Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

כתב יד זה פרטים של assay חשופה נקודה פשוטה עבור כימות של adeno-הקשורים וירוס (AAV) titers ויישומו ללמוד את התפקיד של הפעלת מכלול חלבונים (AAPs), שיעור הרומן של חלבונים נגיפיים שאינן מבניות נמצאו AAV כל אשר נגרמו מהזנים אליהם, בקידום ההרכבה של capsids נגזר cognate, heterologous AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

Abstract

בעוד adeno-הקשורים וירוס (AAV) מקובל כמו וקטור אטרקטיבי עבור טיפול גנטי, הוא משמש גם כמו וירוס מודל להבנת הביולוגיה וירוס. ב- הכבוד האחרון, התגלית האחרונה של חלבון AAV שאינן מבניות, כינה הרכבה-הפעלת חלבון (AAP), יש שופכים אור חדש על התהליכים המעורבים הרכבה של החלבונים capsid ויראלי סמנכ לתוך capsid. אמנם רבים AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם דרושה AAP להרכבה, לאחרונה דיווחנו כי AAV4, 5, 11 הם היוצאים מן הכלל. יתר על כן, אנחנו הראו כי AAPs, שהורכב capsids של אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה בתרגום כדי תאים subcellular שונים. זה הטרוגניות בלתי צפויה של תכונות ביולוגיות ותפקידים פונקציונלי של AAPs בין AAV שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מקפים תחתונים שהחשיבות של מחקרים על AAPs נגזר מגוונות אשר נגרמו מהזנים אליהם. כתב יד זה מפרט assay כתם של נקודה פשוטה עבור כימות AAV ויישומו להעריך AAP תלות, serotype ירידה לפרטים capsid ההרכבה. כדי להדגים את התועלת של assay חשופה זו נקודה, יצאנו לאפיין capsid הרכבה ותלות AAP AAV הנחש זוחל בעבר uncharacterized AAV, כמו גם AAV5, AAV9, אשר בעבר הוכחו להיות AAP-עצמאי, תלוי-AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם, בהתאמה. וזמינותו חשף כי הנחש AAV capsid הרכבה דורש AAP הנחש, לא יקודם על ידי AAPs מ AAV5 ו AAV9. וזמינותו הראה גם כי, שלא כמו רבים serotype נפוצות AAPs המקדמים הרכבה heterologous capsid על ידי הצלב-קומפלמנטציה, הנחש AAP אינו מקדם הרכבה של AAV9 capsids. בנוסף, אנו מראים כי הבחירה של נוקלאז משפיע באופן משמעותי את המדידה של נקודה חשופה וזמינותו, לפיכך, בחירת אנזים אופטימלית היא קריטית להערכת מוצלחת של AAV titers.

Introduction

וירוס Adeno-הקשורים (AAV) הוא וירוס קטן, שאינו אפוף, חד-גדילי DNA עם הגנום של 4.7 kilobases (kb). הגנום AAV מכיל מסגרות הקריאה הפתוחה (ORFs) על הגנים נציג , קאפ . בשנת 2010, חלבון nonstructural מזוהה בעבר מקודד על ידי ORF מסגרת-העביר +1 בתוך הגן קאפ AAV2 היה התגלה על ידי סונטג. et al. ומצא כדי לשחק תפקיד קריטי האסיפה החלבונים מונומר capsid סמנכ ל AAV2 לתוך נגיפי capsid1. חלבון זה הרומן נקראה האסיפה-הפעלת חלבון (AAP) התפקיד שהיא ממלאת בקידום capsid הרכבה1.

ORFs עבור AAP כבר מזוהה bioinformatically בתוך הגנום של כל parvoviruses הסוג של Dependoparvovirus, אך לא בתוך הגנום של וירוסים של סוגים שונים של הפרוו משפחה1,2. מחקרים פונקציונלי של חלבון זה הרומן התמקדו בתחילה AAP מן הטיפוס AAV2 (AAP2), אשר הקימה את התפקיד החיוני של AAP2 המיקוד חלבונים סמנכ ל unassembled גרעינון הצטברות, היווצרות לתוך באופן מלא התאספו3,1,capsids4. חוסר היכולת של capsids AAV2 להרכיב, בהעדר ביטוי AAP היה עצמאי מאושרות על ידי מספר קבוצות, כולל שלנו1,2,3,4,5 . מחקרים מאוחרים יותר על AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם 1, 8 ו- 9 לאשר את תפקיד מכריע של AAPs capsid הרכבה, כמו VP3 חלבונים מונומר של AAV1, 8, 9 היו מסוגלים ליצור של capsid שהרכבתם בהעדר ביטוי משותף של AAP2.

לאחרונה, דרך גישות הכוללות שימוש נקודה כמותיים כתם מבחני, חקרנו את היכולת של AAV1 12 VP3 מונומרים להרכיב לתוך capsids העדר ביטוי AAP ואת היכולת של AAP1 ל- 12 כדי לקדם את הרכבה של מונומרים VP3 מ heterologous אשר נגרמו מהזנים אליהם. מחקר זה גילה את AAV4, VP3 5, ו 11 מונומרים יכולים להרכיב ללא AAP. בנוסף, זה היה נמצא כי 8 מתוך שנים עשר AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם שבדקנו (קרי, כולם חוץ AAP4, 5, 11, 12) מוצג בעל יכולת רחבה כדי לתמוך capsid הרכבה של heterologous capsids serotype AAV, בעוד AAP4, 5, 11 ו- 12 מוצגים באופן משמעותי יכולת מוגבלת בזה כבוד6. אלה ארבע אשר נגרמו מהזנים אליהם נמצאים רחוק phylogenetically אחרים AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם2,3. יתר על כן, המחקר חשף הטרוגניות משמעותי בהגרסא המקומית subcellular של AAPs שונים6. יתר על כן, המחקר הראו כי איגוד חזק AAP ועם שהורכב capsids גרעינון, סימן ההיכר של AAV2 capsid הרכבה, לא בהכרח ניתן להרחיב אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם כולל AAV5, 8, 9, המציגים החרגת nucleolar שהורכב capsids6. לכן, המידע שנרכש מתוך המחקר של כל serotype מסוים AAP אינה ישימה בהרחבה כל AAP לביולוגיה. הטבע תמוה כזה לביולוגיה AAP מדגיש את הצורך לחקור את תפקיד והתפקוד של כל AAP מ הקנוני והן קאנונית AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

התפקיד הביולוגי של AAP בהרכבה capsid יכול להיות מוערך על ידי קביעת שארוז מלא AAV נגיפי חלקיקים titers המיוצר כליה עובריים אנושיים (HEK) 293 תאים, הקו הסלולרי הנפוץ ביותר לייצור וקטור AAV, עם או בלי חלבון AAP ביטוי. השיטות הסטנדרטיות עבור כימות AAV הם ה-PCR כמותי (qPCR)-מבחני מבחני מבוסס7,8 ו- dot כמותי המבוסס על כתם9. שיטות נוספות AAV כימות חלקיק נגיפי כמו מקושרים-אנזים immunosorbent assay10,11 או מדידת צפיפות אופטית12 אינם אידיאליים עבור דוגמאות נגזר אשר נגרמו מהזנים רבים אליהם שונה AAV או דגימות מזוהם עם זיהומים (lysates גולמי או תרבות המדיה), לעתים קרובות הדגימות שימשו AAV מחקר. כיום, qPCR נמצא בשימוש נרחב ביותר עבור כימות AAV; עם זאת, הצורך להכיר פוטנציאליים אזהרות של וזמינותו מבוססי qPCR, כמו וזמינותו יכול לגרום כייל משמעותי הווריאציות13,14ושגיאות מערכתית. מבחני מבוססי ה-PCR מושפעים על ידי מספר פוטנציאלי משתנה מתערב גורמים, כגון הנוכחות של covalently סגורה מסוף סיכות בתבניות PCR המעכבות הגברה13. אפילו אדם מנוסה יכול להציג את הפוטנציאל גורמים מבלבלים לתוך מבוסס-qPCR assay ביודעין13. לעומת זאת, מבחני חשופה נקודה כמותית הם טכניקה קלאסית ביולוגיה מולקולרית אינו כרוך הגנום הגברה ומשתמש עיקרון פשוט עם סיכון מינימלי של שגיאות לעומת מבחני מבוסס qPCR. השיטה זו פחות מבחינה טכנית מאתגר; לכן, התוצאות assay הן לשחזור באופן סביר אפילו על ידי אנשים חסרי ניסיון.

בדו ח זה, אנו מתארים את הפרטים מתודולוגי של נקודה כמותיים חשופה assay באופן שגרתי להשתמש עבור כימות וקטור AAV ואנו מספקים דוגמא של איך ליישם את הבדיקה כדי ללמוד את תפקיד קידום מכלול AAPs במשותף אשר נגרמו מהזנים אליהם (AAV5 ו- AAV9), בעבר uncharacterized AAP מן הנחש AAV14. בטבע, סמנכ ל AAV חלבונים וחלבונים AAP מבוטאים חבר העמים של גן יחיד (קרי, סמנכ ל- AAP cis-קומפלמנטציה), ואילו בוזמינותו המתוארים כאן, סמנכ ל ו- AAP חלבונים מסופקים טרנס מ בשני פלסמידים נפרדות (כלומר, סמנכ ל- AAP טרנס-קומפלמנטציה). מאז ניתן לבטא כל חלבון סמנכ ל או AAP מ אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה מן כל פלסמיד עצמאית, הוא הופך אפשרי לבדוק heterologous שילובים סמנכ ל- AAP להרכבה capsid (קרי, סמנכ ל- AAP קרוס-קומפלמנטציה). בקצרה, AAV VP3 מ שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מתבטא בתאים HEK 293 מאת פלסמיד תקנים דנ א כדי לארוז של הגנום וקטור AAV ב נוכחות או היעדרות של serotype cognate של AAP, או בנוכחות של serotype heterologous AAP. בעקבות הפקה, תקשורת תרבות, lysates תא נידונים assay כתם נקודה לכמת את הגנום הנגיפי בתוך הקליפה capsid. השלב הראשון של וזמינותו חשופה נקודה הוא להתייחס דגימות עם נוקלאז להסיר מזהמים פלסמיד DNAs ואת הגנום AAV unpackaged בדגימות. כך להגדיל את האותות רקע בפרט כאשר דגימות ולזרימה הם לבדיקה. זה ואז ואחריו טיפול פרוטאז כדי לשבור את capsids ויראלי ונשחרר הגנום הנגיפי עמידים נוקלאז פתרונות לדוגמה. הגנום הבא, נגיפי שפגע בסימני, מחק על קרום, hybridized גשש DNA ספציפיים גנום ויראלי עבור כימות. ב וזמינותו דוגמה דיווחו כאן, נדגים כי הנחש AAV VP3 דורש הנחש AAP להרכבה capsid ולקדם כי הנחש AAP לא ההרכבה של AAV9 capsids בניגוד רבים AAPs נגזר אשר נגרמו מהזנים אליהם תלויי-AAP יכולה לקדם גם הרכבה של heterologous serotype capsids. לבסוף, אנחנו מדווחים על הקונה חשוב qPCR או נקודה מבוססי חשופה AAV כימות assays כי הבחירה של נוקלאז משפיעה באופן משמעותי על תוצאות וזמינותו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: מתכונים פתרונות של מאגרים עבור פרוטוקול זה הינם מסופקים בכל טבלה 1. הפרוטוקול המתואר להלן הוא סמנכ ל- AAP קרוס-קומפלמנטציה נקודה חשופה וזמינותו ללמוד את התפקידים של החלבונים AAP capsid ההרכבה. שיטת העבודה וזמינותו חשופה כמותיים נקודה כללית יותר עבור טיטור וקטור AAV מטוהרים מוסבר במקטע תוצאות נציג .

1. בניית VP3 AAP, נציג AAV2 לבטא פלסמידים

  1. בנייה של pCMV-AAVx-VP3 (x. אשר נגרמו מהזנים = אליהם)
    1. PCR-להגביר ORF VP3 כולה (1.6 kb) באמצעות פולימראז ה-DNA של אמינות גבוהה והזוג פריימר הבאים: VP3 קדימה, CTAA-RE1-CACC-N25 (25 קודם נוקלאוטידים של ORF VP3); VP3 הפוכה, TCTT-RE2-N25 (נוקלאוטידים 25 אחרונה של ORF VP3).
      הערה: RE1 ו- RE2 הם אתרים עבור אנזימי הגבלה (במיל ') לקראת שיבוט. CTAA, TCTT טרמינל 5', 3' tetranucleotides הוסיף כדי להקל על עיכול אנזים הגבלה לקראת סוף שני גדילי ה-DNA. CACC הוא רצף קונצנזוס קוזאק.
    2. לשכפל את המוצרים RE-digested PCR בין המתאימה RE באתרים של וקטור ביטוי בתרבית של העושה את האדם cytomegalovirus מיד מוקדם-(CMV-IE) משפר-יזם עבור ביטוי ברמה גבוהה.
      הערה: לקראת שיבוט מולקולרי, לעכל 5 µg של ה-DNA של עמוד השדרה פלסמיד עם restriction enzyme(s)-ריכוז של DNA 4 U/µg לשעה בטמפרטורה האופטימלית. עבור ה-PCR שברים, להגדיל את היחידות של אנזימים בשימוש (למשל, U 10/µg של המוצר VP3 ORF PCR 1.6 kb), זמן הדגירה ארוך יותר (למשל, 4 שעות) בשל עלייה של מספר אתרי זיהוי אנזים הגבלה עבור אורך יחידה. מידע שימושי ביולוגיה מולקולרית אנזימים ונהלים שיבוט כולל חיידקי השינוי ניתן למצוא במקום אחר15,16,17.
  2. בניית pCMV-דגל-AAPx (x. אשר נגרמו מהזנים = אליהם)
    1. PCR-להגביר כולו ORF AAP (0.6 kb) למעט חומצת אמינו הראשונה ביותר באמצעות פולימראז ה-DNA של אמינות גבוהה והזוג פריימר הבאים: AAP קדימה, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (נוקלאוטידים 25 מ נוקלאוטיד הרביעית ב AAP ORF); AAP הפוכה, TCTT-RE2-N25 (נוקלאוטידים 25 אחרונה של ORF AAP).
      הערה: GACTACAAGGACGACGATGACAAA קודי תג דגל, אשר הוכח יש4,אין השפעות מזיקות5 אבל יכול להיות מושמט אם מיותרים.
    2. לשכפל את המוצרים RE-digested PCR בין האתרים המתאימים של וקטור בתרבית של ביטוי עם ה CMV-IE enhancer-מקדם15,16,17.
  3. בניית pHLP-נציג
    1. Digest 5 µg של פלסמיד pAAV-RC2 (7.3 kb) עם 20 יחידות כל אחד של Xho ו- Xcm, ולטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי או על-ידי מיצוי פנול-כלורופורם.
      הערה: פינוי 1.8 kb Xho אני-Xcm שאני קטע מ- 7.3 kb pAAV-RC2 פלסמיד התוצאות בהפסד של capsid סמנכ ל ביטוי חלבון תוך שמירה על הביטוי נציג חלבון.
    2. ה-DNA בוטה מסתיים עם 6 יחידות של T4 DNA פולימראז, agarose ג'ל-לטהר את מקטע ה-DNA 5.5 kb, ואת עצמי מאתרים ומפסיקים את המקטע מטוהרים בעזרת 50 ל- 100 ננוגרם של DNA ו 400 יחידות של T4 DNA ליגאז לפי המלצה של היצרן15.
    3. בצע את ההליך טרנספורמציה חיידקית הרגיל הפניה בשלב 1.1.2 הערה.
  4. ודא שפלסמיד בונה על ידי אנזים הגבלה לעיכול, רצף15,18.
  5. לבצע פלסמיד minipreps או maxipreps באמצעות ערכות זמינים מסחרית כדי להשיג כמות מספקת של פלסמיד DNA עבור הניסויים ייצור AAV במורד הזרם.

2. הפקת AAV ב HEK 293 תאים על-ידי פלסמיד DNA תרביות תאים (Cross-קומפלמנטציה Assay)

  1. התרבות התאים HEK 293 של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM)-גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין & מיקס סטרפטומיצין, ו- 1 מ מגלוטמין, חממה 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
    הערה: AAV titers להשתנות באופן משמעותי בהתאם לסוג מקור התאים HEK 293.
    התראה: למרות AAV יכולים להיות מטופלים ב אבטחה ברמה 1 (BSL1) בלימה, בלימה מומלץ לעבודה תא HEK 293 BSL2.
  2. יום-1 (24 שעןת לפני תרביות תאים), צלחת 6 – 7 x 105 HEK 293 תאים/טוב ב- 2 מ"ל של המדיום מלאה שמתואר בשלב 2.1 ב- plate(s) 6-ובכן. זה בדרך כלל משיג ~ 90% confluency למחרת.
  3. יום 0: תקנים
    1. לקראת ה-DNA תרביות תאים
      1. ודא כי התאים הגיעו ~ 90% confluency.
      2. לחמם DMEM בתוספת עם 1% פניצילין & סטרפטומיצין מיקס 1 מ"מ-גלוטמין אבל בלי 10% FBS (קרי, ללא סרום בינוני) בתוך אמבט מים 37 º C.
      3. לאפשר את הפתרון polyethylenimine (פיי) לטמפרטורת החדר.
    2. הכנת תערובת דנ א פלסמיד
      1. מערבבים את פלסמידים ב 96 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא CaCl2 או MgCl2 צינורות microcentrifuge mL 1.5 סטרילי כמצוין בטבלה מס ' 2. הסכום הכולל של ה-DNA הוא µg 2/טוב.
        הערה: אמצעי האחסון לפתרון ה-DNA פלסמיד יכול להתעלם אם הן תקינות. כוונון עוצמת הקול מומלץ אם הנפח הכולל של פתרונות ה-DNA של פלסמיד ≥ 10 µL.
    3. פיי תרביות תאים
      1. להוסיף 4 µL של פיי פתרון (1 מ"ג/מ"ל) לתערובת דנ א פלסמיד-PBS (להכין לעיל). עוצמת הקול הסופי הוא כ 100 µL (5% נפח של המדיום תרבות). וורטקס הצינורות בקצרה דגירה התערובת DNA: פיי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. בעת שחיכה הדגירה 15 דקות להשלים, החלף המדיום תרבות prewarmed בינונית ללא סרום שמתואר בשלב 2.3.1.2.
      3. פעם 15-מין הדגירה של ה-DNA: פיי תערובת השלמת בקצרה לסובב את הצינורות עם microcentrifuge כדי לאסוף את הנוזל לתחתית של הצינורות, להוסיף את התערובת DNA: פיי dropwise המדיום תרבות בבאר בכל צלחת תרבות HEK 293. בעדינות להתסיס את הצלחות ולהחזיר אותם חממה 37 ° C עם 5% CO2.
      4. לשמור על התאים במדיום הזה תרביות תאים עד הקציר-5 יום (ללא שינוי בינוני זה נדרש).
  4. על יום 1 ו- 2 ביום, להתבונן תאים transfected עם pCMV-GFP פלסמיד תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך כדי להעריך את יעילות תרביות תאים.
    הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, כאן הוא 10 X / 0.25 מפתח נומרי המטרה בשילוב עם עינית 10 × היה בשימוש, ואת 450 – 490 nm עירור bandpass מסנן ומסנן 515-565 nm bandpass פליטה הועסקו. התנאי הנ ל בדרך כלל מניבה יותר תקנים 70% יעילות. תאים עשוי להפגין כמה שינויים מורפולוגיות (למשל התאים הפכו להיות רזה) בשל מצבו ללא סרום.
  5. ימים 3-5, להמשיך התרבות התאים transfected חממה 37 ° C עם 5% CO2.
  6. יום 5, לאסוף תאים והן בינוני המכיל וירוס לתוך צינורות חרוט פוליפרופילן 15 מ"ל pipetting למעלה ולמטה או על ידי גירוד עם המגרד התא.
  7. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

3. נקודה Assay כתם על כימות AAV

  1. שחזור של נגיפים
    1. במהירות להפשיר הצינורות קפוא בתוך אמבט מים 37 º C. וורטקס צינורות נמרצות במשך 1 דקה למקסם את ההתאוששות של AAV מתאי.
    2. גלולה ההריסות תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 3,700 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לקחת 200 µL של תגובת שיקוע מהצינור כל והעבר אותו לתוך צינור microcentrifuge שכותרתו עם כובע בורג עבור נקודה חשופה וזמינותו.
      הערה: Aliquot תגובת שיקוע הנותרים לתוך microcentrifuge צינורות ולאחסן אותם קפואים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. . הנה, צינורות פוליפרופילן microcentrifuge מחוברת עם מזרקי, o-ring שימשו. איטום צר נדרשת כדי למנוע נשפך AAV, פנול-כלורופורם.
  2. הטיפול עם סרישיה marcescens endonuclease
    1. להכין תערובת A ו- B מיקס ריאגנטים (טבלה 3). להוסיף 10 µL של A מיקס 10 µL של מיקס B לתוך כל שפופרת. מערבולת הצינורות עבור 5 s, בקצרה ספין הצינורות לאיסוף הנוזל לתחתית של הצינורות של דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס לפחות לשעה.
      הערה: מיקס A מכיל NaOH וממטבת את ה-pH לטיפול עם ס' marcescens endonuclease. מיקס B תוספי מגנזיום. ריכוז של ס' marcescens endonuclease במלאי זמין מסחרית אנזים עשוי להשתנות. הנפח של ס' marcescens endonuclease צריכה תיקון בהתאם לעשות 200 U/mL לאחר הוספת מיקס A ו- B לערבב לתוך צינורות בשלב 3.2.1.
      הערה: זמן דגירה ארוך יותר, עד כדי 4h, יכול להפחית רקע אותות.
    2. בסוף הדגירה, בקצרה לסובב את הצינורות באמצעות צנטריפוגה benchtop לאסוף עיבוי והפתרון מן החלק העליון והחלק צדי הצינורות.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C או-80 מעלות צלזיוס.
  3. טיפול proteinase K
    1. להכין תערובת C הכימית (טבלה 3). הוסף µL 180 של מיקס C לתוך כל שפופרת. וורטקס צינורות 5 s, בקצרה לסובב את הצינורות ואת דגירה הצינורות ב 55 ° C עבור 1 h.
      הערה: EDTA ב הכימית מיקס C chelates יוני מגנזיום חינם, חלבונית endonuclease ס marcescens .
    2. בסוף הדגירה, לאפשר דגימות לטמפרטורת החדר, בקצרה לסובב את הצינורות באמצעות צנטריפוגה benchtop לאסוף עיבוי והפתרון מן החלק העליון והחלק צדי הצינורות.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C או-80 מעלות צלזיוס. כדי לחדש את הפרוטוקול, דגירה הצינורות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות להמיס גבישים מרחביות הכלולים במאגר לחלוטין.
  4. משקעים החילוץ ואתנול פנול-כלורופורם
    1. להוסיף 200 µL של פנול-כלורופורם דגימות ו מערבולת אותם דק 1 לסובב את דוגמאות microcentrifuge-≥16, 100 גרם x ≥5 דקות בטמפרטורת החדר.
      התראה: פנול-כלורופורם וצריך לטפל בשכונה fume כימי עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; כלומר, nitrile כפפות, משקפי מגן או מגן הפנים, חלוק המעבדה עם שרוולים ארוכים).
    2. העברת µL 320 של השכבה המימית (160 µL פעמיים עם פיפטה P200) צינור microcentrifuge רגיל (80% נפח נוזלים מימית).
      הערה: זה חשוב מאין כמותו לקחת באותו אמצעי אחסון של תמיסה מימית בין דגימות, אחרת וזמינותו מאבד דיוק כמותית.
    3. להכין תערובת D הכימית (טבלה 3). הוסף µL 833 של מיקס D לתוך כל שפופרת. וורטקס צינורות 5 s, דגירה הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך ≥ 20 דקות.
      הערה: מיקס D הוא תערובת של אתנול, סודיום אצטט גליקוגן עבור אתנול נוח משקעים של ה-DNA. דוגמאות שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס בשלב זה, הפרוטוקול יכולה להתחדש מאוחר יותר.
    4. צנטריפוגה דגימות של microcentrifuge-≥16, 100 גרם x ב 4 ° C עבור ≥15 מינימלית יוצקים את תגובת שיקוע, כתם פעם על מגבת נייר נקיה. מכניסים כ 500 µL של 70% אתנול כל שפופרת, מערבולת הצינורות 5 s ו צנטריפוגה הצינורות עם microcentrifuge benchtop-≥16, 100 גרם x ב 4 מעלות צלזיוס למשך דקות ≥5.
    5. יוצקים את תגובת שיקוע, כתם פעם על מגבת נייר נקיה. כדורי יבש-65 מעלות צלזיוס; כדורי יכולים להיות מיובש לחלוטין.
      הערה: אין להשתמש פיפטה כדי להסיר את עודף אתנול שנשאר אחרי סופג הצינורות. כדורי יכולים גם להיות מיובש בטמפרטורת החדר למשך הלילה. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, כדורי ה-DNA יבשים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים עם המכסה צינור סגור.
  5. Resuspension של ה-DNA הנגיפי במאגר טה
    1. להמיס את כדורי ה-DNA ב 120 µL כל מאגר טה ע י ניעור כל שפופרת למשך 30 דקות כדי 1 h בטמפרטורת החדר.
  6. נקודה חשופה
    1. הכנת תקנים דנ א פלסמיד
      1. לדלל AAV וקטור הגנום פלסמיד דנ א כדי 10 ng/µL במים או מאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.0). קח 25 µL של דילול זה תקציר עם אנזים ההגבלה המתאימה עבור h 1 כדי linearize את פלסמיד ה-DNA, באמצעי אחסון התגובה של 50 µL.
        הערה: נעשה ערכה משוכפלות של מערכת העיכול (ראה שלב 3.6.4.1). האנזים המתאים צריך להיות אחד שחותך את הדנ א פלסמיד מחוץ לאזור מחייב בדיקה חשופה נקודה. לנוחיותכם, ה-DNA פלסמיד מדולל יכול להיות aliquoted (25 µL/צינור) ומאוחסן קפוא ב-20 ° C לשימוש עתידי. לעכל את פלסמיד DNA בזמן הצינורות רועדות בשלב 3.5.1. לא יותר מדי לעכל את פלסמיד DNA סטנדרטי.
      2. להוסיף µL 450 מים או טה הצינור המכיל את פלסמיד מתעכל DNA סטנדרטי ומערבבים היטב. העברת µL 70 של תערובת זו 1.5 mL microcentrifuge צינור עם µL 1,330 מים או טה לעשות מדולל פלסמיד סטנדרטי (pg 25/µL).
      3. בצע בטבלה 4 כדי ליצור סדרת דילולים טורי כפולה (600 µL tube). לערבב את דילולים ביסודיות על ידי vortexing על 5 s.
    2. Denaturing של תקנים, דגימות ה-DNA נגיפי
      1. להוסיף 600 µL של 2 x אלקליין פתרון כל דילול סטנדרטי. מערבבים היטב בעזרת vortexing עבור Incubate ס' 5-10 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
      2. להוסיף 120 µL של 2 x אלקליין פתרון כל מדגם ה-DNA נגיפי. מערבבים היטב בעזרת vortexing עבור Incubate ס' 5-10 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. הגדרת המנגנון חשופה נקודה
      1. בעזרת מספריים, חותכים קרום סופג (למשל, זטה-בדיקה) לגודל המתאים עבור מספר דוגמאות ותקנים. משרים את הקרום עם מים למשך 10 דקות לפני הצבתו על מנגנון חשופה נקודה. מכסים בארות שאינם בשימוש על המנגנון ממברנה.
        הערה: להתמודד עם הקרום עם פינצטה נקי. כדי לכסות את וולס ריק, הגיליון הגנה כחול בהיר שמגיע עם הקרום יכול לשמש. אל תאפשר את הקרום להתייבש לפני מחייב דוגמאות ותקנים. לקבלת פרטים נוספים על הרכבה ועל השימוש המנגנון, נא עיין ידנית המשתמש19.
      2. מוסיפים מים לבארות אשר יהיה טעון דגימות. החל מים ואקום ומשוך באמצעות הבארות כדי לבדוק שגיאות ובדוק שוב כאשר קבוע. שידת ההחתלה את הברגים תוך יישום ואקום כדי להבטיח אטימה חזק.
        הערה: איטום לא שלם עשוי לגרום דליפה לדוגמה בין הבארות.
      3. ברגע מים לגמרי שרד, לשחרר את הואקום לחלוטין (קרי, סעפת ואקום להיות פתוחים לחץ אוויר).
    4. העמסת סטנדרטים ודוגמאות למכשירים חשופה נקודה
      1. חלות µL 400 של כל פלסמיד מדולל DNA רגיל מכל קידוח, להפעיל ארבעה נתיבים של דילולים סטנדרטי. השתמש שני aliquots נפרדים של התקציר סטנדרטי, לטעון כל הכפילויות. החל µL 200/טוב של כל מדגם ה-DNA נגיפי.
        הערה: שימוש של µL ~ 40 הנותרות של דגימות שפגע בסימני, מדולל יכול להיות מוכן (למשל, 10-fold דגימות מדולל באמצעות µL 20 מדגם בתוספת 180 µL 1 x פתרון אלקליין) ודוגמאות מחק במידת הצורך.
      2. החל ואקום עדין יעבור את פתרונות ה-DNA את הבאר.
        הערה: ואקום לחץ צריך להיות מותאם על ידי חלקית פתיחת שסתום-כיוונית כך הלחץ ואקום מוחלת על הנקודה כתם מכשיר, כמו גם האווירה (קרי, עם הזרועות צימוד מוצב כ 45 ° זווית איפה זה עושה רעש יניקה חזק יותר).
      3. פעם השתמשתי כל הבארות, לשחרר את הואקום על-ידי התאמת את השסתום משולשת. להוסיף µL 400 1 x פתרון אלקליין מכל קידוח שהכיל סטנדרטים ודוגמאות. המתן 5 דקות לפני ההחלה מחדש ואקום כדי לרוקן את הבארות.
      4. החל מחדש את הואקום באותה דרך (ראה שלב 3.6.4.2).
      5. לפרק את המנגנון חשופה נקודה תחת ואקום להסיר את הקרום, לשטוף אותו עם 2 x SSC. במקום הקרום על מגבת נייר נקי עם הצד DNA-מחויב כלפי מעלה כדי להסיר עודפי 2 x SSC.
      6. UV-crosslink דנ א blotted הקרום עם crosslinker UV מתאים; הקרום מוכן כעת של הכלאה.
        הערה: ממברנות רטוב יכול לשמש עבור UV crosslinking. מיובש, UV-תפור ממברנות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. מידע נוסף ניתן למצוא את הטבלה של חומרים.
  7. הכלאה של כביסה
    1. חממו המאגר הכלאה באמבט מים 65 ° C.
    2. Enzymatically תווית בדיקה DNA עם רדיואקטיבי α -32P dCTP, לטהרו באמצעות ערכות זמינים מסחרית על פי ההמלצה של היצרן.
      הערה: אנו משתמשים של 0.5 – 2.0 מכשיר בדיקה של אורך של אזור enhancer-יזם או חלבון-קידוד רצף הגנום הנגיפי kb. למרות פרוטוקול זה מנצל 32התווית על-ידי P רדיואקטיבי זונדי אות זיהוי, שאינו רדיואקטיבי chemiluminescent או פלורסנט רגשים יכול לשמש גם (עיין במקטע דיון ).
    3. את המקום הקרום בבקבוק הכלאה עם הצד מאוגד ל- DNA, יש לשטוף הקרום עם 5 מ"ל prewarmed מאגר הכלאה, ולמחוק את המאגר. להוסיף 10 מ ל מאגר הכלאה prewarmed ואז למקם את הבקבוק בתנור הכלאה מסתובב שוכן בגובה 65 ° C. סובב ≥5 דקות.
    4. חום-denature 20 µL של 10 מ"ג/מ"ל לכסנתם הרינג או זרע סלמון DNA פתרון והבדיקה 32התווית על-ידי P (≥ 107 cpm) למשך 5 דקות על ידי הנחת הצינורות על ערכה גוש חום ב- 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן snap-צ'יל אותם על קרח ≥2 דקות, בקצרה, ספין, לשמור על הקרח עד השימוש.
      התראה: עבור בדיקות DNA רדיואקטיבי, 1.5 mL צינורות עם פקקי בורג, o-ring יש להשתמש.
    5. להוסיף במהירות ה-DNA של הזרע שפגע בסימני ו בדיקה רדיואקטיבי למאגר הכלאה של הכלאה בקבוק, לנער את הבקבוק 10 s לערבב. להחזיר את הבקבוק לתנור 65 ° C, דגירה הבקבוק עם סיבוב ב 65 ° C עבור ≥4 h.
    6. לאחר סיום הכלאה, לעצור את הסיבוב, להסיר את הבקבוק הכלאה, ואז לשפוך את הפתרון בדיקה רדיואקטיבי לתוך צינור חרוטי 50 מ עם כובע ים עמיד בפני נזילה בחיבור. לאחסן את המכשיר במיכל המתאים מניחים במקרר המיועד בחומרים רדיואקטיביים.
      הערה: מאגר בשימוש הכלאה עם מכשיר בדיקה אשר מאוחסן ב 4 ° C מחדש ניתן לפחות 5 פעמים על ידי הנחת הצינור חרוט 50 מ עם כובע ים עמיד בפני נזילה בחיבור המכיל מאגר הכלאה באמבט מים 100 ° C למשך 5 דקות.
    7. לשטוף את הקרום עם מאגר לשטוף מחומם ל 65 ° C. להוסיף 20-30 מ של מאגר שטיפת הבקבוק הכלאה וסובב עבור 5 דק. חזור על זה לשטוף עוד 2 פעמים.
      הערה: למדוד רדיואקטיביות של שטיפת פתרונות ולתעד אותה במידת הצורך על ידי המכון המקומי.
    8. בעת שטיפת הקרום, המקום של זרחן הדמיה המסך על מחק תמונה במשך 5 דקות.
    9. לאחר לשטוף את השלישי, להסיר את הקרום מהבקבוק הכלאה, להסיר את מאגר עודף על הקרום עם מגבות נייר, ולמקם את הקרום מחזיק נייר פלסטיק שקוף. בדוק רדיואקטיבי אותות על קרום בעזרת מונה גייגר. חושפים את המסך פוספור נמחק הדמיה למוח 10 דקות ללון בהתאם עוצמת האות.
    10. סריקת המסך בעזרת תמונה פוספור סריקת המערכת ולקבל את הנתונים על עוצמת האות של כל נקודה.
  8. ניתוח נתונים
    1. צייר עיקול רגיל באמצעות גיליון אלקטרוני ונתונים ניתוח תוכנה (למשל, Excel).
      הערה: רגרסיה ליניארית יומן-יומן שימש כדי לצייר עיקול רגיל.
    2. לקבוע nanogram-שוות-ערך (ng-eq) עבור כל אחד דגימות ה-DNA נגיפי על ידי אינטרפולציה. Ng-eq הוא הכמות של פלסמיד הדנ א נהגה לצייר עיקול רגיל אשר מקבילה למספר של מולקולות DNA נגיפי. כאשר אורך פלסמיד ה-DNA הוא 8,000 bp, 1 ng-eq של חד-גדילי ה-DNA הנגיפי AAV מקביל 2.275 x 108 חלקיקים.
      הערה: ng-eq ניתן להמיר מספר נגיפים באמצעות המשוואות הבאות:
      Equation 1
      Equation 2
      מספר החלקיקים AAV מבוטא כמקובל "vg" (וקטור הגנום) או "DRP" (חלקיקי אני עמיד DNase).
    3. לחשב את AAV ריכוזי החומרים ההתחלתי. כי ה-DNA נגיפי blotted מייצג 66.7% Equation 3 של ה-DNA נגיפי בחומרי המוצא, 1 ng-eq מקביל 1.7 x 109 חלקיקים/mL Equation 4 .
      הערה: תיקון זה לא נחוצה אם כל ה-DNA הנגיפי הכלול חומר המוצא הוא מחק על קרום ללא הפסד (ראה איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאה נציג של נקודה כמותיים שהכלים עבור כימות של מניות וקטור AAV מטוהרים, המיוצר בקנה מידה גדול מוצג באיור1. עם assay חשופה נקודה זו, נקבע את כייל של מלאי וקטור AAV2G9-CMV-GFP גדילי כפול. וקטור היה טהור על ידי שני סיבובים של צסיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation צפיפות-הדרגה ואחריו דיאליזה כפי שתואר לעיל20. באופן כללי, עבור מניות מטוהרים AAV וקטור, שלושה כרכים שונים של כל מניה וקטור AAV (למשל0.3 µL, 0.1 µL, µL 0.03 נקודות) נחשפים להליך חשופה נקודה המתוארות לעיל כפילויות עם שינוי. DNase I אנזים A משמש במקום ס marcescens endonuclease בשלב 3.2, ומשמש ערכת זמינים מסחרית כדי לחלץ ולטהר את ה-DNA הנגיפי בשלב 3.4 (ראה טבלה של חומרים). בדוגמה המוצגת באיור1, שורטטו ערכי העוצמה אות (יחידה שרירותית) המתקבל כל פלסמיד DNA סטנדרטי (איור 1 א') נגד הכמויות DNA הידוע לצייר עיקול רגיל (איור 1B), מציג מתאם מקדם 0.998. משתמש זה עיקול רגיל, נקבע על ידי אינטרפולציה כי aliquots µL 0.3, 0.1, 0.03 נקודות של וקטור AAV2G9 הראו 1.487 ו 1.522 ng-eq (0.3 µL) 0.487 ו 0.507 ng-eq (0.1 µL), 0.158, 0.171 ng-eq (0.03 נקודות µL). זה נתן שישה הערכים הבאים: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 ו 5.700 ng-eq/µL עבור AAV2G9 המסוים הזה וקטור במלאי, שמוביל ממוצע של 5.16 ± 0.27 ng-eq/µL (זאת אומרת ± SD). מאז אורך פלסמיד משמש התקן (pEMBL-CMV-GFP) הוא 5,848 bp, כייל של וקטור AAV2G9 הזה היה נחוש בדעתו להיות 8.0 x 1011 vg/mL לפי משוואת 2 בשלב 3.8.2. זה וזמינותו חוזרת לפחות פעמיים כדי לקבוע את titers הסופית של AAV וקטור מניות.

תוצאה נציג של צלב-קומפלמנטציה מבחני כדי להעריך את התלות AAP VP3 capsid ההרכבה ואת היכולת של AAPs להרכיב חלבונים VP3 ממוצא heterologous מוצגת באיור2. במבחנה מחקרים של AAV לעיתים קרובות אינם דורשים וירוס טיהור להגיע למסקנות, ניסויים באמצעות וירוס ולזרימה תכשירים כגון גולמי תא lysates ומדיה תרבות המכיל וירוס מספיקים להניב תוצאות משמעותיות. בניסוי זה, ייצור חלקיקים נגיפיים AAV היה לאומדן מ AAV VP3-AAP כל השילובים האפשריים בין AAV5 AAV9, הנחש AAV לרבות שילובים AAP לא VP3 assay כתם נקודה כמותית. הדגימות שהתקבלו בקבוצת ניסוי המשוכפלת היו מחק ב 1 x ו- 10 x דילולים (set (מוגדרת) ו- B להגדיר ב- איור 2A, בהתאמה). הגרף שמוצג באיור 2B מסכם את ניתוח כמותי של הנקודות. התוצאות מציגות את זה: (1) AAV5VP3 מרכיב ללא קשר אם AAP היה בתנאי טרנס, (2) AAP5, AAP9 יכול לקדם AAV9VP3 capsid הרכבה למרות AAP5 פונקציות פחות יעיל מאשר AAP9, (3) לא AAP5 ולא AAP9 תערוכות הרכבה קידום פעילות על הנחש AAV VP3, ו (4) AAP הנחש מקדמת רק הרכבה של הנחש AAV VP3. (1) ו- (2) הם בקנה אחד עם תצפיות הקודמת6, אבל AAV ספציפי באופן ייחודי VP3-AAP התערבות AAV הנחש היא תגלית הרומן בניסוי זה. חולשה אחת של וזמינותו קרוס-קומפלמנטציה בהתבסס על נקודה כמותיים כתם הוא הפקד שלילי תמיד מראה רמות ניכר של אותות רקע זה לא יכול להיות לגמרי בוטלו. לכן, וזמינותו חשופה נקודה על ידי עצמו לא יכול לפסול את האפשרות הזאת capsid מרכיב לרמה שמתחת הרגישות של וזמינותו. בהקשר זה, ראוי לציין כי, כדי ליצור את פקדי שלילי, משמש תנאי תחת אילו AAV הגנום ויראלי בצורה אקספוננציאלית שכפל בהיעדרו של capsid החלבון VP3. פקדים שלילי כזה יכול להיווצר על-ידי transfecting HEK 293 תאים עם הכתב pAAV, pHLP-נציג pHelper (טבלה 2), משמשים כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות.

DNase אני כבר בשימוש נרחב כמו נוקלאז נקודה חשופה, המבוסס על qPCR מבחני עבור כימות AAV להסיר פלסמיד שיורית DNAs ואת הגנום הנגיפי unpackaged כי יש מזוהמים AAV ההכנות. האלה מזהמים אחרת תוביל הערכה מופרזת של titers; לכן, העיכול נוקלאז הוא צעד חשוב מאוד מדויקת לכימות תנועת titers גנום ויראלי. DNase אני אנזימים זמינים שונים יצרנים וספקים מסחרי; עם זאת, החשיבות של בחירת DNase אני בכימות AAV נראה כי יש כבר לא מוערך. כדי לבדוק כיצד הבחירה של נוקלאז עשויים להשפיע על התוצאות של נקודה חשופה וזמינותו, nucleases שלושה הבאים הושוו ביכולתם להסיר רקע אותות AAV המכילות וקטור תרבות התקשורת מוכנה כמתואר לעיל בשלבים 2 ו- 3: DNase אני אנזים A, B אנזים DNase I ו ס marcescens endonuclease (טבלה של חומרים). מחקרים שפורסמו ניצלו את DNase שני לשעבר אני אנזימים13,21,22,23,24 ואנחנו כבר משתמש ס' marcescens endonuclease קודמות ומעודכנים מחקרים. למרבה ההפתעה, היא זוהתה DNase I אנזים A זה בכלל לא מתאים לבחור עבור וזמינותו חשופה נקודה באמצעות התקשורת המכיל וירוס, בתנאים שונים שנבדקו, וכתוצאה מכך אותות רקע הפקד שליליים, בעוד DNase I B אנזים ס marcescens endonuclease מופחת באופן יעיל את האותות רקע בלהיות DNase I B האנזים ~ קיפול כפול יותר יעיל מאשר ס marcescens endonuclease (איור 3 א, ב'). DNase I C אנזים נמצאה גם מאוד יעיל לצמצום את הרקע האותות (נתונים לא מוצג). נתונים אלה מדגימים כי ישנם הבדלים משמעותיים בפעילות האנזים בין nucleases זמינים מסחרית כאשר התגובות אנזים נעשות הכנות AAV ולזרימה למרות נוקלאז העיכול צריך להיות יעיל כאשר קטן כמות preps ויראלי מטוהרים מטופלת תחת תנאי ממוטבת. לפיכך, נתונים אלה מדגישים את חשיבות הבחירה הנכונה של נוקלאז ב וזמינותו כאשר ההכנות AAV ולזרימה עוברים נקודה כמותיים כתם או qPCR assay.

Figure 1
איור 1: ניתוח חשופה נקודה נציג כדי לקבוע את כייל של הווקטור AAV מטוהר CsCl. (א) כפול גדילי וקטור AAV2G9-CMV-GFP היה מיוצר בתאים HEK 293 על ידי תקן פלסמיד נטולת אדנו שלוש תרביות תאים שיטת בקנה מידה גדול, מטוהרת על-ידי שני סיבובים של ultracentrifugation צבע CsCl, ואחריו דיאליזה. 0.3, 0.1, µL 0.03 נקודות של המניה וקטור AAV מטוהרים (מחק בעמודה השמאלית ביותר) היו נענשים וזמינותו חשופה נקודה כמותית ב כפילויות עם שתי קבוצות של פלסמיד המשוכפלת DNA סטנדרטים (מחלות מין). האבן החשופה היה hybridized גשש GFP שכותרתו P 32(0.77 kb), התמונה הושג באמצעות תמונה פוספור מערכת סריקה. (B) A עיקול רגיל מראה את הקשר בין כמויות דנ א פלסמיד ידוע (ng-eq, ציר x) ועוצמות נקודה (שרירותי יחידה (AU), ציר ה-y). המספרים על ציר ה-y התקבלו עם התמונה פוספור מערכת סריקה. R מציין מקדם המתאם של פירסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: AAV VP3-AAP קרוס-קומפלמנטציה נקודה חשופה assay. גדילי כפול AAV-CMV-GFP וקטור חלקיקים ייצור נבחנה של החלבונים VP3 AAV5, AAV9, הנחש AAV ב נוכחות או היעדרות של AAPs cognate שלהם או בנוכחות AAPs ממוצא heterologous. (א) הבדיקה בוצעה ב ערכה המשוכפלת ביולוגית של ניסויים (קבוצה A ו- B סט) עם 4 שעות זמן הדגירה עם ס' marcescens endonuclease ולאחר כייל נוגדנים וקטור AAV המתקבל לכל שילוב נקבע על ידי נקודה כמותיים כתם בשיטה המתוארת בסעיף פרוטוקול. כל נקודה מייצגת שני שלישים (ה-5 וה-6 השורות, 66.7%) או שני-thirtieths (7 ו-8 השורות, 6.7%) של ה-DNA התאוששה כל µL 200 בינוני שנאסף או הפקד שלילי. הנתונים העליון ארבע שורות (א' עד ד' שורות) ייצגו שני סטים של תקני ה-DNA פלסמיד (סטיית תקן 1 ו- STD 2) מחק ב כפילויות (קרי, ליניארית פלסמיד pEMBL-CMV-GFP, המהווה פלסמיד כפול גדילי AAV-CMV-GFP וקטור לייצור). קרום חשופה נקודה נבדקה גשש GFP שכותרתו P 32. זוג נקודות המצוין עם מלבנים מעוגלים הם פקדים שלילי. שתי השורות העליון (סטיית תקן 1) נמצאים בתחתית האבן החשופה המקורי אבל יש כבר לחתוך ועבר העליון מבלי לשנות את התמונה בעוצמה כדי להציג שני תקנים פלסמיד (סטיית תקן 1 ו- STD 2) בצד. מניפולציה זו מזוהה עם קו שחור באיור. כייל ויראלי (B) נקבע עבור השילובים של VP3, AAP חלבונים על ידי הנקודה כתם וזמינותו. הגרף מייצג קבוצה ביולוגית quadruplicated של נתונים, 2 מפאנל A ו-2 מ כתם נקודה נוספת שאינה מופיעה. קווי שגיאה מציין אומר + /-SD (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השוואה של פעילות אנזימטי של nucleases שונים בהכנות וקטור AAV ולזרימה. (א) A נקודה כמותיים חשופה מציג את היעילות של כל טיפול נוקלאז בסילוק רקע אותות. גדילי כפול AAV9-CMV-GFP המכילות וקטור הכנה ("AAV9 וקטורי"), "פקד לא-capsid" היו המיוצר על ידי HEK 293 תא תרביות תאים עם פלסמיד DNAs, נתון וזמינותו. הפקד לא-capsid שלא מכילים נגיפים אך הכילה אקספוננציאלית מוגבר הגנום וקטור unpackaged של CMV-GFP. MgCl2 היה בתוספת אחד או פי שלושה הכמויות המומלצות (6 מ מ, 18 מ מ עבור DNase I אנזים A; ו 2.5 מ מ ו- 7.5 מ מ עבור DNase I B אנזים) מבלי לקחת בחשבון את 0.8 מ מ MgSO4 נוכח המדיום. לטיפול עם ס' marcescens endonuclease, נבחנה רק תנאי אחד המתוארות בסעיף פרוטוקול. כל הדגימות שטופלו בכל נוקלאז לשעה. קרום חשופה נקודה נבדקה גשש GFP שכותרתו P 32. נכון בשתי העמודות (סטיית תקן 2) הן מהצד הימני של האבן החשופה המקורי אבל יש כבר לחתוך ועבר לימין מבלי לשנות את התמונה בעוצמה כדי להציג שתי פלסמיד סטנדרטים (סטיית תקן 1 ו- STD 2) לצד. מניפולציה זו מסומן בקו שחור דק באיור. (B) נקודות הדגימות לא-capsid שליטה בלוח A לכמת ומוצג כ זאת אומרת ± | כל ערך – כלומר ערך |. שבעה מתוך 12 דגימות שטופלו DNase I A אנזים (מסומן בכוכבית) מציגים ערכים רק מעט גבוה יותר מאשר ברמה הגבוהה ביותר; לכן, הם כלולים הגרף הזה להשוואה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בסרישיה marcescens מאגר endonuclease
50 מ מ טריס-HCl
MgCl 2 מ מ2
התאם ל pH 8.5 עם 4 M NaOH.
10 x מאגר Proteinase K
100 מ מ טריס-HCl pH 8.0
100 מ מ EDTA pH 8.0
5% מרחביות
2 x פתרון אלקליין
800 מ מ – סודה קאוסטית
20 מ מ EDTA
20 x SSC (1 ליטר)
175.3 g NaCl
88.2 g סודיום ציטרט tribasic (נה3ג'6H5או7)
הפתרון של Denhardt 100 x (50 מ"ל)
1 g אלבומין שור (שבר V) הערה: סינון הוא קריטי על מנת להסיר חלקיקים קטנים כפי שהם לגרום רקע הכלאה אותות.
1 g Polysucrose 400
1 g פוליוינילפירולידון
להמיס 20 מיליליטר מים באמבט מים 55 ° צלזיוס.
לכוון את עוצמת הקול הסופי 50 מ.
מסנן-לחטא עם מסנן 0.22 μm.
מאגר הכלאה
1% מרחביות הערה: חנות מאגר הכלאה ב 4 ° C ומחממים עד 65 מעלות צלזיוס בתוך אמבט המים לכהן להשתמש.
6 x SSC
5 x הפתרון של Denhardt
10 מ מ טריס-HCl pH 8.0
לשטוף את מאגר
0.1% מרחביות
0.1 x SSC
Polyethylenimine (פיי) פתרון (1 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ל)
להוסיף 500 מ ג פיי ב 450 מ של מים ומערבבים. הערה: עבור אחסון ארוך יותר,-80 מעלות צלזיוס מומלץ.
להוסיף HCl מרוכזת להביא את ה-pH למטה < 2.0 כדי להמיס פיי (µL כ 800 של HCl יידרש).
להוסיף 10 NaOH M להביא pH עד 7.0 (כ-500 µL של 10 מ' NaOH יידרש).
לכוון את עוצמת הקול עד 500 מ"ל של מים.
מסנן-לחטא עם מסנן 0.22 μm.
Aliquot וחנות ב-20 ° C.
פנול-כלורופורם (1:1 mix) עבור נקודה כמותיים סופג
להוסיף רוויה-מאגר פנול (pH 8.0), כלורופורם ביחס של 1:1 צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ. הערה: המאגר מכסה את השכבה אורגני, אם עזב בצינור, יכול להתבצע תוך צינורות מדגם דרך pipetting, עלולה להפוך את הבדיקה אינה מדויקת.
מערבולת צינור נמרצות כדי לערבב.
לאפשר שלב ההפרדה על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן להסיר את השכבה המימית לחלוטין.
חנות ב 4 º C.

טבלה 1: פתרון ומתכונים מאגר. מתכונים פתרונות, מאגרי הדרושה להשלמת הנקודה כמותיים כתם פרוטוקול.

פלסמיד AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) בקרה שלילית (μg) תרביות תאים שליטה (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-דגל-AAPx 0.4
pAAV-כתב 0.4 0.4 0.4
pHLP-נציג 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (ריק) 0.4 0.8
pCMV-GFP 2.0
סה 2.0 2.0 2.0 2.0

בטבלה 2: פלסמיד השילובים עבור AAV VP3-AAP קרוס-קומפלמנטציה assay שבוצעו בתבנית צלחת 6-ובכן. שילובים של פלסמיד DNAs כדי לשמש עבור תרביות תאים תאים HEK 293 בכל קבוצה ניסיונית מוצגים. pCMV-AAVx-VP3, של פלסמיד לבטא AAV serotype x (x = 1, 2, 3, וכו) VP3 חלבון תחת משפר CMV-IE-יחצ ן; pCMV-דגל-AAPx, של פלסמיד לבטא AAV serotype x (x = 1, 2, 3, וכו) AAP חלבון תחת משפר CMV-IE-יחצ ן; pAAV-עיתונאי, פלסמיד יש שני חזרה מסוף AAV2 הפוכה (ITRs), מיועדת לייצור רקומביננטי AAV וקטור; pHLP-נציג, פלסמיד לבטא AAV2 נציג חלבון; pHelper, פלסמיד העוזר אדנו; pCMV (ריק), פלסמיד ריק נוסף כדי לקבוע את התנאים ניסיוני; pCMV-GFP, פלסמיד לבטא פלורסצנטיות סמן הגן (למשל, ה-GFP) כדי לוודא תקנים מוצלחת. Transfections מתנהל טוב 6 צלחות, והשתמש סך של 2 µg של פלסמיד DNAs.

מיקס A עבור צינורות 10 (μL)
בסרישיה marcescens מאגר endonuclease 91.2
0.1 M NaOH 8.8
סה 100
מיקס B עבור צינורות 10 (μL)
בסרישיה marcescens מאגר endonuclease 91.2
MgCl 1 מ'2 הגנה 7.04
בסרישיה marcescens Endonuclease (250 יחידות/μL) 0.176
סה 100
מיקס C עבור צינורות 10 (μL)
10 x מאגר Proteinase K 400
Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) 100
H2O 1,300
סה 1,800
מיקס D עבור צינורות 10 (μL)
100% אתנול 8,000
3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2) 320
הצדפה גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל) 10
סה 8,330

טבלה 3: רשימת ריאגנטים מיקס מאסטר. מיקס A ו- B מיקס משמשים לטיפול endonuclease ס marcescens בשלב 3.2. אלה שתי תערובות צריכה להיעשות בנפרד כדי למנוע משקעים של מגנזיום הידרוקסיד. מיקס C משמש לטיפול Proteinase K בשלב 3.3. מיקס D משמש עבור אתנול משקעים בשלב 3.4.3. אמצעי האחסון המצוין בטבלה הם מיקס מאסטר ריאגנטים עבור צינורות 10.

תקן ה-DNA פלסמיד (ng) אמצעי אחסון (µL) של 25 pg/µL פלסמיד DNA פתרון רגיל נפחי מים (µL) הנפח הכולל (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37.5 562.5 600
0.156 18.8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

בטבלה 4: נקודה כמותיים חשופה פלסמיד DNA סטנדרטים. הצורך כרכים של 25 pg/µL דנ א פלסמיד פתרון ומים או כדי להכין את פלסמיד תקני ה-DNA על ידי דילולים טורי כפולה (600 µL tube) מוצגים. המספרים בעמודה פלסמיד DNA סטנדרטי (0.039-5 ng) הן כמות ה-DNA ב 200 µL של כל פתרון רגיל דנ א פלסמיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדו ח זה, מתואר השירות של נקודה כמותיים מבחני חשופה ללמוד AAV AAPs ותפקידם capsid הרכבה. הידע שנרכש ממחקרים אלה יכולים לספק תובנות מפורט ההבדלים מולדת בתהליך AAV capsid הרכבה ותפקידה פונקציונלי של AAPs בין שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם. במובן זה, הנקודה קרוס-קומפלמנטציה AAV VP3-AAP כתם assay חשף כי הנחש AAV VP3 המוצג תלות קפדנית על התבטאות שלה AAP cognate להרכבה capsid שותף ולקדם כי הנחש AAP לא capsid הרכבה של heterologous אשר נגרמו מהזנים אליהם . התבוננות זו הוא מסקרן, כי AAV תלויי-AAP serotypes זה נחקרו בעבר (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12) מסוגלים כל תהליך ההרכבה לפחות במידה מסוימת על ידי ניצול AAP heterologous6.

הכלאה חשופה כמותית של נקודה או חריץ היא שיטה מסורתית עבור כימות של חומצות גרעין הכיל בדגימות מרובות בו-זמנית באופן נוח25. השיטה היה בשימוש נרחב עבור כימות DNA ו- RNA עד qPCR הפך נפוץ יותר שנות ה-9026,27. למרות qPCR יש יתרונות על פני נקודה כמותיים חשופה ומוצגים אחרים מבוססי הכלאה מבחני ב qPCR את רגישות גבוהה יותר, עם טווח דינמי רחב יותר, הוא גם נושא סיכון הטבועה של אקספוננציאלית משלים שגיאות ביודעין, אשר היה המקרה עבור titers של מניות וקטור AAV נקבעים על-ידי qPCR13,23. מבחני חשופה נקודה כמותית הם להגדיר בקלות עם עלות זולה וביצעו בקלות עוד לחוקרים יש גישה אל מערכת הדמיה מולקולרית כמותית כי יכול לרכוש אותות נקודה חשופה ממברנות hybridized או גשש רדיואקטיבי או בדיקה chemiluminescent או פלורסנט שאינו רדיואקטיבי. למרות פרוטוקול זה מנצל 32התווית על-ידי P רדיואקטיבי זונדי אות זיהוי, אחרים להשתמש בהצלחה הגששים DNA שאינו רדיואקטיבי ישירות המסומנת זמינים מסחרית phosphatase אלקליין thermostable28. מבחני חשופה נקודה להשתמש עיקרון פעולה פשוטה, וזמינותו בפני עצמו שלא להוות אתגר טכני אמנים; לכן, התוצאות הן בדרך כלל לשחזור אפילו על ידי אנשים חסרי ניסיון.

מלבד היישומים המתוארים כאן, אנו משתמשים באופן שגרתי גרסה פשוטה and מזורז של ההליך חשופה נקודה יכול לכמת למחצה AAV חלקיקים במהירות. היתרונות של מבחני חשופה נקודה בהקשר זה כוללים: assay (1) אינה דורשת טיהור או הגברה אנזימטי של הגנום הנגיפי, אשר לוקח שעות, (2) שילוב של חום דנטורציה אלקליין מספיקה לשבור AAV חלקיקים במדגם פתרון ושחרור שפגע בסימני הגנום הנגיפי בתוך תמיסת שמוכנים לאגד קרום חשופה נקודה ו- (3) הנוכחות של מלח גבוהה הריכוזים בדגימות אינה משפיעה באופן משמעותי את התוצאות וזמינותו. לדוגמה, זה מאפשרת לכמת למחצה חלקיקים AAV בפתרונות עשיר CsCl (למשל, שברים מתקבל על ידי צפיפות-מעבר CsCl ultracentrifugation) על ידי הצבת של aliquot קטן (≤10 µL) של דגימות לתוך µL 100 1 x פתרון אלקליין, חימום-100 ° ג 10 דקות, סופג לתוך קרום עם או בלי סטנדרטים מוכנים מראש, שהופעלו על ידי הכלאה של 15 דקות, מינימום 3 x 3 מנקי וחשיפה זרחן הדמיה המסך למשך 15 דקות (או יותר בעת שימוש בדיקה עם קרינה רדיואקטיבית ירד). כל התהליך יכולה להסתיים ב- 1 h ברגע המשתמש הופך ההליך מוכר. אנו משתמשים בשיטה זו מזורז, אשר נוהג נקרא "נקודה רותחים חשופה שיטת", כדי לזהות AAV חלקיקים עתירי שברים CsCl במהלך הטיהור וקטור לעבד, בערך לקבוע titers של מניות וקטור AAV מטוהרים לפני שמתחילים את מקיף תהליכים עבור וקטור אפיון. לכן, למרות נקודה חשופה מבחני עשוי להיחשב שיטה מיושנות לכמת חומצות גרעין, כבר הוחלפו שיטות מבוססות-PCR שונות במגוון רחב של תחומים מדעיים, ישנם עדיין מספר יתרונות לשיטה זו צריך להפוך חוקרים את שירותיהם זה במעבדות שלהם.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא הטיפול נוקלאז דגימות. אם שלב זה לא יבוצע במצב אופטימלי, זה יגרום רקע אותות. אנו משתמשים ס marcescens endonuclease ואילו DNase אני אנזימים ממקורות שונים נמצאים בשימוש נרחב במעבדות אחרות על כימות DNA נגיפי. DNase אני ממוצא הלבלב שור כבר ביותר בשימוש נרחב על ידי חוקרים. זה חלק כי DNase הלבלב שור הייתי הראשון המזוהה ביותר בהרחבה מאופיין מבחינה ביוכימית29. DNase אני אנזימים זמין כעת של ספקים מסחריים מופקים ממספר מקורות ביולוגיים שונים כגון Pichia pastoris (DNase I אנזים A), הטופס יליד מטוהרים מהלבלב שור (למשל, DNase I B אנזימים), ו אנזימים רקומביננטי מיוצר מינים שמרים או Escherichia coli (DNase I אנזים C). . מצאנו זה את DNase אני אנזימים מכל שלושת אלה ממקורות שונים השתמשו במחקרים שפורסמו AAV וקטור כימות; עם זאת, לידע שלנו, אף אחד המחקרים הקודמים יש חקר אם אנזימים ממקורות שונים יעילים באותה מידה של עיכול מזהמים במולקולות דנ א AAV וקטור ההכנות. יצוין כי DNase אני לטיפול AAV וקטור מבחני מבוצעת לעיתים קרובות בתנאים הלא אופטימיזציה בשל נוכחותם של זיהומים שמקורם בתרבות בינוני ותאים. התצפית כי DNase I אנזים A פעילה רק חלקית המדיום תרבות השתמשנו יש השלכות משמעותיות בעיצוב וזמינותו עבור כימות וקטור AAV נקודה חשופה, qPCR, ומתריע חוקרים לבעיה זו מזוהה בעבר. בהקשר זה, ס marcescens endonuclease הביע ב e. coli, הוא endonuclease אידיאלי לא רק למטרת ייצור AAV וקטורים, אלא גם עבור AAV וקטור כימות. זה בגלל פעילותה אנזימטי יכול להישמר על מגוון רחב של ערכי pH וריכוזי של יוני מגנזיום ו קטיונים monovalent. מסיבה זו, מכיוון ש marcescens endonuclease הוא בערך פי 2 פחות יקר DNase I B האנזים על בסיס לכל יחידה, ואנחנו מעדיפים להשתמש ס marcescens endonuclease נקודה כמותיים שגרתית חשופה ניתוחים.

לסיכום, מבחני חשופה נקודה כמותית הם הליך פשוטה יחסית בקלות יכול לספק מידע על היכולת לייצר חלקיקים נגיפיים בתנאים משתנים. לעומת גישות חלופיות titering, כגון qPCR, גישה זו דורשת קצת, אם בכלל, אופטימיזציה. הוא יכול גם בקלות ליישם וקטורים של כל serotype, יכול לשמש כדי כייל נוגדנים שני יחיד, כפול-גדילי המומנט מבלי לשנות את הפרוטוקול. בעקבות transfections הקציר AAV המכילות וקטור דגימות (תרבות בינונית ו/או תאים), פרוטוקול כל ניתן להשלים ביום אחד, ובכך במהירות מענה לשאלות אודות היכולת לייצר חלקיקים נגיפיים מתנאי מגוונים, כולל שילובים שונים של חלבונים AAV VP3 ו- AAP. נקודה כמותיים שהכלים מציעים שיטה מועיל להתייחס שונות שאלות לא פתורות לגבי אינטראקציות סמנכ ל- AAP ותפקידיהם בהרכבה capsid במגוון רחב של שונות AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם, מבודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים שיאו שיאו-מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל סיפק לנו פלסמיד pEMBL-CMV-GFP. אנו מודים כריסטופר נג ווונג ג שמואל על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניק (NIH R01 NS088399 ו- T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

ביולוגיה גיליון 136 Adeno-הקשורים וירוס (AAV) הרכבה-הפעלת חלבון (AAP) קרוס-קומפלמנטציה כמותיים נקודה חשופה assay כייל ויראלי ריפוי גנטי
וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter