at være 8.0 x 1011 vg/mL efter ligning 2 taktfast 3.8.2. Denne analyse gentages mindst to gange om at bestemme de endelige titers AAV vektor lagre.

Et repræsentativt resultat af cross-komplementering assays til at vurdere AAP afhængigheden i VP3 kapsid forsamling og evne for AAPs at samle VP3 proteiner af heterolog oprindelse vises i figur 2. In vitro undersøgelser af AAV ofte kræver ikke virus rensning at gøre konklusioner, og eksperimenter ved hjælp af urenset virus præparater såsom rå cellelysater og virus-holdige medier er tilstrækkelige til at give meningsfulde resultater. I dette eksperiment, blev det vurderet AAV viral partikel produktion fra alle mulige AAV VP3-AAP kombinationer blandt AAV5, AAV9 og slange AAV herunder VP3-ingen AAP kombinationer af en kvantitativ dot skamplet assay. De prøver i et duplikeret sæt af et eksperiment blev renset på 1 x og 10 x fortyndinger (sæt A og Set B i figur 2A, henholdsvis). Grafen vist i figur 2B opsummerer den kvantitative analyse af prikker. Resultaterne viser, at: (1) AAV5VP3 samler uanset om AAP var forudsat i trans, (2) AAP5 og AAP9 kan fremme AAV9VP3 kapsid forsamling selv om AAP5 fungerer mindre effektivt end AAP9, (3) hverken AAP5 eller AAP9 udstiller en samling fremme aktivitet på Snake AAV VP3, og (4) slange AAP kun fremmer samling af slange AAV VP3. (1) og (2) er i overensstemmelse med tidligere bemærkninger6, men entydigt bestemt AAV VP3-AAP interaktion i slange AAV er en roman opdagelse i dette eksperiment. En svaghed ved cross-komplementering analysen baseret på kvantitative dot skamplet er, at den negative kontrol altid viser betydelige niveauer af baggrunden signaler, der ikke kan være helt elimineret. Derfor, dot skamplet assay i sig selv kan ikke udelukke at kapsid samler til et niveau under følsomhed af analysen. I denne forbindelse skal det bemærkes, at en betingelse for at generere de negative kontroller, bruges under hvilke AAV viral genomer eksponentielt Repliker i mangel af kapsid VP3 protein. Sådanne negative kontroller kan frembringes af transfecting HEK 293 celler med pAAV-Reporter, pHLP-Rep og pHelper (tabel 2), og anvendes til at reducere falske positiver.

DNase jeg har været meget anvendt som en nukleasen i dot skamplet og qPCR-baserede assays til AAV kvantitering fjerne resterende plasmid DNAs og uemballerede viral genomer, der har forurenet AAV præparater. Disse forurenende stoffer ville ellers føre til en overvurdering af titers; Derfor er nukleasen fordøjelsen et meget vigtigt skridt for nøjagtigt kvantificere virale genom titers. DNase jeg enzymer er tilgængelige fra forskellige producenter og kommercielle leverandører; Men betydningen af valget af DNase I AAV kvantitering synes at have været underappreciated. For at undersøge, hvordan valget af nukleasen kan påvirke resultaterne af dot skamplet assay, blev de følgende tre nukleaser sammenlignet for deres evne til at fjerne baggrunden signaler fra AAV vektor-holdige kultur medierne forberedt som beskrevet ovenfor i trin 2 og 3: DNase I enzym A, DNase I enzym B og S. marcescens liv1975 (Tabel af materialer). Offentliggjorte undersøgelser har brugt den tidligere to DNase jeg enzymer13,21,22,23,24 , og vi har brugt S. marcescens liv1975 i tidligere og nuværende undersøgelser. Til vores overraskelse, blev det identificeret, DNase I enzym A er slet ikke et passende valg for dot skamplet analysen ved hjælp af de virus-holdige medier i de forskellige betingelser, der er testet, resulterer i høje baggrund signaler fra den negative kontrol, mens DNase I enzym B og S. marcescens liv1975 effektivt reduceret baggrund signaler med DNase I enzym B bliver ~ bukkes 2 gange mere effektiv end S. marcescens liv1975 (figur 3A, B). DNase I enzym C fandtes også for at være meget effektiv til at reducere baggrund-signaler (data ikke vist). Disse data viser, at der er betydelige forskelle i enzym aktiviteter blandt kommercielt tilgængelige nukleaser når enzymet reaktioner udføres i urenset AAV præparater, selv om nukleasen fordøjelsen skal være effektiv, når en lille mængde oprenset viral preps behandles under en optimeret betingelse. Således, disse data fremhæve betydningen af den korrekte udvælgelse af nukleasen i analysen når urenset AAV præparater undergår en kvantitativ dot skamplet eller qPCR assay.

Figure 1
Figur 1: en repræsentativ dot skamplet analyse til at bestemme titer af en vektor, CsCl-renset AAV. (A) dobbelt-strenget AAV2G9-CMV-NGL vektor blev produceret i HEK 293 celler af en standard adenovirus-gratis tre plasmid Transfektion metode på en stor skala, og renset af to runder af CsCl gradient ultracentrifugering, efterfulgt af dialyse. 0,3, 0,1 og 0,03 µL af den renset AAV vektor stock (renset på kolonnen længst til højre) blev udsat for kvantitative dot skamplet assay i to eksemplarer med to sæt af duplikerede plasmid DNA standarder (kønssygdomme). Skamplet blev udvidet med en 32P-mærket NGL sonde (0,77 kb), og billedet blev opnået ved hjælp af en fosfor billede scanning system. (B) en standardkurve viser relationen mellem kendte plasmid DNA mængder (ng-eq, x-aksen) og dot intensiteter (vilkårlig enhed (AU), y-aksen). Tal på y-aksen er fremstillet med fosfor billedet scanning system. R angiver Pearsons korrelationskoefficient. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: AAV VP3-AAP cross-komplementering dot skamplet assay. Dobbelt-strenget AAV-CMV-NGL vektor partikel produktion blev testet for VP3 proteiner fra AAV5, AAV9 og slange AAV i tilstedeværelse eller fravær af deres beslægtet AAPs eller tilstedeværelse af AAPs heterolog oprindelse. (A) analysen blev udført i en biologisk duplikerede række eksperimenter (sæt A og Set B) med 4 h inkubationstiden med S. marcescens endonuklease, og AAV vektor titer fremstillet af hver kombination var bestemt af en kvantitativ dot skamplet i afsnittet protokol beskrevne metode. Hver prik repræsenterer to tredjedele (5. og 6. rækkerne, 66,7%) eller to-tredivtedele (7. og 8. rækkerne, 6,7%) af DNA inddrives fra hver 200 µL af medium indsamlet fra prøverne eller den negative kontrol. De øverste fire rækker (1 til 4 rækker) repræsenterer to sæt af plasmid DNA standarder (STD 1 og STD 2) renset i to eksemplarer (dvs., lineært pEMBL-CMV-NGL plasmidet, som er plasmid brugt til dobbelt-strenget AAV-CMV-NGL vektor produktion). Dot skamplet membran var probed med en 32P-mærket NGL sonde. Par af punkter angivet med afrundede rektangler er negative kontroller. De øverste to rækker (STD 1) har er fra bunden af den oprindelige skamplet, men været skåret og flyttet til toppen uden at ændre billedet intensitet til at vise både plasmid standarder (STD 1 og STD 2) side om side. Denne manipulation er angivet med en sort linje i figur. (B) Viral titer blev fastsat til kombinationer af VP3 og AAP proteiner af dot duppes assay. Grafen repræsenterer et biologisk quadruplicated sæt af data, to fra panelet A og to fra en anden dot skamplet, der ikke er vist. Fejllinjer angiver gennemsnit +/-SD (n = 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: en sammenligning af enzymaktiviteter af forskellige nukleaser i urenset AAV vektor præparater. (A) A kvantitative dot skamplet viser effekten af hver nukleasen behandling til at fjerne baggrunden signaler. Dobbelt-strenget AAV9-CMV-NGL vektor-holdige præparater ("AAV9 vektor") og en "no-kapsid kontrol" blev produceret af HEK 293 celle Transfektion med plasmid DNAs og udsat for analysen. No-kapsid kontrol indeholdt ikke viruspartikler men indeholdt eksponentielt forstærket uemballerede CMV-normal god landbrugspraksis vektor genomer. MgCl2 blev suppleret på én eller tre gange de anbefalede beløb (6 mM og 18 mM for DNase I enzym A; og 2,5 mM og 7.5 mM for DNase I enzym B) uden hensyntagen til de 0,8 mM MgSO4 i mediet. Behandling med S. marcescens endonuklease, blev kun én betingelse beskrevet i afsnittet protokol testet. Alle prøver blev behandlet med hver nukleasen for 1 h. Dot skamplet membran var probed med en 32P-mærket NGL sonde. De lige to kolonner (STD 2) har er fra venstre side af den oprindelige skamplet, men været skåret og flyttet til højre uden at ændre billedet intensitet til at vise både plasmid standarder (STD 1 og STD 2) side om side. Denne manipulation er angivet med en tynd sort streg i figur. (B) prikker i no-kapsid kontrolprøver i panelet A er kvantificeret og vises som gennemsnit ± | hver værdi — mener værdi |. Syv ud af de 12 prøver behandlet med DNase I enzym A (angivet med en asterisk) Vis værdier kun lidt højere end den højeste standard; Derfor, de er inkluderet i denne graf for sammenligning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Serratia marcescens Liv1975 Buffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Justere pH 8,5 med 4 M NaOH.
10 x Proteinase K Buffer
100 mM Tris-HCl pH 8.0
100 mM EDTA pH 8.0
5% SDS
2 x basisk opløsning
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175.3 g NaCl
88.2 g natrium citrat tribasisk (Na3C6H5O7)
Denhardts løsning 100 x (50 mL)
1 g bovint serumalbumin (brøkdel V) Bemærk: Filtreringen er kritisk for at fjerne små partikler, som de forårsager baggrund hybridisering signaler.
1 g Polysucrose 400
1 g polyvinylpyrrolidon
Opløses i 20 mL vand i et 55 ° C vandbad.
Justere endelige rumfang 50 ml.
Filter-sterilisere med et 0,22 μm filter.
Hybridisering Buffer
1% SDS Bemærk: Butikken hybridisering Buffer ved 4 ° C og varme til 65 ° C i et vand bad før brug.
6 x SSC
5 x Denhardts løsning
10 mM Tris-HCl pH 8.0
Vaskebuffer
0,1% SDS
0,1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) løsning (1 mg/mL, 500 mL)
Tilsæt 500 mg PEI i 450 mL vand og rør. Bemærk: For længere opbevaring,-80 ° C er anbefalet.
Tilføje koncentreret HCl for at bringe pH ned til < 2.0 til at opløse PEI (ca. 800 µL af HCl vil være påkrævet).
Tilføje 10 M NaOH for at bringe pH op til 7.0 (ca. 500 µL af 10 M NaOH vil være påkrævet).
Regulér lydstyrken til 500 mL vand.
Filter-sterilisere med et 0,22 μm filter.
Alikvot og opbevares ved-20 ° C.
Phenol-chloroform (1:1 blanding) for kvantitative dot blotting
Tilføje buffer-mættet phenol (pH 8,0) og chloroform i forholdet 1:1 i 50 mL polypropylen koniske rør. Bemærk: Den buffer, der dækker de organiske lag, hvis efterlades i røret, kan blive overført til prøveglassene gennem pipettering og kan gøre analysen unøjagtige.
Vortex rør kraftigt til at blande.
Tillader faseadskillelse ved centrifugering og derefter fjerne den vandige lag helt.
Opbevares ved 4 ° C.

Tabel 1: løsning og Buffer opskrifter. Opskrifter til løsninger og buffere, der er nødvendige for at fuldføre den kvantitative dot skamplet protokol.

Plasmid AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negativ kontrol (μg) Transfektion kontrol (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0,4 0,4
pCMV-FLAG-AAPx 0,4
pAAV-Reporter 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
pCMV (tom) 0,4 0,8
pCMV-normal god landbrugspraksis 2.0
I alt 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabel 2: Plasmid kombinationer for AAV VP3-AAP cross-komplementering analyse udført i en 6-godt plade format. Kombinationer af plasmid DNAs skal bruges til HEK 293 celle Transfektion i hver eksperimentelle gruppe er vist. pCMV-AAVx-VP3, et plasmid udtrykker AAV serotype x (x = 1, 2, 3, etc.) VP3 protein CMV-IE enhancer-promotor; pCMV-FLAG-AAPx, et plasmid udtrykker AAV serotype x (x = 1, 2, 3, etc.) AAP protein CMV-IE enhancer-promotor; pAAV-Reporter, et plasmid, der har to AAV2 inverteret terminal gentagelser (ITRs) og er designet til rekombinant AAV vektor produktion; pHLP-Rep, et plasmid, udtrykker AAV2 Rep protein; pHelper, en adenovirus helper plasmid; pCMV (tom), en tom plasmid tilføjet til at styre de eksperimentelle betingelser; pCMV-NGL, et plasmid, at udtrykke et fluorescens markørgen (f.eks.normal god landbrugspraksis) for at kontrollere succes Transfektion. Transfections er udført i 6-godt plader, og bruge 2 µg af plasmid DNAs alt.

Blanding A For 10 rør (μL)
Serratia marcescens Liv1975 Buffer 91.2
0,1 M NaOH 8.8
I alt 100
Mix B For 10 rør (μL)
Serratia marcescens Liv1975 Buffer 91.2
1 M MgCl2 7,04
Serratia marcescens Liv1975 (250 enheder/μL) 0.176
I alt 100
Blanding C For 10 rør (μL)
10 x Proteinase K Buffer 400
Proteinase K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
I alt 1.800
Mix D For 10 rør (μL)
100% ethanol 8.000
3 M natriumacetat (pH 5,2) 320
Oyster glykogen (20 mg/mL) 10
I alt 8,330

Tabel 3: oversigt over master mix reagenser. Blanding A og Mix B bruges til S. marcescens liv1975 behandling i trin 3.2. Disse to blandinger skal foretages uafhængigt at forhindre udfældning af magnesiumhydroxid. Blanding C bruges til Proteinase K behandling i trin 3.3. Mix D bruges til ethanol nedbør i trin 3.4.3. De mængder, der er angivet i tabellen er for master mix reagenser til 10 rør.

Plasmid DNA standard (ng) Diskenheder (µL) 25 pg/µL plasmid DNA standardopløsning Diskenheder (µL) vand Samlede volumen (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1,25 150 450 600
0,625 75 525 600
0,313 37,5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Tabel 4: kvantitative dot skamplet plasmid DNA standarder. Nødvendige mængder af 25 pg/µL plasmid DNA standardopløsning og vand eller TE at forberede plasmid DNA standarder af dobbelt serielle fortyndinger (600 µL/tube) er vist. Tallene i kolonnen plasmid DNA standard (0.039 til 5 ng) er mængden af DNA i 200 µL af hver plasmid DNA standardopløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne betænkning, er nytten af kvantitative dot skamplet assays til at studere AAV AAPs og deres rolle i kapsid forsamling beskrevet. Viden fra disse undersøgelser kan give detaljeret indsigt i de medfødte forskelle i AAV kapsid forsamling og AAPs funktionelle rolle mellem forskellige serotyper. I denne henseende AAV VP3-AAP cross-komplementering dot duppes assay afsløret, at slangen AAV VP3 vises en streng afhængighed på fælles udtryk for dens beslægtet AAP for kapsid forsamling og slange AAP ikke fremmer kapsid forsamling af heterolog serotyper . Denne observation er spændende fordi den AAP-afhængige AAV serotyperne der undersøgte Kommissionen tidligere (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 og 12) er alle i stand til at behandle forsamling i det mindste til en vis grad ved at udnytte en heterolog AAP6.

Kvantitative dot eller slot skamplet hybridisering er en traditionel metode til kvantificering af nukleinsyrer indeholdt i flere prøver på samme tid i en praktisk måde25. Metoden havde været meget anvendt til DNA og RNA kvantitering indtil qPCR blev udbredt i 1990s26,27. Selvom qPCR har fordele over kvantitative dot skamplet og andre hybridisering-baserede assays i at qPCR udviser en højere følsomhed og et bredere dynamikområde, bærer det også en iboende risiko for eksponentielt forstærke fejl ubevidst, hvilket var tilfældet for titers AAV vektor lagre bestemmes af qPCR13,23. Kvantitative dot skamplet assays er nemt at sætte op med en billige pris og let transporteres så længe forskere har adgang til en kvantitativ Molekylær imaging system, der kan erhverve signaler fra dot skamplet membraner hybridiseret med enten en radioaktiv sonde eller en ikke-radioaktive kemiluminescens eller fluorescerende sonde. Selv om denne protokol udnytter 32P-mærket radioaktiv sonder til signal detection, bruge andre med succes ikke-radioaktive DNA-sonder direkte mærket med en kommercielt tilgængelig termostabil alkalisk fosfatase28. Dot skamplet assays bruge en ligetil princippet og analysen i sig selv udgør ikke en teknisk udfordring at kunstnere; resultaterne er derfor generelt reproducerbare selv af uerfarne personer.

Udover de programmer, der er beskrevet her, bruger vi rutinemæssigt en forenklet og fremskyndet version af proceduren dot skamplet, der hurtigt kan semi-kvantificere AAV partikler. Fordele ved dot skamplet assays i denne sammenhæng omfatter: (1) analysen kræver ikke rensning eller enzymatisk forstærkning af viral genomer, der tager timer, (2) en kombination af varme og basisk denaturering er tilstrækkeligt til at bryde AAV partikler i en prøve løsning og frigivelse denatureret viral genomer i den løsning, der er klar til at binde til en dot skamplet membran, og (3) tilstedeværelsen af salt på høj koncentrationer i prøverne påvirker ikke væsentligt assay resultater. For eksempel, er det muligt at semi-kvantificere AAV partikler i CsCl-rige løsninger (f.eks., brøker fremstillet ved CsCl tæthed-gradient ultracentrifugering) ved at sætte en lille delprøve (≤10 µL) af prøver i 100 µL 1 x basisk opløsning, varme ved 100 ° C i 10 min, og duppe på en membran med eller uden standarder forberedt på forhånd, efterfulgt af en 15 min hybridisering, 3 x 3 min. vasker og eksponering for en fosfor imaging skærmen for 15 min (eller længere, når du bruger en sonde med nedsat radioaktivitet). Hele proceduren kan afsluttes i 1 h, når brugeren bliver fortrolig med proceduren. Vi bruger denne fremskyndede metode, som vi sædvanligvis kalder "kogende dot skamplet metode", til at identificere AAV partikel-rige CsCl brøker under vektor rensning proces og groft bestemme titers renset AAV vektor lagre før du begynder den omfattende processer for vektor karakterisering. Således, selv om dot skamplet assays kan ses som en forældet metode til kvantificering af nukleinsyrer og allerede er blevet udskiftet med forskellige PCR-baserede metoder i en bred vifte af videnskabelige discipliner, er der stadig en række fordele til denne metode, der skal gøre forskere overveje at ansætte det i deres laboratorier.

Den mest kritiske trin i protokollen er nukleasen behandling af prøver. Hvis dette trin ikke udføres i en optimal tilstand, vil det medføre høje baggrund signaler. Vi bruger S. marcescens liv1975 mens DNase jeg enzymer af forskellige kilder er meget udbredt i andre laboratorier for viral DNA kvantificering. DNase af kvæg bugspytkirtlen oprindelse har været mest anvendt af forskere. Dette er til dels fordi de kvæg i bugspytkirtlen DNase først blev identificeret og mest omfattende karakteriseret biokemisk29. DNase jeg enzymer i øjeblikket tilgængelige fra kommercielle leverandører er fremstillet af flere forskellige biologiske kilder såsom Pichia pastoris (DNase I enzym A), den indfødte form renset fra kvæg bugspytkirtlen (fx, DNase I enzym B), og rekombinant enzymer produceret i enten en gær arter eller Escherichia coli (DNase I enzym C). Vi har konstateret, at DNase jeg enzymer fra alle tre af disse forskellige kilder har været brugt i offentliggjorte AAV vektor kvantitering undersøgelser; men til vores viden, har ingen af de tidligere studier undersøgt, om enzymer fra forskellige kilder er lige så effektive i fordøje kontaminerende DNA molekyler i AAV vektor præparater. Det skal bemærkes at DNase jeg behandling for AAV vektor assays foregår ofte under ikke-optimerede betingelser på grund af tilstedeværelsen af urenheder afledt af næringssubstratet og celler. Den iagttagelse, at DNase I enzym A er kun delvist aktiv i dyrkningsmediet brugte vi har betydelige virkninger i designe assay for AAV vektor kvantitering af dot skamplet og qPCR og advarer forskere at problemet tidligere uidentificerede. I denne henseende er S. marcescens liv1975 udtrykt i E. coli, en ideel liv1975 ikke kun med henblik på fremstilling af AAV vektorer, men også for AAV vektor kvantitering. Dette skyldes, at RuBisCOs enzymaktivitet kan bevares over en lang række pH-værdier og koncentrationen af magnesiumioner og monovalent kationer. Af denne grund og fordi S. marcescens liv1975 er ca 2 gange billigere end DNase I enzym B på grundlag af pr. enhed, vi foretrækker at bruge S. marcescens liv1975 i rutinemæssige kvantitative dot skamplet analyser.

I sammendrag er kvantitative dot skamplet assays en forholdsvis enkel procedure, der let kan give oplysninger om evnen til at producere viruspartikler under varierende forhold. I forhold til alternative titering tilgange, såsom qPCR, kræver dette lidt, hvis nogen, optimering. Det kan også let anvendes til vektorer af enhver serotype og kan bruges til titer både enkelt - og dobbelt-strenget vektorer uden at ændre protokollen. Efter transfections og høst af AAV vektor-holdige prøver (kultur medium og/eller celler), den hele protokol kan være afsluttet i om dagen, dermed hurtigt besvare spørgsmål om evnen til at producere viruspartikler fra forskelligartede betingelser, herunder forskellige kombinationer af AAV VP3 og AAP proteiner. Kvantitative dot blots tilbyde en hensigtsmæssig metode til at løse forskellige ubesvarede spørgsmål om VP-AAP interaktioner og deres roller i kapsid forsamling i en bred vifte af forskellige AAV serotyper og isolater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Xiao Xiao på University of North Carolina i Chapel Hill for at forsyne os med pEMBL-CMV-NGL plasmid. Vi takke Christopher Cheng og Samuel J. Huang for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud (NIH R01 NS088399 og T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Biologi sag 136 Adeno-associeret virus (AAV) aktivering af forsamling protein (AAP) cross-komplementering kvantitative dot skamplet assay viral titer genterapi
En kvantitativ Dot skamplet Assay for AAV titrering og dets anvendelse til funktionel vurdering af Adeno-associeret Virus forsamling-aktivering proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter