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Biology

Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Ce manuscrit détaille un essai par transfert de point simple pour le dosage des titres adeno-associated virus (AAV) et son application pour étudier le rôle de l’Assemblée-activation protéines (AAPs), une nouvelle classe de protéines virales non structurales dans tous les AAV sérotypes, dans la promotion de l’Assemblée des capsides dérivé de sérotypes d’AAV apparentés et hétérologues.

Abstract

Bien qu’adeno-associated virus (AAV) est largement reconnue comme un vecteur attractif pour la thérapie génique, il sert aussi comme virus modèle pour comprendre la biologie du virus. Dans le respect de ce dernier, la récente découverte d’une protéine AAV non structurelles, appelée protéines activatrices Assemblée (PAA), a jeté une lumière nouvelle sur les processus impliqués dans l’assemblage des protéines de capside virale VP dans une capside. Bien que de nombreux sérotypes d’AAV exigent PAA pour l’assemblage, nous avons récemment rapporté que AAV4, 5, et 11 y a des exceptions à cette règle. En outre, nous avons démontré que AAPs et assemblés capsides des sérotypes différents localiser aux différents compartiments subcellulaires. Cette hétérogénéité inattendue dans les propriétés biologiques et de rôles fonctionnels de l’AAPs parmi différent AAV sérotypes souligne que l’importance des études sur AAPs provenant de divers sérotypes. Ce manuscrit détaille un simple dot blot de dosage pour dosage AAV et son application afin d’évaluer la spécificité de la dépendance et sérotype PAA dans l’assemblage de la capside. Pour démontrer l’utilité de ce test de la tache de dot, nous partîmes pour caractériser l’assemblage de la capside et dépendance PAA de serpent AAV, un reptile non définie auparavant AAV, ainsi que AAV5 et AAV9, qui ont déjà démontré qu’être PAA-indépendants et dépendants du PAA sérotypes, respectivement. L’analyse a révélé que Snake AAV capside Assemblée exige PAA de serpent et qu’il ne peut être promue par AAPs de AAV5 et AAV9. L’analyse a également montré que, contrairement à beaucoup du sérotype souvent AAPs qui favorisent l’assemblage de la capside hétérologue par Croix-complémentation, serpent PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9. En outre, nous montrons que le choix de la nucléase affecte de manière significative la lecture de l’essai de tache de dot, et ainsi, choisir une enzyme optimale est essentielle pour une évaluation réussie de titres d’AAV.

Introduction

Adeno-associated virus (AAV) est un virus à ADN petit, non enveloppés, simple brin avec un génome d’environ 4,7 kilobases (kb). Le génome de l’AAV contient des cadres de lecture ouvert (ORF) pour les gènes rep et cap . En 2010, une protéine non structuraux inconnue codée par un ORF décalés dans le cadre de + 1 gène de cap de l’AAV2 a été découvert par Sonntag et coll. et jugée jouent un rôle essentiel dans l’assemblage de AAV2 protéines de la capside VP monomère dans le viral 1de capside. Cette nouvelle protéine a été baptisée Assemblée-activating protein (PAA) le rôle qu’elle joue dans la promotion de capside Assemblée1.

L’ORFs PAA été bioinformatically identifié dans les génomes de tous les parvovirus dans le genre Dependoparvovirus, mais pas dans les génomes des virus de différents genres de la parvovirose famille1,2. Des études fonctionnelles de cette nouvelle protéine étaient initialement axées sur le PAA du prototype AAV2 (AAP2), qui a établi le rôle essentiel du AAP2 pour cibler les protéines VP démontées le nucléole pour leur accumulation et leur formation en entièrement assemblé des capsides1,3,4. L’incapacité des capsides AAV2 à assembler en l’absence d’expression de l’AAP a été indépendamment confirmé par plusieurs groupes, y compris la nôtre,1,2,3,4,5 . Des études ultérieures sur les sérotypes d’AAV 1, 8 et 9 corroborent le rôle crucial de l’AAPs dans Assemblée de capside, sous forme de protéines VP3 monomère de AAV1, 8, et 9 ont été incapables de former une capside entièrement Assemblée en l’absence de la co-expression de PAA2.

Récemment, grâce à des méthodes qui incluent l’utilisation quantitative dot blot essais, nous avons étudié la capacité des AAV1 à 12 VP3 monomères d’assembler dans des capsides en l’absence d’expression de la PAA et la capacité de AAP1 à 12 pour promouvoir l’Assemblée de VP3 monomères de sérotypes hétérologues. Cette étude a révélé que AAV4, 5 et 11 VP3 monomères peuvent se réunir sans PAA. En outre, il a été constaté que huit des douze sérotypes PAA nous avons examiné (c'est-à-diretous sauf AAP4, 5, 11 et 12) affiche une large capacité pour soutenir l’assemblage de la capside des capsides de sérotype AAV hétérologues, tout en AAP4, 5, 11 et 12 affiché un substantiellement capacité limitée à cet égard6. Ces quatre sérotypes sont phylogénétiquement éloignées des autres PAA sérotypes2,3. En outre, l’étude a révélé une hétérogénéité significative dans des localisations subcellulaires des différents AAPs6. En outre, l’étude a suggéré que l’association serrée PAA avec capsides assemblés et le nucléole, la marque distinctive d’AAV2 Assemblée de capside, ne peut nécessairement être étendue à d’autres sérotypes, y compris AAV5, 8 et 9, qui affichent des nucléole exclusion de capsides assemblé6. Ainsi, l’information obtenue grâce à l’étude d’un sérotype particulier PAA n’est pas applicable à tous les biologie du PAA. Telle nature curieux de biologie PAA souligne la nécessité d’enquêter sur le rôle et la fonction de chaque AAP de sérotypes d’AAV canoniques et non canoniques.

Le rôle biologique du PAA en assemblage de la capside peut être évalué en déterminant que les titres de particule virale AAV emballé entièrement produit en rein embryonnaire humain (HEK) 293 cellules, la lignée de cellules plus couramment utilisés pour la production de vecteur d’AAV, avec ou sans protéine PAA expression. Les méthodes standards pour le dosage de l’AAV sont PCR quantitative (qPCR)-dosages selon7,8 et quantitative dot blot-basé assays9. Autres méthodes de quantification des particules virales AAV comme enzyme-linked immunosorbent assay10,11 ou de mesure de densité optique12 ne sont pas idéales pour les échantillons provenant de nombreux différents sérotypes d’AAV ou échantillons contaminés par des impuretés (lysats bruts ou milieux de culture), qui sont souvent les échantillons utilisés pour la recherche de l’AAV. Actuellement, qPCR est plus largement utilisé pour le dosage de l’AAV ; Toutefois, il est nécessaire de reconnaître d’éventuels avertissements du dosage qPCR-basé, comme le dosage peuvent entraîner des erreurs systémiques et titre importantes variations13,14. Les analyses basées sur la PCR sont affectés par un certain nombre de facteurs, comme la présence de covalence fermés barettes terminales dans les modèles de PCR qui inhibent l’amplification13potentiellement confondants. Même une personne expérimentée peut introduire le potentiel des facteurs confondants dans une base de qPCR dosage inconsciemment13. En revanche, quantitative dot blot dosages sont une technique classique de biologie moléculaire qui ne comporte pas d’amplification du génome et utilise de manière beaucoup plus simple avec un risque minimal d’erreurs par rapport aux analyses qPCR. La méthode est moins techniquement difficile ; par conséquent, les résultats de titrage sont raisonnablement reproductibles même par des personnes inexpérimentées.

Dans ce rapport, nous décrivons les détails méthodologiques d’un test de la tache point quantitatif régulièrement, nous utilisons pour le dosage de vecteur AAV et fournissent un exemple de Comment veut appliquer l’analyse pour étudier le rôle de l’Assemblée-promotion du PAE en commun sérotypes (AAV5 et AAV9) et une auparavant non caractérisé PAA du serpent AAV14. Dans la nature, AAV VP protéines et protéines de l’AAP sont exprimés en cis d’un seul gène (c'est-à-dire, VP-PAA cis-complémentation), tandis que dans l’essai décrit ici, protéines VP et AAP sont fournis en trans de deux plasmides distincts (c.-à-d., VP-PAA TRANS-complémentation). Étant donné que chaque protéine VP ou PAA de sérotypes différents peut être exprimée de chaque plasmide indépendant, il devient possible de tester les combinaisons de VP-PAA hétérologues pour l’assemblage de la capside (c.-à-d., VP-PAA Croix-complémentation). Brièvement, AAV VP3 de différents sérotypes est exprimée dans les cellules HEK 293 par transfection d’ADN plasmidique pour empaqueter un génome de vecteur d’AAV en présence ou en absence du sérotype apparenté du PAA, ou en présence d’un sérotype hétérologue du PAA. Production, milieux de culture et de lysats cellulaires sont soumis à un essai de tache de dot pour quantifier le génome viral dans la coquille de la capside. La première étape du test dot blot est de traiter des échantillons avec une nucléase pour supprimer contaminantes plasmide DNAs et non emballés AAV génomes dans les échantillons. Faute de quoi augmenterait les signaux de fond en particulier lorsque des échantillons non-purifiés sont dosés. Ceci est alors suivi d’un traitement de protéase à briser les capsides virales et libérer des génomes viraux nucléase-résistante dans exemples de solutions. Prochaines, virales de génomes sont dénaturés, effacés sur une membrane et hybridés avec une sonde d’ADN spécifiques d’un génome virale à la quantification. Dans l’analyse de l’exemple rapporté ici, nous démontrons que Snake AAV VP3 exige PAA de serpent pour l’assemblage de la capside et que Snake PAA ne favorise pas l’Assemblée des capsides AAV9 contrairement à beaucoup de l’AAPs dérivée de sérotypes PAA-dépendante qui peuvent aussi favoriser l’Assemblée de capsides sérotype hétérologue. Enfin, nous présentons une mise en garde importante à qPCR ou quantification de VAA axée sur la tache point essais que le choix de la nucléase affecte significativement les résultats de titrage.

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Protocol

NOTE : Les recettes pour les solutions et tampons nécessaires à ce protocole sont fournis dans le tableau 1. Le protocole décrit ci-dessous est pour l’essai de tache de point de croix-complémentation VP-PAA étudier les rôles des protéines dans l’assemblage de la capside du PAA. La méthode pour le dosage de tache point quantitatif plus générique pour le titrage de vecteur AAV purifiée est expliquée dans la section Résultats de représentant .

1. construction de VP3, PAA et Rep AAV2 exprimant des plasmides

  1. Construction du CMVp-AAVx-VP3 (x = sérotypes)
    1. PCR-amplifier l’ORF de VP3 (1,6 Ko) tout en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité et la paire d’amorces suivant : VP3 avance, CTAA-RE1-CACC-N25 (les 25 premiers nucléotides de l’ORF VP3) ; VP3 inverse, TCTT-RE2-N25 (les 25 derniers nucléotides de l’ORF VP3).
      NOTE : RE1 et RE2 sont des sites pour les enzymes de restriction (REs) pour le clonage. CTAA et TCTT sont le terminal 5' et 3' tétranucléotides ajoutées pour faciliter la digestion de l’enzyme de restriction près de l’extrémité de l’ADN double brin. CACC est une séquence consensus de Kozak.
    2. Cloner les amplicons RE-digested entre les correspondants RE sites d’un vecteur d’expression chez les mammifères qui utilise le cytomégalovirus humain (CMV-IE) immédiatement-début enhancer-promoteur pour expression de haut niveau.
      Remarque : Pour le clonage moléculaire, digérer 5 µg de l’ADN de plasmide d’épine dorsale avec une restriction enzyme(s) à une concentration de 4 U/µg d’ADN pendant 1 h à une température optimale. Pour les fragments PCR, augmenter les unités d’enzymes utilisées (p. ex., 10 U/µg du produit PCR ORF VP3 1,6 Ko) et un temps d’incubation plus longs (par exemple, 4 h) due à une augmentation du nombre de sites de reconnaissance enzyme de restriction par unité de longueur. Informations utiles en enzymes de biologie moléculaire et les procédures de clonage dont la transformation bactérienne se trouvent ailleurs15,16,17.
  2. Construction du CMVp-drapeau-AAPx (x = sérotypes)
    1. PCR-amplifier l’ensemble AAP ORF (0,6 kb) à l’exception du premier acide aminé en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité et la paire d’amorces suivant : PAA avance, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (les 25 nucléotides de la 4ème nucléotide dans le PAA ORF) ; PAA inverse, TCTT-RE2-N25 (les 25 derniers nucléotides de l’AAP ORF).
      Remarque : GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes une étiquette de drapeau, qui a été montrée pour avoir aucun effets négatifs4,5 , mais peut être omise si inutile.
    2. Cloner les amplicons RE-digested entre les sites correspondants d’un vecteur d’expression chez les mammifères avec le CMV-IE enhancer-promoteur15,16,17.
  3. Construction de pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg du plasmide pAAV-RC2 (7,3 Ko) avec 20 unités de chaque de Xho I et Xcm j’ai et purifier l’ADN à l’aide d’une trousse commerciale de purification ADN ou par extraction au phénol-chloroforme.
      NOTE : Enlèvement du 1,8 Ko Xho I-Xcm, que j’ai des fragments du 7,3 Ko pAAV-RC2 plasmide provoque une perte d’expression des protéines de capside VP tout en préservant l’expression de la protéine.
    2. Émoussé, l’ADN se termine avec 6 unités de T4 ADN polymérase, agarose gel-purifier le fragment d’ADN de 5,5 kb et les ligaturer le fragment purifié à l’aide de 50 à 100 ng d’ADN et 400 unités de T4 DNA ligase selon recommandation15 les directives du fabricant.
    3. Suivez la procédure standard de transformation bactérienne référencée à l’étape 1.1.2 Note.
  4. Vérifiez que le plasmide construit par enzyme de restriction digestion et séquençage15,18.
  5. Effectuer le plasmide minipreps ou maxipreps à l’aide de kits disponibles dans le commerce pour obtenir une quantité suffisante d’ADN plasmidique pour les expériences de production AAV en aval.

2. production d’AAV dans HEK 293 cellules par Transfection d’ADN plasmidique (analyse de la Croix-complémentation)

  1. La culture de cellules HEK 293 dans de Dulbecco modifié Eagle (DMEM)-taux de glycémie élevé (4,5 g/L) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % la pénicilline et streptomycine Mix et 1 mM de L-glutamine, dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
    NOTE : Les titres de VAA s’écarte sensiblement selon la provenance des cellules HEK 293.
    ATTENTION : Bien que AAV peut être traitée au niveau de biosécurité 1 confinement (BSL1), confinement BSL2 est recommandé pour le travail de cellules HEK 293.
  2. Jour -1 (24 h avant la transfection), plaque de 6 – 7 x 105 HEK 293 cellules/puits dans 2 mL du milieu complet décrit à l’étape 2.1 dans une plaque (s) 6 puits. Ce qui généralement atteint environ 90 % confluence le lendemain.
  3. Jour 0 : Transfection
    1. Préparation pour la transfection d’ADN
      1. Assurez-vous que les cellules ont atteint confluence de ~ 90 %.
      2. DMEM supplémenté avec 1 % pénicilline & Mix de streptomycine et 1 mM de L-glutamine, mais sans les 10 % d’échauffement FBS (c'est-à-diresans sérum moyen) dans un bain-marie à 37 ° C.
      3. Laisser la solution polyéthylènimine (PEI) à température ambiante.
    2. Préparation du mélange de l’ADN de plasmide
      1. Mélanger les plasmides en 96 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans CaCl2 ou MgCl2 tubes de microcentrifuge de stériles de 1,5 mL comme indiqué dans le tableau 2. Le montant total de l’ADN est de 2 µg/puits.
        Remarque : Les volumes de la solution d’ADN de plasmide peuvent être négligées si ils sont nominales. Réglage du volume est recommandé si le volume total des solutions ADN plasmidique est ≥ 10 µL.
    3. Transfection de PEI
      1. Ajouter 4 µL de solution de PEI (1 mg/mL) à la composition de l’ADN de plasmide-PBS (préparée comme indiqué ci-dessus). Le volume final est environ 100 µL (5 % du volume de milieu de culture). Vortex les tubes brièvement et incuber le mélange de l’ADN : PEI pendant 15 min à température ambiante.
      2. En attendant l’incubation de 15 min compléter, remplacer le milieu de culture avec un milieu sans sérum préchauffée décrit à l’étape 2.3.1.2.
      3. Une fois le 15 min d’incubation de l’ADN : mélange de PEI est achevé, brièvement tourner les tubes avec une micro-centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond des tubes et ajouter le mélange de l’ADN : PEI goutte au milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture de cellules HEK 293. Doucement agiter les plaques et les ramener à un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
      4. Maintenir les cellules dans ce milieu de transfection jusqu'à la récolte au jour 5 (aucun changement médiatique n’est nécessaire).
  4. Le jour 1 et jour 2, observer des cellules transfectées avec les plasmides CMVp-GFP sous le microscope inversé par fluorescence pour évaluer l’efficacité de transfection.
    Remarque : pour la microscopie de fluorescence, voici un 10 X / 0.25 objectif ouverture numérique en combinaison avec un oculaire de 10 × a été utilisé, et filtre passe-bande de 450 à 490 nm excitation et filtre d’émission de 515 à 565 nm passe-bande travaillaient. La condition ci-dessus donne normalement plus d’efficacité de transfection de 70 %. Les cellules peuvent présenter des changements morphologiques (p. ex. cellules sont devenues minces) en raison de l’État sans sérum.
  5. Jours 3 à 5, continuer à la culture des cellules transfectées dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
  6. Le jour 5, recueillir les cellules et le milieu contenant du virus dans les tubes coniques en polypropylène 15 mL par pipetage de haut en bas ou en grattant avec un grattoir de cellules.
  7. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. dot Blot Assay pour le dosage de l’AAV

  1. Récupération des particules virales
    1. Rapidement dégeler les tuyaux gelés dans un bain-marie à 37 ° C. Vortex les tubes vigoureusement pendant 1 min maximiser la récupération de l’AAV dans les cellules.
    2. Les débris de cellules de granule par centrifugation à 3 700 x g à 4 ° C pendant 10 min. Prendre 200 µL de surnageant de chaque éprouvette et transférez-le dans un tube de microcentrifuge étiquetées avec un bouchon à vis sur le dot blot assay.
      NOTE : Partie aliquote le surnageant restant dans microcentrifugeuse tubes et stockez-les congelé à-80 ° C pour une utilisation future. Ici, tubes de microcentrifuge polypropylène attaché avec bouchons à vis et un joint torique ont été utilisés. Étanche est nécessaire pour prévenir les déversements de AAV et phénol-chloroforme.
  2. Traitement avec l’endonucléase de Serratia marcescens
    1. Préparer des réactifs A de Mix et Mix B (tableau 3). Ajouter 10 µL du mélange A et 10 µL du mélange B dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s, brièvement tourner les tubes pour recueillir le liquide au fond des tubes et incuber les tubes à 37 ° C au moins pendant 1 heure.
      NOTE : Mélange A contient NaOH et optimise le pH pour le traitement avec l’endonucléase de S. marcescens . Mix B suppléments de magnésium. Concentration de S. marcescens endonucléase stocks enzyme commercialement disponibles peut-être varier. Le volume de S. marcescens endonucléase doit être ajusté en conséquence pour faire 200 U/mL après avoir ajouté le mélange A et B de le Mix dans des tubes à l’étape 3.2.1.
      NOTE : Un temps d’incubation plus longs, vers le haut à 4 h, peut diminuer les signaux de fond.
    2. À la fin de l’incubation, brièvement tourner les tubes avec une centrifugeuse de paillasse pour recueillir la condensation et la solution par le haut et les côtés des tubes.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être conservés congelés à-20 ° C ou à-80 ° C.
  3. Traitement de la protéinase K
    1. Préparer le mélange C réactif (tableau 3). Ajouter 180 µL du mélange C dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s, brièvement tourner les tubes et les incuber les tubes à 55 ° C pendant 1 h.
      Remarque : L’EDTA dans le réactif C Mix chélates ions magnésium libre et inactive S. marcescens endonucléase.
    2. À la fin de l’incubation, permettent des échantillons à température ambiante et actionner brièvement les tubes avec une centrifugeuse de paillasse pour recueillir la condensation et la solution par le haut et les côtés des tubes.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les échantillons peuvent être conservés congelés à-20 ° C ou à-80 ° C. Pour reprendre le protocole, incuber les tubes à 55 ° C pendant 5 à 10 min de dissoudre les cristaux de SDS contenues dans la mémoire tampon complètement.
  4. Précipitation d’extraction et d’éthanol de phénol-chloroforme
    1. Ajouter 200 µL de phénol-chloroforme dans les échantillons et les vortex eux pendant 1 min. tournent les échantillons dans un microcentrifuge à ≥ 16, 100 x g pendant ≥ 5 min à température ambiante.
      ATTENTION : Phénol-chloroforme devrait être manipulé sous une hotte chimique avec l’équipement de protection individuelle approprié (EPI ; c'est-à-dire, gants en nitrile, lunettes de protection ou un écran facial et blouse à manches longues).
    2. Transfert de 320 µL de la phase aqueuse (160 µL deux fois avec une pipette de P200) dans un nouveau tube de microcentrifuge standard (80 % du volume de fluide aqueux).
      Remarque : Il est primordial de prendre le même volume de solution aqueuse entre échantillons, sinon le test perd précision quantitative.
    3. Préparer le réactif de Mix D (tableau 3). Ajouter 833 µL du mélange D dans chaque tube. Vortex les tubes pendant 5 s et incuber les tubes à-80 ° C pendant 20 min.
      NOTE : Mix D est un mélange d’éthanol, acétate de sodium et glycogène pour la précipitation d’éthanol commode de l’ADN. Échantillons peuvent être conservés à-80 ° C à cette étape et le protocole peut être repris plus tard.
    4. Centrifuger les échantillons d’un microcentrifuge à ≥ 16 100 x g à 4 ° C pendant 15 min. égoutter surnageant et éponger une fois sur une serviette en papier propre. Mettre environ 500 µL d’éthanol à 70 % dans chaque tube, vortex les tubes pendant 5 s et centrifuger les tubes avec un microcentrifuge de benchtop à ≥ 16, 100 g de x à 4 ° C pendant ≥ 5 min.
    5. Décanter le liquide surnageant et éponger une fois sur un essuie-tout propre. Granulés secs à 65 ° C ; pellets peuvent être séchés complètement.
      Remarque : Ne pas utiliser une pipette pour enlever l’excès d’éthanol qui reste après avoir éponger les tubes. Pellets peuvent également être séchés à température ambiante pendant la nuit. Le protocole peut être suspendu ici et séchées ADN granulés peuvent être stockés à température ambiante pendant plusieurs jours avec le tube couvercle fermé.
  5. Remise en suspension de l’ADN viral dans un tampon TE
    1. Dissoudre les granules d’ADN dans 120 µL de chaque de tampon TE en secouant chaque tube pendant 30 min à 1 h à température ambiante.
  6. Tache de dot
    1. Élaboration de normes d’ADN plasmidique
      1. Diluer l’AAV vecteur génome ADN plasmidique à 10 ng/µL dans l’eau ou de tampon Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Prendre 25 µL de cette dilution et digest avec une enzyme de restriction appropriée pendant 1 h à linéariser le plasmide ADN, dans un volume réactionnel de 50 µL.
        NOTE : Nous faisons un jeu une copie de la digestion (voir étape 3.6.4.1). L’enzyme appropriée devrait être celui qui coupe l’ADN de plasmide hors de la région de liaison sonde dot blot. Pour plus de commodité, l’ADN de plasmide dilué peut être aliquotés (25 µL/tube) et stockés congelés à-20 ° C pour une utilisation future. Digérer l’ADN de plasmide tandis que les tubes sont en secouant dans l’étape 3.5.1. Ne digèrent pas trop le plasmide ADN standard.
      2. Ajouter 450 µL d’eau ou TE dans le tube contenant le plasmide digéré ADN standard et bien mélanger. Transférer 70 µL de ce mélange dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL avec 1 330 µL d’eau ou de TE faire un plasmide dilué standard (25 pg/µL).
      3. Suivre le tableau 4 pour créer une série de dilutions en série double (600 µL/tube). Bien mélanger les dilutions au Vortex pendant 5 s.
    2. Dénaturation des normes et des échantillons d’ADN virales
      1. Ajouter 600 µL de 2 x Solution alcaline à chaque dilution standard. Mélangez bien au Vortex pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
      2. Ajouter 120 µL de 2 x Solution alcaline dans chaque échantillon d’ADN viral. Mélangez bien au Vortex pendant 5 à 10 s. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    3. Paramétrage de l’appareil de dot blot
      1. À l’aide de ciseaux, couper une membrane buvard (p. ex., zeta-sonde) à la bonne taille pour le nombre d’échantillons et étalons. Faire tremper la membrane avec de l’eau pendant 10 min avant de le placer sur un appareil de dot blot. Couvrir les puits non utilisés sur l’appareil de la membrane.
        NOTE : Gérer la membrane avec la pince à épiler propre. Pour couvrir le puits vides, la feuille de protection contre la lumière bleue qui vient avec la membrane peut être utilisée. Ne pas laisser la membrane sécher avant contraignant les échantillons et étalons. Pour plus de détails sur le montage et l’utilisation de l’appareil, veuillez vous référer au manuel utilisateur19.
      2. Ajouter de l’eau dans les puits dont les échantillons seront chargés. Arroser de vide et tirer à travers les puits pour vérifier les erreurs et refaites le test lors de la fixation. Resserrez les vis tout en appliquant une dépression pour assurer la fermeture étanche.
        NOTE : Étanchéité incomplète peut entraîner des fuites d’échantillon entre les puits.
      3. Une fois que l’eau est complètement passée à travers, libérer le vide complètement (c'est-à-dire, le collecteur d’aspiration devrait être ouvert à la pression atmosphérique).
    4. Chargement des normes et des échantillons à l’appareil à dot blot
      1. Appliquez 400 µL de chaque plasmide dilué ADN standard dans chaque puits et exécuter les quatre voies de dilutions standards. Utiliser deux aliquotes distinctes du standard digest et charger chacun en deux exemplaires. Appliquer 200 µL/puits de chaque échantillon d’ADN viral.
        Remarque : En utilisant le reste ~ 40 µL d’échantillons dénaturés, échantillons dilués peuvent être préparés (par exemple, un facteur 10 échantillons dilués avec de 20 µL de l’échantillon plus de 180 µL de Solution alcaline 1 x) et effacés si nécessaire.
      2. Appliquer doux vide pour passer les solutions d’ADN dans le puits.
        NOTE : Vide pression devra être ajustée en ouvrant partiellement un robinet à trois voies afin que la pression de vide est appliquée à la dot blot appareil ainsi que l’atmosphère (c'est-à-dire, avec les bras de robinet placé à un angle d’environ 45 ° où il fait un bruit d’aspiration plus fort).
      3. Une fois que tous les puits ont vidé, libérer le vide en ajustant la vanne trois voies. Ajouter 400 µL de Solution alcaline 1 x dans chaque cupule contenant les échantillons et étalons. Attendre 5 min avant de ré-appliquer le vide pour vider les puits.
      4. Ré-appliquer le vide de la même manière (voir étape 3.6.4.2).
      5. Démonter l’appareil point de tache sous vide, retirer la membrane et rincez-la avec 2 x SSC. Placer la membrane sur un essuie-tout propre avec le côté d’ADN lié vers le haut pour enlever l’excès 2 x SSC.
      6. UV-crosslink le buvardages ADN à la membrane avec une RETICULATION UV appropriée ; la membrane est maintenant prête pour l’hybridation.
        NOTE : Membranes humides peuvent être utilisés pour la réticulation UV. Le séché, UV-réticulé membranes peuvent être stockés à température ambiante. On trouvera de plus amples informations dans la Table des matières.
  7. Hybridation et lavage
    1. Réchauffer le tampon d’hybridation dans un bain d’eau de 65 ° C.
    2. Enzymatiquement étiqueter une sonde d’ADN avec32P dCTP radioactif α - et de le purifier à l’aide de kits disponibles dans le commerce selon la recommandation du manufacturier.
      Remarque : Nous utilisons une sonde de 0,5 à 2,0 kb dans la longueur d’une région d’enhancer-promoteur ou une séquence codant pour des protéines dans le génome viral. Bien que ce protocole utilise 32sondes radioactives marquées P pour la détection du signal, non radioactif par chimiluminescence ou fluorescents sondes peuvent également être utilisés (veuillez vous reporter à la section « Discussion »).
    3. Placer la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté d’ADN lié vers le haut, rinçage de la membrane avec 5 mL préchauffé tampon d’hybridation et jetez la mémoire tampon. Puis ajouter 10 mL de tampon d’hybridation préchauffée et placer le flacon dans un four à hybridation rotatif réglé à 65 ° C. Agiter pendant ≥ 5 min.
    4. Chaleur-20 µL de 10 mg/mL cisaillé hareng ou solution d’ADN de sperme de saumon et la sonde marquée par un P de 32(≥ 107 cpm) pendant 5 min à dénaturer en plaçant les tubes sur un ensemble de bloc de chaleur à 100 ° C. Snap-chill sur glace pendant ≥ 2 min, spin brièvement, puis garder sur la glace jusqu'à l’utilisation.
      ATTENTION : Pour des sondes d’ADN radioactifs, tubes de 1,5 mL avec bouchon à vis et le joint torique doivent être utilisés.
    5. Ajouter rapidement l’ADN dénaturé de sperme et la sonde radioactive vers le tampon de l’hybridation dans l’hybridation flacon et agiter vigoureusement la bouteille pendant 10 s pour mélanger. Remettre la bouteille dans le four de 65 ° C et laisser incuber la bouteille avec rotation à 65 ° C pendant ≥ 4 h.
    6. Une fois que l’hybridation est terminée, arrêter la rotation, enlever la bouteille de l’hybridation et puis versez la solution sonde radioactive dans un tube conique de 50 mL avec un capuchon de joint étanche. Stockez la sonde dans un récipient placé dans un réfrigérateur désigné pour les matières radioactives.
      Remarque : Utilisé un tampon d’hybridation avec une sonde qui est stockée à 4 ° C peut être ré-utilisé au moins 5 fois en plaçant le tube conique de 50 mL avec un capuchon de joint étanche qui contient un tampon d’hybridation dans un bain-marie à 100 ° C pendant 5 min.
    7. Nettoyer la membrane avec le tampon de lavage chauffé à 65 ° C. Ajouter 20 à 30 mL de tampon de lavage dans le flacon de l’hybridation et faire tourner pendant 5 min. répéter ce laver 2 fois plus.
      NOTE : Mesurer la radioactivité des solutions de lavage et inscrivez-la si requis par l’Institut local.
    8. Lors du lavage de la membrane, placez un écran sur une gomme à effacer image pendant 5 min-images au phosphore.
    9. Après le troisième lavage, enlever la membrane de la bouteille d’hybridation, enlever l’excès de tampon sur la membrane avec du papier absorbant et placer la membrane dans un support de papier en plastique transparent. Vérifier les signaux radioactifs sur la membrane à l’aide d’un compteur Geiger. Exposez l’écran d’imagerie de phosphore sont effacées à la membrane pendant 10 min à la nuit selon l’intensité du signal.
    10. Balayage de l’écran en utilisant une image de phosphore, système de balayage et d’obtenir les données sur l’intensité du signal de chaque point.
  8. Analyse des données
    1. Dessiner une courbe d’étalonnage à l’aide de la feuille de calcul et de données logiciels d’analyse (par exemple, Excel).
      NOTE : Régression linéaire Log-log a été utilisée pour dessiner une courbe d’étalonnage.
    2. Déterminer l’équivalent nanogramme (ng-eq) pour chacun des échantillons ADN virales par interpolation. Le ng-eq est le montant du plasmide ADN utilisée pour dessiner une courbe d’étalonnage qui équivaut au nombre de molécules d’ADN virales. Lorsque la longueur de l’ADN de plasmide est 8 000 bp, 1 ng-eq de l’ADN viral AAV monocaténaire correspond à 2,275 x 108 particules.
      Remarque : Le ng-eq peut être converti en nombre de particules virales par les équations suivantes :
      Equation 1
      Equation 2
      Le nombre de particules AAV est conventionnellement exprimé en « vg » (vecteur génomes) ou « PRA » (particules j’ai résistant à la DNase).
    3. Calculer les concentrations d’AAV de produits de départ. Parce que l’ADN viral buvardages représente 66,7 % Equation 3 de l’ADN viral dans les matières de départ, 1 ng-eq correspond à 1,7 x 109 particules/mL Equation 4 .
      Remarque : Cette correction n’est pas nécessaire si tous les ADN virale contenue dans le produit de départ sont effacé sur une membrane sans perte (voir Figure 1).

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Representative Results

Un résultat représentatif des taches point quantitatif pour le dosage des stocks de vecteur AAV purifiées produites à grande échelle est illustré à la Figure 1. Avec cet essai de tache de dot, le titre d’un stock de vecteur bicaténaire AAV2G9-CMV-GFP a été déterminé. Le vecteur a été purifié par deux séries de chlorure de césium (CsCl), gradient de densité ultracentrifugation suivie de dialyse comme décrit précédemment20. En général, pour les stocks de vecteur AAV purifiées, trois différents volumes de chaque stock de vecteur d’AAV (par exemple, 0,3 µL, 0.1 µL et 0,03 µL) sont soumis à la procédure de tache de dot décrite ci-dessus en double avec une modification. DNase I Enzyme A est utilisé à la place de S. marcescens endonucléase à l’étape 3.2, et un kit disponible dans le commerce pour extraire et purifier l’ADN viral est utilisé à l’étape 3.4 (voir Table des matières). Dans l’exemple illustré dans la Figure 1, les valeurs d’intensité de signal (unité arbitraire) obtenus à partir de chaque plasmide ADN standard (Figure 1 a) ont été tracées sur les quantités d’ADN connues pour dessiner une courbe standard (Figure 1 b), montrant une corrélation coefficient de 0,998. À l’aide de cette courbe d’étalonnage, il a été déterminé par interpolation que 0,03, 0,1, 0,3 µL d’extraits du vecteur AAV2G9 a 1.487 et 1.522 ng-eq (0,3 µL), 0,487 et 0,507 ng-eq (0.1 µL) et 0,158 et 0.171 ng-eq (0.03 µL). Cela a donné les six valeurs suivantes : 4,957 5.073, 4.870, 5.070, 5,267 et 5.700 eq ng/µL pour cette AAV2G9 particulière vector stock, conduisant à une moyenne de 5,16 ± 0,27 ng-eq/µL (moyenne ± écart-type). Depuis la longueur du plasmide utilisé comme la norme (pEMBL-CMV-GFP) est 5 848 bp, le titre de ce vecteur de AAV2G9 a été établie à 8,0 x 1011 vg/mL selon l’équation 2 à l’étape 3.8.2. Ce dosage est répété au moins deux fois afin de déterminer les titres finales des stocks de vecteur d’AAV.

Un résultat représentatif de croix-complémentation des épreuves pour évaluer la dépendance du PAA en Assemblée capside VP3 et la capacité pour AAPs assembler VP3 protéines hétérologues origines est affiché à la Figure 2. In vitro études d’AAV souvent ne nécessitent pas de purification de virus de tirer des conclusions, et des expériences utilisant des préparations de virus non-purifiés comme les lysats cellulaires brut et milieux de culture contenant le virus ne suffisent pas à donner des résultats significatifs. Dans cette expérience, la production de particules virales AAV a été évaluée de toutes les combinaisons possibles d’AAV VP3-PAA parmi AAV5, AAV9 et Snake AAV, y compris les combinaisons VP3-no PAA par un quantitatif dot blot. Les échantillons obtenus dans un double jeu d’une expérience ont été effacés à 1 x et 10 x dilutions (série A et série B l' Figure 2 a, respectivement). Le graphe montré en Figure 2 b résume l’analyse quantitative des points. Les résultats montrent que : (1) AAV5VP3 assemble que PAA soit pourvu en trans, PAA5 (2) et PAA9 peuvent promouvoir Assemblée capside AAV9VP3 bien que PAA5 fonctionne moins efficacement que PAA9, (3) ni PAA5 ni PAA9 expose un ensemble de promouvoir l’activité le serpent AAV VP3 et (4) serpent PAA favorise seulement assemblage de serpent AAV VP3. (1) et (2) sont en ligne avec précédentes observations6, mais l’unique spécifique AAV VP3-PAA interaction en serpent AAV est une découverte dans cette expérience. Une faiblesse de l’analyse de croix-complémentation basé sur la tache point quantitatif est que le contrôle négatif montre toujours des niveaux appréciables des signaux de fond qui ne peut pas être totalement éliminés. Par conséquent, l’essai de tache de dot par lui-même ne peut pas exclure la possibilité que capside assemble à un niveau inférieur à la sensibilité du test. À cet égard, il convient de noter que, pour générer les témoins négatifs, une condition est utilisée dans les génomes viraux AAV exponentiellement répétées en l’absence de la capside protéique VP3. Ces contrôles négatifs peuvent être générés par transfectants cellules HEK 293 avec pAAV-Reporter, pHLP-Rep et pHelper (tableau 2) et sont utilisés pour réduire les faux positifs.

DNase j’ai a été largement utilisé comme une nucléase dans tache point et des essais de qPCR-basé pour le dosage de l’AAV pour enlever résiduelle plasmide DNAs et non emballés génomes viraux qui ont contaminé des préparations AAV. Ces contaminants autrement conduirait à une surestimation des titres ; par conséquent, la digestion de la nucléase est une étape très importante pour quantifier avec précision les titres de génome viral. DNase I enzymes sont disponibles auprès de divers fabricants et fournisseurs commerciaux ; Toutefois, l’importance de la sélection de la DNase I dans la quantification de l’AAV semble ont été sous-estimés. Afin d’étudier comment le choix de la nucléase pourrait affecter les résultats de l’essai de tache de dot, les trois nucléases suivants ont été comparés pour leur capacité à éliminer les signaux de fond des AAV vecteur contenant culture médias préparé comme indiqué ci-dessus en étapes 2 et 3 : DNase I Enzyme A, DNase I Enzyme B et S. marcescens endonucléase (Table des matières). Des études publiées ont utilisé la DNase deux anciens j’ai enzymes13,21,22,23,24 et nous utilisons s. marcescens endonucléase dans précédente et actuelle études. A notre grande surprise, il a été identifié qu’enzymatique DNase I A n’est pas du tout un choix approprié pour le dot blot dosage utilisant le support contenant le virus dans les diverses conditions testées, ce qui entraîne des signaux ambiants de contrôle négatif, tandis que de la DNase I Enzyme B et S. marcescens endonucléase réduit efficacement les signaux de fond étant de la DNase I Enzyme B ~ 2 fois plus efficace que le S. marcescens endonucléase (Figure 3 a, B). DNase I Enzyme C s’est avéré aussi très efficace pour réduire les signaux de fond (données non présentées). Ces résultats démontrent qu’il existe des différences significatives dans l’activité enzymatique chez les nucléases disponibles dans le commerce lorsque les réactions enzymatiques sont effectuées dans des préparations non-purifiées de VAA bien que digestion nucléasique devrait être efficace lorsqu’il est un petit quantité de préparations virales purifiées est traitée selon une condition optimisée. Ainsi, ces données soulignent l’importance de la sélection correcte de la nucléase dans le test lorsque les préparations non-purifiées de VAA subissent un essai de tache ou qPCR dot quantitative.

Figure 1
Figure 1 : une analyse par transfert de point représentatif pour déterminer le titre d’un vecteur AAV CsCl purifié. (A) Double brin vecteur AAV2G9-CMV-GFP a été produit dans les cellules HEK 293 par une norme exempte d’adénovirus trois méthode de transfection de plasmide à grande échelle et purifié par deux séries d’ultracentrifugation gradient de CsCl, suivie de dialyse. 0,3, 0,1 et 0,03 µL du stock vecteur AAV purifié (effacé sur la colonne de droite) ont été soumis à l’essai par transfert point quantitatif en double exemplaire avec deux séries de normes d’ADN de plasmide dupliqué (MST). La tache a été hybridée avec une sonde marquée P GFP de 32(0,77 Ko), et l’image a été obtenue en utilisant une image de phosphore, système de balayage. (B) une courbe standard montrant la relation entre les quantités d’ADN plasmidique connus (ng-eq, axe x) et les intensités de dot (unité arbitraire (UA), axe des ordonnées). Les nombres sur l’axe des ordonnées ont été obtenus avec l’image de phosphore, système de balayage. R indique le coefficient de corrélation de Pearson. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : test de tache de point de croix-complémentation AAV VP3-PAA. Production de particules vecteur bicaténaire AAV-CMV-GFP a été testée pour les protéines VP3 de AAV5, AAV9 et Snake AAV en présence ou en absence de leurs AAPs apparentés ou en présence de l’AAPs d’origines hétérologues. (A), le test a été effectué dans un ensemble biologiquement dupliqué d’expériences (série A et série B) avec des temps d’incubation de 4 h avec l’endonucléase de s. marcescens , et le titre de vecteur AAV provenant de chaque combinaison a été déterminé par un point quantitatif Épongez la méthode décrite dans la section protocole. Chaque point représente les deux-tiers (les lignes 5 et 6, 66,7 %) ou deux-trentièmes (les lignes 7 et 8, 6,7 %) de l’ADN extraite chaque 200 µL de milieu prélevé les échantillons ou le témoin négatif. Le top quatre lignes (lignes 1 à 4) représentent deux séries de normes d’ADN plasmidique (STD 1 et 2 STD) effacés en deux exemplaires (p. ex., linéarisé pEMBL-CMV-GFP plasmide, qui est le plasmide utilisé pour la production de vecteurs AAV-CMV-GFP double-brin). La membrane de dot blot a été hybridée avec une sonde GFP marqué P 32. Le couple de points indiqués par les rectangles arrondis sont témoins négatifs. Les deux premières lignes (STD 1) proviennent de la partie inférieure de la tache d’origine mais ont été coupées et déplacés vers le haut sans modifier l’intensité de l’image pour afficher les deux normes de plasmide (STD 1 et 2 STD) côte à côte. Cette manipulation est indiquée par une ligne noire sur la figure. (B) titre Viral a été déterminé pour les combinaisons de VP3 et protéines PAA par le dot blot assay. Le graphique représente un ensemble biologiquement quadruplicated de données, deux du groupe A et deux d’une autre tache de point qui n’est pas affichée. Barres d’erreur indique moyenne +/-SD (n = 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : une comparaison des activités enzymatiques des nucléases différents dans des préparations non-purifiées de vecteur AAV. (A) A la tache point quantitative montrant l’efficacité de chaque traitement nucléase en éliminant les signaux de fond. Une préparation contenant du vecteur de AAV9-CMV-GFP bicaténaire (« vecteur de AAV9 ») et un « non-capside contrôle » ont été produites par transfection de cellules HEK 293 avec plasmide DNAs et soumis à l’essai. Le contrôle non-capside ne contenait pas de particules virales mais contenue exponentiellement amplifié les génomes de vecteur CMV-GFP non emballés. MgCl2 a été complété à une ou trois fois les montants recommandés (6 mM et 18 mM pour la DNase I Enzyme A ; et 2,5 mM et 7,5 mM pour la DNase I Enzyme B) sans prendre en compte les 0,8 mM MgSO4 présente dans le milieu. Pour le traitement avec l’endonucléase de S. marcescens , seule condition décrite dans la section protocole a été mis à l’essai. Tous les échantillons ont été traités avec chaque nucléase pendant 1 h. La membrane de dot blot a été hybridée avec une sonde GFP marqué P 32. Les droite deux colonnes (STD 2) sont de gauche à droite de la tache d’origine mais ont été coupées et déplacés vers la droite sans modifier l’intensité de l’image pour afficher les deux normes de plasmide (STD 1 et 2 STD) côte à côte. Cette manipulation est indiquée par une mince ligne noire sur la figure. Points (B) dans les échantillons de contrôle non-capside en groupe A sont quantifiés et affichés comme moyenne ± | chaque valeur — valeur moyenne |. Sept des 12 échantillons traités par la DNase I Enzyme A (indiqué par un astérisque) affichent des valeurs seulement légèrement supérieurs à la norme plus élevée ; par conséquent, ils sont inclus dans ce graphique pour la comparaison. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Serratia marcescens Endonucléase tampon
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Ajuster le pH 8,5 avec du NaOH 4 M.
mémoire tampon de protéinase K 10 x
100 millimètres de Tris-HCl pH 8,0
100 mM EDTA pH 8.0
5 % SDS
2 x Solution alcaline
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175,3 g NaCl
88,2 g Sodium citrate tribasique (Na3C6H5O7)
Solution de Denhardt 100 x (50 mL)
1 g d’albumine sérique Bovine (fraction V) Remarque : Le filtrage est essentiel afin d’enlever les petites particules qu’ils causent des signaux d’hybridation de fond.
g 1 Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidone
Dissoudre dans 20 mL d’eau dans un bain-marie à 55 ° C.
Ajuster le volume final à 50 mL.
Stériliser à la filtration avec un filtre de 0,22 µm.
Tampon d’hybridation
1 % SDS NOTE : Tampon d’hybridation en magasin à 4 ° C et faire chauffer jusqu'à 65 ° C dans une eau bain à avant utilisation.
6 x SSC
5 x Solution de Denhardt
10 mM Tris-HCl de pH 8,0
Tampon de lavage
0,1 SDS %
0,1 x SSC
Solution de polyéthylènimine (PEI) (1 mg/mL, 500 mL)
Ajouter 500 mg PEI dans 450 mL d’eau et remuer. Remarque : Pour une conservation plus longue,-80 ° C est recommandée.
Ajouter HCl concentré pour amener le pH vers le bas pour < 2.0 pour dissoudre PEI (environ 800 µL de HCl sera demandée).
Ajouter 10 M de NaOH pour amener le pH à 7.0 (environ 500 µL de 10 M de NaOH sera demandée).
Réglez le volume à 500 mL d’eau.
Stériliser à la filtration avec un filtre de 0,22 µm.
Aliquote et conserver à-20 ° C.
Phénol-chloroforme (mélange 1:1) pour quantitative dot-blot
Ajouter le tampon saturée phénol (pH 8,0) et chloroforme à un ratio de 1:1 dans un tube conique polypropylène de 50 mL. Remarque : La mémoire tampon couvrant la couche organique, si laissée dans le tube, peut être reportée dans des tubes de l’échantillon par le biais de pipetage et peut rendre le test inexact.
Vortex le tube vigoureusement pour mélanger.
Permettre la séparation des phases par centrifugation et retirez complètement la couche aqueuse.
Conserver à 4 ° C.

Tableau 1 : Solution et recettes tampon. Recettes pour des solutions et tampons nécessaires pour compléter le point quantitatif blot protocole.

Plasmide AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Contrôle négatif (μg) Contrôle de transfection (μg)
CMVp-AAVx-VP3 0,4 0,4
CMVp-drapeau-AAPx 0,4
pAAV-journaliste 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
CMVp (vide) 0,4 0,8
CMVp-GFP 2.0
Total 2.0 2.0 2.0 2.0

Tableau 2 : combinaisons de plasmide pour analyse de croix-complémentation AAV VP3-PAA effectué dans un format de plaque 6 puits. Combinaisons du plasmide DNAs à utiliser pour la transfection de cellules HEK 293 dans chaque groupe expérimental sont indiqués. CMVp-AAVx-VP3, un plasmide exprimant des sérotypes d’AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) protéine VP3 sous le renforceur de CMV-IE-promoteur ; CMVp-drapeau-AAPx, un plasmide exprimant des sérotypes d’AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) protéine PAA sous le renforceur de CMV-IE-promoteur ; pAAV-Reporter, un plasmide qui a deux répétitions terminales AAV2 inversé (RTI) et est conçu pour la production de vecteurs AAV recombinante ; pHLP-Rep, un plasmide exprimant la protéine AAV2 Rep ; pHelper, un plasmide de helper adénovirus ; CMVp (vide), un plasmide vide ajouté pour contrôler les conditions expérimentales ; CMVp-GFP, un plasmide exprimant un gène marqueur de fluorescence (p. ex., GFP) pour vérifier la transfection réussie. Transfections sont déroulent dans les plaques 6 puits et utilisent un total de 2 µg de plasmide DNAs.

Mélange A Pour 10 tubes (μL)
Serratia marcescens Endonucléase tampon 91.2
0,1 NaOH M 8.8
Total 100
Mix B Pour 10 tubes (μL)
Serratia marcescens Endonucléase tampon 91.2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonucléase (250 unités/μL) 0,176
Total 100
Mix C Pour 10 tubes (μL)
mémoire tampon de protéinase K 10 x 400
Protéinase K (20 mg/mL) 100
H2O 1 300
Total 1 800
Mix D Pour 10 tubes (μL)
100 % éthanol 8 000
Acétate de Sodium 3M (pH 5,2) 320
Glycogène Oyster (20 mg/mL) 10
Total 8 330

Tableau 3 : liste des réactifs de mélange principal. A de Mix et Mix B sont utilisés pour le traitement de l’endonucléase de S. marcescens à l’étape 3.2. Ces deux mélanges convient séparément afin d’éviter la précipitation de l’hydroxyde de magnésium. C Mix est utilisé pour le traitement de la protéinase K à l’étape 3.3. Mix D est utilisé pour la précipitation d’éthanol à l’étape 3.4.3. Les volumes indiqués dans le tableau sont pour mélange maître réactifs pour 10 tubes.

Norme de l’ADN de plasmide (ng) Volume (µL) de 25 pg/µL plasmide ADN solution Volume (µL) d’eau Total volume (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0,625 75 525 600
0,313 37,5 562,5 600
0,156 18,8 581,2 600
0,078 9.4 590.6 600
0,039 4.7 595.3 600

Tableau 4 : normes d’ADN plasmidique Quantitative dot blot. Les volumes nécessaires de 25 pg/µL de solution standard de l’ADN plasmidique et eau ou TE d’élaborer des normes de l’ADN de plasmide de dilutions en série double (600 µL/tube) sont indiquées. Les nombres dans la colonne standard de l’ADN de plasmide (0,039 à 5 ng) correspondent à la quantité d’ADN dans 200 µL de chaque solution standard d’ADN plasmidique.

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Discussion

Dans ce rapport, l’utilité des quantitatifs dot blot dosages pour étudier AAPs AAV et leur rôle dans l’assemblage de la capside est décrite. Connaissances acquises grâce à ces études peuvent fournir un aperçu détaillé les différences innées dans le processus de montage de capside AAV et le rôle fonctionnel de l’AAPs entre sérotypes différents. À cet égard, le point de croix-complémentation AAV VP3-PAA blot assay a révélé que Snake AAV VP3 affiche une dépendance stricte sur la co-expression de ses apparenté PAA pour l’assemblage de la capside et que Snake PAA ne favorise pas les assemblage de la capside des sérotypes hétérologues . Cette observation est intrigante car l’AAV PAA dépendant des sérotypes qui ont été précédemment étudiées (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 et 12) sont tous capables de traiter l’Assemblée au moins dans une certaine mesure en utilisant un hétérologue AAP6.

Hybridation quantitative point ou la fente est une méthode traditionnelle pour le dosage des acides nucléiques contenus dans des échantillons multiples en même temps dans une manière commode de25. La méthode avait été utilisée pour le dosage de l’ADN et l’ARN jusqu'à qPCR s’est répandue dans les années 199026,27. Bien que qPCR a des avantages sur les tache point quantitatif et autres tests basés sur l’hybridation dans cette qPCR présente une sensibilité plus élevée et une plage dynamique plus large, elle comporte aussi un risque inhérent d’exponentiellement augmentant les erreurs sans le savoir, qui était le cas pour les titres des stocks de vecteur AAV déterminés par qPCR13,23. Quantitative dot blot dosages sont facilement mis en place avec un coût peu coûteux et facilement effectuées tant que les chercheurs ont accès à un système d’imagerie moléculaire quantitatif qui peut acquérir des signaux de dot blot membranes hybridés avec soit une sonde radioactive ou une sonde chimioluminescente ou fluorescente non radioactif. Bien que ce protocole utilise 32sondes radioactives marquées P pour la détection du signal, d’autres utilisent avec succès des sondes d’ADN non radioactifs directement marquées avec une phosphatase alcaline thermostable commercialement disponible28. Dot blot essais utilisent un principe simple et le dosage en soi ne pose un défi technique pour les artistes interprètes ou exécutants ; par conséquent, les résultats sont généralement reproductibles même par des personnes inexpérimentées.

Outre les applications décrites ici, nous utilisons systématiquement une version simplifiée et accélérée, procédure de tache du point qui peut rapidement les particules d’AAV semi quantifier. Avantages des tests de dot blot dans ce contexte comprennent : (1) l’essai ne nécessite pas de purification ou d’amplification enzymatique des génomes viraux qui prend des heures, (2) une combinaison de chaleur et de dénaturation alcaline est suffisante pour briser les particules AAV dans un échantillon solution et libération dénaturé génomes viraux dans la solution qui sont prêts à se lier à une membrane de tache de dot et (3) la présence de sel à la puissance maximum des concentrations dans les échantillons n’affecte pas significativement les résultats de titrage. Par exemple, il est possible de quantifier les particules AAV dans des solutions riches en CsCl (p. ex., fractions obtenues par ultracentrifugation en gradient de densité CsCl) en mettant une petite portion (≤ 10 µL) d’échantillons dans 100 µL de Solution alcaline, chauffage à 100 ° 1 x C pendant 10 min et transfert sur une membrane avec ou sans normes préparées à l’avance, suivies d’une hybridation de 15 min, min 3 x 3 lavages et l’exposition à un écran pendant 15 minutes-images au phosphore (ou plus longtemps lors de l’utilisation d’une sonde avec une diminution radioactivité). L’ensemble de la procédure peut être complétée en 1 h une fois que l’utilisateur se familiarise avec la procédure. Nous utilisons cette méthode accélérée, ce que nous appelons habituellement « bouillante dot blot méthode », pour identifier les AAV fractions CsCl riches en particules au cours de la purification de vecteurs processus et déterminer approximativement les titres des stocks de vecteur AAV purifiées avant de commencer le vaste procédés pour la caractérisation de vecteur. Ainsi, bien que le dot blot essais pourraient être considérées comme une méthode désuète pour quantifier les acides nucléiques et ont déjà été remplacées par diverses méthodes basées sur la PCR dans un large éventail de disciplines scientifiques, il y a encore un certain nombre d’avantages à cette méthode que si faire les chercheurs à envisager d’employer il dans leurs laboratoires.

L’étape la plus critique dans le protocole est le traitement de la nucléase d’échantillons. Si cette étape n’est pas effectuée dans un état optimal, il provoquerait des signaux ambiants. Nous utilisons S. marcescens endonucléase tandis que DNase j’ai enzymes de différentes sources sont largement utilisés dans d’autres laboratoires pour la quantification de l’ADN virale. La DNase I d’origine bovine pancréas a été plus largement utilisé par les chercheurs. C’est en partie parce que la DNase pancréatique bovine, j’étais premier identifié et plus largement caractérisés biochimiquement29. La DNase I enzymes actuellement disponibles auprès de fournisseurs commerciaux sont produits à partir de différentes sources biologiques tels que Pichia pastoris (DNase I Enzyme A), la forme native purifiée à partir du pancréas bovin (p. ex., DNase I Enzyme B), et enzymes recombinantes produites dans une espèce de levure ou Escherichia coli (DNase I Enzyme C). Nous avons constaté que la DNase I enzymes de trois de ces différentes sources ont été utilisées dans les études de la quantification de vecteur AAV publiées ; Cependant, à notre connaissance, aucune des études précédentes ont étudié si les enzymes provenant de différentes sources sont tout aussi efficaces pour digérer les molécules d’ADN contaminants dans les préparations de vecteur AAV. Il est à noter que DNase I traitement pour des dosages de vecteur AAV est souvent réalisée dans des conditions non optimisé en raison de la présence des impuretés provenant des cellules et le milieu de culture. L’observation selon laquelle la DNase I Enzyme A est seulement partiellement actif dans le milieu de culture, que nous avons utilisé a des implications importantes dans la conception de l’analyse pour le dosage de vecteur AAV de qPCR et de la dot blot et avertit les chercheurs à ce sujet non identifié auparavant. À cet égard, S. marcescens endonucléase exprimée chez e. coli, est une endonucléase idéale non seulement pour la fabrication des vecteurs d’AAV, mais aussi pour le dosage de vecteur AAV. C’est parce que son activité enzymatique peut être conservée sur un large éventail de valeurs de pH et des concentrations des ions magnésium et des cations monovalents. Pour cette raison, et parce que S. marcescens endonucléase est environ 2 fois moins cher que la DNase I Enzyme B sur une base unitaire, nous préférons utiliser S. marcescens endonucléase en buvardage de dot quantitative systématique.

En résumé, quantitative dot blot dosages sont une procédure relativement simple qui peut facilement fournir des informations sur la capacité de produire des particules virales dans différentes conditions. Par rapport aux approches de titrage alternatives, telles que de qPCR, cette approche exige peu, sinon aucune, optimisation. Il peut également s’appliquer facilement à des vecteurs d’un sérotype et peut être utilisé pour le titre les deux simple et double-brin vecteurs sans modifier le protocole. Suite de transfections et récolte d’échantillons de contenant du vecteur AAV (milieu de culture et/ou de cellules), le protocole entier peut être complété en une journée, donc rapidement répondre aux questions sur la capacité de produire des particules virales de diverses conditions, y compris diverses combinaisons des protéines AAV VP3 et PAA. Quantitatives dot blots offrent un moyen de communication pour répondre à diverses questions sans réponse quant à des interactions de VP-PAA et leurs rôles dans l’assemblage de la capside dans une grande variété de différents sérotypes d’AAV et isolats.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Xiao Xiao à l’University of North Carolina at Chapel Hill nous remercions de nous avoir fourni le plasmide pEMBL-CMV-GFP. Nous remercions Christopher Cheng et Samuel J. Huang pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par Service de santé publique accorde (NIH R01 NS088399 et EY232113 T32).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

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Biologie numéro 136 Adeno-associated virus (AAV) Assemblée-activating protein (PAA) point de croix-complémentation quantitative blot assay titre viral la thérapie génique
Un essai de tache de Dot Quantitative pour AAV titrage et son utilisation pour l’évaluation fonctionnelle de l’Adeno-associated Virus activation Assemblée protéines
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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