Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil Nefelometri adeno ilişkili virüs (AAV) titreleri ve derleme aktif rol çalışmaya uygulanması için detayları proteinleri (AAPs), yapısal olmayan viral proteinlerin tüm AAV buldu romanı bir sınıf serotipleri, soydaş ve kapaklı AAV serotipleri türetilmiş capsids Meclisi teşvik.

Abstract

Adeno ilişkili virüs (AAV) yaygın olarak gen tedavisi için çekici bir vektör olarak kabul ederken, ayrıca virüs biyoloji anlamak için bir model virüs olarak hizmet vermektedir. İkinci açıdan derleme aktive protein (AAP) olarak adlandırdığı bir yapısal olmayan AAV protein son keşfi viral kapsid VP proteinlerin derlemeye bir kapsid içinde gerçekleştirilen işlemlere yeni bir ışık tutmuştur. Birçok AAV serotipleri için derleme AAP gerektirse de, son zamanlarda bildirdin bu AAV4, 5, ve 11 Bu kuralın istisnaları vardır. Ayrıca, AAPs ve monte capsids farklı serotipleri için farklı hücre altı bölmeleri yerelleştirmek gösterdi. Biyolojik özellikleri ve AAPs arasında farklı AAV, fonksiyonel rollerinin beklenmeyen bu heterojenlik önemini AAPs üzerine farklı serotipleri türetilen alt çizgi serotipleri. Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil AAV Nefelometri ve kapsid derlemesinde AAP bağımlılık ve serotip özgüllük değerlendirmek için uygulama için ayrıntıları. Bu dot blot testin yardımcı programı göstermek için biz kapsid derleme ve AAP bağımlılık yılan AAV, daha önce uncharacterized sürüngen AAV, hem de AAV5 ve AAV9, hangi AAP bağımsız ve AAP bağımlı olmak daha önce gösterilmiş olan karakterize etmek için yola çıktı , sırasıyla serotipleri. Tahlil ortaya yılan AAV kapsid derleme yılan AAP gerektirir ve AAPs tarafından AAV5 ve AAV9 yükseltilemez. Tahlil birçok ortak serotip Contegra kapsid derleme çapraz-uluslara tarafından teşvik AAPs, yılan AAP AAV9 capsids Meclisi teşvik değil, aynı zamanda gösterdi. Buna ek olarak, biz seçimi nükleaz, önemli ölçüde dot blot testin okuma etkiler ve böylece, en uygun bir enzim seçme AAV titreleri başarılı değerlendirmesi için kritik olduğunu gösteriyor.

Introduction

Adeno ilişkili virüs (AAV) genomu yaklaşık 4.7 kilobases (kb) ile küçük, Sigara saran, tek iplikçikli DNA virüsüdür. AAV genom açık okuma çerçevesi (ORFs) temsilcisi ile kap gen için içerir. 2010'da evvelce tanımlanamayan bir mekansal protein + 1 çerçeve kaymıştır ORF AAV2 kap gen içinde tarafından kodlanmış Sonntag vd tarafından keşfedilen ve AAV2 kapsid VP monomer proteinler bütünleştirilmiş koda bir viral kritik bir rol oynamak için bulundu kapsid1. Bu roman protein derleme aktive protein (AAP) kapsid derleme1teşvik oynadığı rolü sonra adlandırılmıştır.

AAP için ORFs tüm parvoviruses cins Dependoparvovirusiçinde ancak farklı cins parvovirus aile1,2virüs genleri içinde genleri tespit bioinformatically olmuştur. Bu roman protein fonksiyonel çalışmalar başlangıçta hangi AAP2 önemli rol unassembled VP proteinleri birikimi ve düzene çekirdekçik için tam hedefleme kurmuştur AAP AAV2 prototipten (AAP2), üzerinde durulmuştur capsids1,3,4toplandı. AAP ifade olmaması durumunda montajı AAV2 capsids yetersizliği bağımsız oldu bizimki de dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından1,2,3,4,5 onaylandıktan . AAV serotipleri 1, 8 ve 9 sonraki çalışmalar AAPs kritik rolü ile kapsid derleme, AAV1, 8, VP3 monomer proteinler olarak doğrulanmıştır ve 9 tam olarak birleştirilmiş bir kapsid AAP2Co ifade yokluğunda oluşturmak yapamaz.

Son zamanlarda, nicel nokta kullanımını içeren yaklaşımlar deneyleri leke, biz AAV1 yeteneği VP3 monomerleri Meclisi tanıtmak için 12 AAP ifade yokluğu ve AAP1 yeteneği capsids içine monte 12 VP3 monomer için araştırdık kapaklı serotipleri. Bu çalışmada ortaya koyduğu bu AAV4, 5 ve 11 VP3 monomerleri AAP monte. Ayrıca, biz muayene on iki AAP serotipleri sekizi bulundu oldu (yani, tüm AAP4, ama 5, 11 ve 12) AAP4, 5, 11 ve 12 görüntülenen süre Contegra AAV serotip capsids Meclisi kapsid desteklemek için geniş bir yetenek görüntülenen bir önemli ölçüde Bu konuda6sınırlı yetenek. Bu dört serotipi diğer AAP serotipleri2,3filogenetik uzak. Ayrıca, çalışma içinde farklı AAPs6hücre altı yerelleştirmeler önemli heterojenite ortaya çıkardı. Ayrıca, çalışma AAP sıkı Derneği ile birleştirilmiş capsids ve çekirdekçik, AAV2 kapsid derleme, hallmark mutlaka AAV5, dahil olmak üzere diğer serotipleri genişletilemez önerdi 8 ve 9, genelde dışlanması görüntülemek Monte capsids6. Böylece, herhangi bir belirli serotip AAP çalışma elde edilen bilgilerden tüm AAP biyoloji için genel olarak geçerli değildir. Böyle şaşırtıcı doğa AAP biyoloji rolü ve fonksiyonu her AAP kurallı ve kanonik olmayan AAV serotipleri üzerinden araştırmak gereğini vurgular.

Biyolojik rolü AAP kapsid derleme tam olarak paketlenmiş AAV viral parçacık titreleri insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri, en sık kullanılan hücre kültürünü AAV vektör üretim, ile ya da ezelî AAP protein için üretilen belirleyerek tespit edilebilir ifade. Kantitatif PCR (qPCR) AAV Nefelometri için standart metodlar-tabanlı deneyleri7,8 ve nicel nokta leke tabanlı deneyleri9. Diğer yöntemleri için AAV viral parçacık Nefelometri enzim bağlı immunosorbent assay10,11 veya optik yoğunluk ölçüm12 gibi birçok farklı AAV serotipleri elde edilen örnekler veya örnekleri için ideal değildir sık sık AAV araştırmalar için kullanılan örnekleri kirleri (ham lysates veya kültür ortamı), ile kirlenmiş. Şu anda, qPCR en yaygın AAV Nefelometri için kullanılır; Ancak, potansiyel uyarılar qPCR tabanlı testin tahlil olarak sistemik hataları ve önemli titresi varyasyonları13,14neden olabilir kabul etmek gereklidir. PCR tabanlı deneyleri potansiyel kovalent kapalı terminal saç tokaları amplifikasyon13inhibe PCR şablonları varlığı gibi faktörler semptomlarıdır bir dizi etkilenir. Deneyimli bir birey bile potansiyel tanıtabilirsiniz karıştırıcı faktörlerin qPCR tabanlı içine tahlil bilmeden13. Buna ek olarak, nicel nokta leke deneyleri genom amplifikasyon içermeyen ve hataları qPCR tabanlı deneyleri ile karşılaştırıldığında en az riskle çok daha basit ilke kullanan bir klasik moleküler biyoloji tekniği vardır. Teknik olarak zor daha az yöntemdir; Bu nedenle, tahlil sonuçları bile deneyimsiz kişiler tarafından makul tekrarlanabilir.

Bu raporda, biz biz düzenli olarak AAV vektör Nefelometri için kullanın ve nasıl AAPs derleme teşvik rolü ortak çalışmaya tahlil uygulamak için (AAV5 ve AAV9) serotipleri ve bir örnek sağlar bir nicel nokta leke tahlil metodolojik ayrıntıları açıklamak daha önce uncharacterized AAP yılan AAV14. Doğada, AAV VP proteinler ve AAP proteinler CIS bir tek gen (yani, VP-AAP CIS-tamamlayıcı), burada açıklanan tahlil üzerinden ifade edilir, Müdür Yardımcısı ve AAP proteinler trans iki ayrı plazmid (yani, VP-AAP üzerinden sağlanır Trans-tamamlayıcı). Farklı serotipleri her VP veya AAP protein her bağımsız plazmid ifade edilebilir beri kapsid derleme (yani, VP-AAP çapraz-tamamlayıcı) için kapaklı VP-AAP kombinasyonları test etmek mümkün olur. Kısaca, çeşitli serotipleri üzerinden AAV VP3 HEK 293 hücrelerinde varlığı veya yokluğu soydaş serotip AAP veya kapaklı serotip AAP huzurunda bir AAV vektör genom paketlemek için plazmid DNA transfection tarafından ifade edilir. Üretim, Kültür Medya ve hücre lysates kapsid kabuk içinde viral genom ölçmek için bir nokta leke tahlil için tabi tutulmaktadır. Dot blot testin ilk adım örnekler bulaşıcı plazmid DNA'lar ve ambalajsız AAV genleri örneklerinde kaldırmak için bir nükleaz ile tedavi etmektir. Aksi halde ne zaman unpurified örnekleri denetlesinler arka plan sinyalleri özellikle artış olacaktır. Bu da bir proteaz tedavi viral capsids kırmak ve örnek çözümlerinizle nükleaz dayanıklı viral genom yayın tarafından takip ediyor. Sonraki, viral genom bir membran üzerinde deyimiyle, denatüre ve Nefelometri bir viral genom özgü DNA prob ile melezleşmiştir. Rapor burada örnek tahlil biz yılan AAV VP3 kapsid derleme için yılan AAP gerektirir ve yılan AAP AAV9 capsids Ayrıca Meclisi yükseltebilirsiniz AAP bağımlı serotipleri türetilmiş AAPs çoğunu aksine Meclisi teşvik değil göstermek kapaklı serotip capsids. Son olarak, biz qPCR için önemli bir uyarı raporu veya seçimi nükleaz, önemli ölçüde tahlil sonuçları etkiler nokta leke tabanlı AAV Nefelometri deneyleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Çözümler ve bu iletişim kuralı için gerekli arabellekleri için yemek tarifleri Tablo 1' de verilmiştir. Aşağıda açıklanan kapsid derlemesinde AAP proteinlerin rolleri çalışmaya VP-AAP çapraz-uluslara nokta leke tahlil için iletişim kuralıdır. Daha genel nicel nokta leke tahlil için saflaştırılmış AAV vektör titrasyon için yöntem Temsilcisi sonuçları bölümünde açıklanmıştır.

1. İnşaat VP3, AAP ve plazmidler ifade AAV2 Rep

  1. PCMV-AAVx-VP3 (x = serotipleri) İnşaatı
    1. PCR-yükseltmek tüm VP3 yüksek sadakat DNA polimeraz ve aşağıdaki astar çiftini kullanarak ORF (1,6 kb): VP3 ileri, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF ilk 25 nukleotid); VP3 ters, TCTT-RE2-N25 (VP3 ORF son 25 nukleotid).
      Not: RE1 ve RE2 enzimleri klonlama için (REs) için sitelerdir. CTAA ve TCTT terminal 5' ve sonuna çift iplikçikli DNA Restriksiyon enzimi sindirimi kolaylaştırmak için eklendi 3' tetranucleotides yakınındaki. CACC Kozak fikir birliği dizisidir.
    2. İnsan sitomegalovirüs hemen-erken (CMV-IE) enhancer-organizatörü için üst düzey ifade kullanan bir memeli ifade vektör sitelerin yeniden karşılık gelen arasında RE-digested PCR ürünleri klon.
      Not: moleküler klonlama için omurga plazmid DNA bir en uygun sıcaklıkta 1 h için 4 U/µg DNA bir konsantrasyon, bir restriction enzyme(s) ile 5 µg sindirmek. PCR parçaları için kullanılan enzimler (Örneğin, 10 U/µg 1,6 kb VP3 ORF PCR ürününün) ve daha uzun bir kuluçka süresi (Örneğin, 4 h) birim başına birim uzunluk Restriksiyon enzimi tanıma sitelerin sayısı artış nedeniyle artırmak. Moleküler Biyoloji Enzim ve bakteriyel dönüştürme de dahil olmak üzere klonlama yordamları yararlı bilgiler başka bir yerde15,16,17bulunabilir.
  2. PCMV-bayrak-AAPx (x = serotipleri) İnşaatı
    1. PCR-yükseltmek yüksek sadakat DNA polimeraz ve aşağıdaki astar çiftini kullanarak ilk amino asit dışında tüm AAP ORF (0.6 kb): AAP ileri, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (4 nükleotit üzerinden 25 nükleotit AAP ORF); AAP ters, TCTT-RE2-N25 (AAP ORF son 25 nukleotid).
      Not: Hiçbir zararlı etkileri4,5 için gösterilen ama gereksiz atlanabilir bir bayrak etiketi GACTACAAGGACGACGATGACAAA kodları.
    2. RE-digested PCR ürünleri bir memeli ifade vektör CMV-IE artırıcı organizatörü15,16,17ile ilgili siteler arasında klon.
  3. PHLP-Tem inşaatı
    1. Özeti 5 µg 20 birim her Xho ile pAAV-RC2 plazmid (7,3 kb), ben ve Xcm ben ve ticari bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak veya fenol kloroform çıkarma.
      Not: 1,8 kb Xho ben-7,3 kb pAAV-RC2 plazmid sonuçlarda bir kayıp kapsid VP protein ifade Rep protein ifade koruyarak süre gelen parçası Xcm kaldırılması.
    2. Künt DNA 6 adet T4 DNA polimeraz ile biter, özel jel-5.5 kb DNA parçası arındırmak ve 50-100 kullanarak saf parçası kendi kendine ligate ng DNA ve 400 adet T4 DNA ligaz üreticinin tavsiye15göre.
    3. 1.1.2. adımda belirtilen standart bakteriyel dönüşüm prosedürü izleyin Not.
  4. Restriksiyon enzimi sindirim ve sıralama15,18tarafından plazmid oluşturur doğrulayın.
  5. Plazmid minipreps veya maxipreps plazmid DNA aşağı akım AAV üretim deneyler için yeterli miktarda elde etmek için piyasada kitleri kullanarak gerçekleştirin.

2. AAV HEK 293 yılında üretimini hücreleri plazmid DNA Transfection (çapraz-uluslara tahlil) tarafından

  1. Kültür HEK 293 hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM)-yüksek glikoz (4,5 g/M) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), % 1 penisilin ve streptomisin Mix, takıma ve 1 mM L-glutamin, 37 ° C kuluçka %5 karbondioksit (CO2) ile.
    Not: AAV titreleri önemli ölçüde HEK 293 hücreleri kaynağına bağlı olarak değişir.
    Dikkat: her ne kadar AAV, ele alınabilir Biyogüvenlik seviye 1 (BSL1) kapsama, BSL2 koruyucu HEK 293 hücre iş için tavsiye edilir.
  2. Gün -1 (transfection önce 24 h), tabak 6-7 105 HEK 293 hücreler/kuyuda 2 mL x 6-şey plate(s) 2.1 adımda açıklanan tam orta. Bu genellikle ertesi gün ~ %90 confluency elde eder.
  3. Gün 0: Transfection
    1. DNA transfection için hazırlık
      1. Hücreleri ~ %90 confluency ulaştınız emin olun.
      2. %1 penisilin ve streptomisin Mix ve 1 mM L-glutamin içeren ancak % 10 takıma DMEM ısınmak FBS (yani, serum-Alerjik orta) 37 ° C su banyosu.
      3. Oda sıcaklığında ulaşmak polyethylenimine (PEI) çözüm izin verin.
    2. Plazmid DNA karışımı hazırlanması
      1. Plazmid 96 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan CaCl2 veya MgCl2 steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler içinde Tablo 2' de gösterildiği gibi karıştırın. Toplam DNA 2 µg/iyi miktarıdır.
        Not: nominal olmaları durumunda bu birim plazmid DNA çözüm için gözardı. Ses ayarı önerilir plazmid DNA çözümleri hacmi ≥10 µL ise.
    3. PEI transfection
      1. PEI çözüm (1 mg/mL) 4 µL (yukarıdaki gibi hazırlanmış) PBS-plazmid DNA karışıma ekleyin. Yaklaşık 100 µL (kültür ortamının % 5 cilt) son birimdir. Girdap kısaca tüpler ve DNA: PEI karışımı oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya.
      2. Tamamlamak 15 dk kuluçka için beklerken, prewarmed serum-Alerjik Orta 2.3.1.2. adımda anlatılan kültür orta yerine.
      3. Bir kez 15dk kuluçka DNA'ın: PEI karışımı tamamlandığında, kısa bir süre sıvı tüpler altına toplamak için bir microcentrifuge tüplerini spin ve DNA: PEI karışımı dropwise kültür ortamına her iyi HEK 293 kültür plaka ekleyin. Yavaşça tahrik plakaları ve % 5 CO237 ° C kuluçka için dönmelerini.
      4. Bu transfection orta hücrelerde kadar gün 5 (orta değişiklik gereklidir) hasat korumak.
  4. Gün 1 ve 2 gün, transfection etkinliğini değerlendirmek için bir ters floresan mikroskop altında pCMV-GFP plazmid ile hücreleri transfected gözlemlemek.
    Not: floresan mikroskopisi, burada bir 10 X için / 0,25 sayısal diyafram amaç 10 × mercek ile birlikte kullanılan ve 450 – 490 nm uyarma bant filtre ve 515 – 565 nm bant emisyon filtre istihdam edildi. Yukarıdaki durum normalde % 70 transfection verimliliği daha verir. Hücreleri (Örneğin hücreleri ince olmuştur) bazı morfolojik değişiklikler nedeniyle serum bırakma durumu sergileyebilirler.
  5. Gün 3-5, 37 ° C kuluçka %5 CO2transfected hücreler kültür devam.
  6. Gün 5, hücreler ve virüs içeren orta yukarı ve aşağı pipetting veya hücre sıyırıcı kazıma 15 mL polipropilen koni tüpler içine toplamak.
  7. -80 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak.

3. dot Blot tahlil AAV Nefelometri için

  1. Viral parçacıkların kurtarma
    1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu donmuş tüplerde çözülme. Girdap tüpler şiddetle 1dk AAV kurtarma hücrelerden en üst düzeye çıkarmak için.
    2. Hücre artıkları 3.700 x g 10 dk 4 ° c de centrifuging tarafından cips. 200 µL süpernatant her tüp, almak ve nokta leke tahlil için bir vida kapaklı bir etiketli microcentrifuge tüp içine aktarın.
      Not: Aliquot kalan süpernatant microcentrifuge içine borular ve ileride kullanmak için-80 ° C arasında dondurulup depolayabilirsiniz. Burada, Polipropilen microcentrifuge tüpler vidalı kapakları ile bağlı ve bir O-ring kullanılmıştır. Sıkı sızdırmazlık AAV ve fenol kloroform sızıntıları önlemek için gereklidir.
  2. Serratia marcescens endonükleaz ile tedavi
    1. Mix A ve Mix B reaktifler (Tablo 3) hazırlayın. Mix a 10 µL ve Mix B 10 µL her tüpün içine ekleyin. Girdap tüpler için 5 s, kısa bir süre sıvı tüpler altına toplamak ve tüpler 37 ° C'de en az 1 h için kuluçkaya tüpler spin.
      Not: Mix A NaOH içeren ve pH S. marcescens endonükleaz ile tedavi için en iyi duruma getirir. Mix B magnezyum takviyesi. S. marcescens endonükleaz piyasada bulunan enzim stokları konsantrasyon değişebilir. S. marcescens endonükleaz hacmi 200 U/mL tüpler içinde adım 3.2.1 içine karıştırmak A ve Mix B ekledikten sonra yapmak için buna göre ayarlanması gerekir.
      Not: Daha uzun bir kuluçka süre kadar 4 h için arka plan sinyalleri düşürebilir.
    2. İnkübasyon sonunda tüpler yoğunlaşma ve çözüm tüpler kenarlarında ve üst toplamak için benchtop santrifüj ile kısa bir süre spin.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. -20 ° C veya-80 ° c donmuş örnekleri saklanabilir
  3. İndinavir K tedavi
    1. Mix C reaktif (Tablo 3) hazırlayın. Mix C 180 µL her tüpün içine ekleyin. Girdap tüpler için 5 s, kısaca spin tüpler ve borular için 1 h 55 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Mix C reaktif EDTA ücretsiz magnezyum iyonları chelates ve S. marcescens endonükleaz inaktive.
    2. İnkübasyon sonunda örnekleri oda sıcaklığında ulaşmak izin ve kısa bir süre ile yoğunlaşma ve çözüm tüpler kenarlarında ve üst toplamak için benchtop santrifüj tüpleri spin.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. -20 ° C veya-80 ° c donmuş örnekleri saklanabilir Protokol sürdürmek için 55 ° c 5-10 dk SDS kristaller tamamen arabellekte bulunan çözülmeye tüpler kuluçkaya.
  4. Fenol kloroform çıkarma ve etanol yağış
    1. Örnekler ve onları 1 dk. ≥16, 100 x g ≥5 dakika oda sıcaklığında, microcentrifuge örneklerinde Spin girdap fenol kloroform 200 µL ekleyin.
      Dikkat: Fenol kloroform kimyasal duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; ile ele alınmalıdır yani, nitril eldiven, gözlük veya yüz kalkan ve önlük uzun kollu).
    2. Sulu katmanın (P200 pipet ile iki kez 160 µL) 320 µL yeni bir standart microcentrifuge tüp (sulu sıvı hacminin % 80) aktarın.
      Not: Sulu çözüm örnekleri arasında aynı birim hayati önem taşımaktadır, aksi takdirde tahlil nicel doğruluk kaybeder.
    3. Mix D reaktif (Tablo 3) hazırlayın. Mix D 833 µL her tüpün içine ekleyin. Girdap tüpler için 5 s ve tüpler için ≥20 min-80 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Mix D etanol, sodyum asetat ve glikojen için uygun etanol yağış DNA'ın bir karışımıdır. Örnekleri bu adımda-80 ° C'de depolanan ve protokol daha sonra devam.
    4. Santrifüj örnekleri ≥16, microcentrifuge, ≥15 dakika süreyle 4 ° C'de 100 x g ile süpernatant dökün ve bir kez bir temiz kağıt havlu üzerinde leke. Yaklaşık 500 µL % 70 etanol her tüpün koymak girdap tüpler için 5 s ve santrifüj benchtop microcentrifuge ≥16, 100 x g ≥5 min için 4 ° C'de, tüplerini.
    5. Süpernatant dökün ve bir kez bir temiz kağıt havlu üzerinde leke. Kuru granül 65 ° c; Granül tamamen kurumuş.
      Not: bir pipet tüpler kurutma sonra kalır fazla etanol kaldırmak için kullanmayın. Granül ayrıca oda sıcaklığında gecede kurumuş. Protokol burada durdu ve kurutulmuş DNA granül kapalı tüp kapak ile Oda sıcaklığında birkaç gün saklanabilir.
  5. Resuspension TE arabelleği viral DNA'ın
    1. DNA granül 120 µL her TE arabellek içinde oda sıcaklığında 30 dk 1 h için her tüp sallayarak geçiyoruz.
  6. Nokta leke
    1. Plazmid DNA standartların hazırlanması
      1. AAV vektör genom plazmid DNA için 10 ng/µL su veya Tris-HCl tampon (10 mM, pH 8.0) oranında seyreltin. Bu seyreltme ve Özet 1s 50 µL tepki hacmine plazmid DNA, linearize için uygun bir Restriksiyon enzimi ile 25 µL al.
        Not: Biz sindirim yinelenen bir dizi yapmak (bkz. Adım 3.6.4.1). Uygun enzim plazmid DNA nokta leke sonda bağlama bölgesi dışında kesen biri olmalıdır. Kolaylık sağlamak için seyreltilmiş plazmid DNA bölünmemeli (25 µL/tüp) olabilir ve depolanan ileride kullanmak için-20 ° C arasında dondurulup. Tüpler adım 3.5.1 titriyor iken plazmid DNA sindirmek. Plazmid DNA Standart aşırı sindirmek değil.
      2. Su veya TE 450 µL sindirilir plazmid DNA çift içeren tüp ekleyip iyice karıştırın. Bu karışımdan 70 µL yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp su veya seyreltilmiş plazmid standart (25 pg/µL) yapmak için TE 1.330 µL ile aktarın.
      3. İki kat seri dilutions (600 µL/tüp) bir dizi oluşturmak için Tablo 4 izleyin. Mix dilutions iyice vortexing için 5 tarafından s.
    2. Standartlar ve viral DNA örnekleri denaturing
      1. 2 x alkalin çözüm 600 µL her Standart seyreltme için ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında 5-10 s. Incubate için de vortexing tarafından karıştırın.
      2. 2 x alkalin çözüm 120 µL viral DNA örnekleri ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında 5-10 s. Incubate için de vortexing tarafından karıştırın.
    3. Nokta leke cihazları kurma
      1. Makas kullanarak, kurutma (Örneğin, zeta-sonda) membran örnekleri ve standartları için uygun bir boyut için uygun. Membran su 10 dakika ile bir nokta leke aparatı yerleştirmeden önce ıslatın. Kullanılmayan wells membran cihazları kapsar.
        Not: membran temiz cımbızla başa. Boş wells karşılamak için membran ile gelir lamba mavi koruma sayfası kullanılabilir. Örnekleri ve standartları bağlama önce kurumasını membran izin vermez. Montaj ve aparat kullanımı hakkında daha fazla bilgi için lütfen Kullanıcı el ile19' a bakın.
      2. Su hangi-ecek var olmak yüklü örnekleri wells ekleyin. Vakum ve çekme su kuyuları hata olup olmadığını denetleyin ve tamir ederken tekrar test için geçerlidir. Vidaları sıkı sızdırmazlık sağlamak için vakum uygulanırken yeniden sıkıştırın.
        Not: Eksik sızdırmazlık örnek kaçak kuyu arasında neden olabilir.
      3. Bir kez su tamamen üstesinden, vakum tamamen serbest bırakmak (yani, vakum manifold-meli var olmak açık hava basıncı için).
    4. Standartlar ve dot blot aparatı örnekleri yükleniyor
      1. Her şey için her seyreltilmiş plazmid DNA standart 400 µL uygulayın ve dört şeritli standart dilutions çalıştırın. Standart Özet iki ayrı aliquots kullanın ve her yinelenen olarak yükleyin. 200 µL/iyi her viral DNA örneğinin geçerli.
        Not: kalan ~ 40 µL denatüre örnekleri kullanarak, seyreltilmiş örnekleri (Örneğin, 10 kat seyreltilmiş örnekleri örnek 20 µL artı 1 alkalin çözüm x 180 µL kullanarak) hazırlanan ve gerekirse deyimiyle.
      2. DNA çözümleri iyi çekmek için nazik vakum uygulanır.
        Not: vakum basınç vakum basıncı nokta için uygulanan böylece kısmen üç yollu vana açarak ayarlanması gereken cihazlar gibi atmosfer leke (yani, de konumlandırılmış stopcock silah ile bir yaklaşık 45 derecelik açıyla nereye o bir daha yüksek sesle emme gürültü yapar).
      3. Bir kez tüm wells boşaltma, elektrikli üç yollu vana ayarlayarak serbest bırakın. 1 x alkalin çözüm 400 µL standartları ve örnekleri bulunan her şey ekleyin. 5 min için vakum kuyuları boşaltmak için yeniden uygulamadan önce bekleyin.
      4. Vakum aynı şekilde yeniden uygulayın (bkz. Adım 3.6.4.2).
      5. Nokta leke aparat vakum altında sökmeye, membran kaldırmak ve 2 ile durulayın x SSC. Membran temiz kağıt havlu üzerinde DNA bağlı yüzü yukarı bakacak şekilde-aşırı 2 kaldırmak için yer x SSC.
      6. UV-crosslink membran ile uygun bir UV crosslinker fotoğraflarda da DNA; membran şimdi hibridizasyon için hazırdır.
        Not: Islak membranlar UV crosslinking için kullanılabilir. Kurutulmuş, UV-çapraz membranlar oda sıcaklığında depolanabilir. Daha fazla bilgi Malzemeleri tablobulunabilir.
  7. Hibridizasyon ve yıkama
    1. Hibridizasyon arabellek 65 ° C su banyosunda ısıtın.
    2. Enzimatik bir DNA prob ile radyoaktif α -32P dCTP etiket ve üreticinin tavsiye göre piyasada kitleri kullanarak arındırmak.
      Not: 0.5-2.0 sonda kullanıyoruz kb uzunluğunda bir artırıcı organizatörü bölge veya viral genom protein kodlayıcı sırayla. Her ne kadar bu protokolü 32P olarak etiketlenmiş radyoaktif probları sinyal algılama için kullanır, radyoaktif olmayan chemiluminescent veya floresan problar de kullanılabilir (lütfen tartışma bölümüne bakın).
    3. Membran ile DNA bağlı yan hibridizasyon şişedeki orayı, durulama zar ile 5 mL hibridizasyon arabellek prewarmed ve tampon atmak. O zaman prewarmed hibridizasyon arabellek 10 mL ekleyin ve bir dönen hibridizasyon fırında 65 ° C'de ayarla şişe yerleştirin ≥5 min için döndürün.
    4. Sıcaklık-10 mg/mL güdülmesini ringa balığı ya da somon sperm DNA çözüm ve 32P olarak etiketlenmiş sonda (≥107 BGBM) 5 min için 20 µL 100 ° C'de ısı blok sette tüpler yerleştirerek denatüre Daha sonra ek-onları buz ≥2 min, kısaca, spin için soğuk ve buz üzerinde kullanımda kadar devam.
      Dikkat: radyoaktif DNA probları için 1,5 mL tüpler vidalı kapak ve O-ring ile kullanılması gerekir.
    5. Hızlı bir şekilde denatüre sperm DNA hibridizasyon hibridizasyon arabellekte radyoaktif Probe'a şişe 10 şişe sallamak ekleyin ve karışımı s. Şişe 65 ° C fırında dönün ve rotasyon ≥4 h 65 ° C'de şişeyle kuluçkaya.
    6. Hibridizasyon tamamlandıktan sonra rotasyon durdurmak, hibridizasyon şişe kaldırmak ve o zaman bir sızıntı geçirmez Tak mühür kap ile 50 mL konik tüp içine radyoaktif sonda solüsyonu dökün. Radyoaktif malzemeler için belirlenmiş bir buzdolabında mağaza uygun bir kap içinde sonda yerleştirilir.
      Not: Kullanılan hibridizasyon arabellek 4 ° C'de depolanan bir sonda ile en az 5 kere 5 min için 100 ° C su banyosunda hibridizasyon arabellek içeren bir sızıntı geçirmez Tak mühür kap ile 50 mL konik tüp yerleştirerek yeniden kullanılabilir.
    7. Membran ile 65 ° C'ye ısıtılmış arabellek yıkama yıkamak Hibridizasyon şişe yıkama arabellek 20-30 mL ekleyin ve 5 dk. bunu yıka 2 kez daha tekrar döndürün.
      Not: radyoaktivite yıkama çözüm ölçmek ve yerel Enstitüsü tarafından gerekirse kaydedebilirsiniz.
    8. Membran yıkarken, bir görüntü silgi 5 min için ekranda görüntüleme bir fosfor yerleştirin.
    9. Üçüncü yıkama sonra membran hibridizasyon şişeden kaldırmak, membran ile kağıt havlu üzerinde fazla arabellek çıkarın ve membran bir şeffaf plastik Kağıt tutucuya yerleştirin. Bir Gayger sayacı kullanarak membran üzerinde radyoaktif sinyalleri kontrol edin. Sinyal şiddeti bağlı olarak bir gecede 10 min için membran silinebilir fosfor görüntüleme ekranına maruz.
    10. Sistem tarama bir fosfor görüntü kullanarak ekran tarama ve sinyal şiddeti her noktanın üzerinde verileri elde etmek.
  8. Veri Analizi
    1. Elektronik tablo ve veri analiz yazılımı (Örneğin, Excel) kullanarak standart eğri çizme.
      Not: Standart eğri çizme için günlük günlük doğrusal regresyon kullanılmıştır.
    2. Nanogram-eşdeğer (ng-eq) viral DNA örneklerinin her biri için ilişkilendirme tarafından belirler. Ng-eq plazmid DNA viral DNA moleküllerinin sayıya eşdeğerdir standart bir eğri çizmek için kullanılan miktarıdır. Plazmid DNA uzunluğu 8.000 ne zaman bp, 1 ng-eq tek iplikçikli AAV viral DNA'ın karşılık geldiği 2.275 x 108 parçacıklar.
      Not: Ng-eq tarafından aşağıdaki denklemler viral parçacıkların sayıya dönüştürülebilir:
      Equation 1
      Equation 2
      AAV parçacıkları sayısı geleneksel "çok iyi" (vektör genleri) veya "DRP" (DNaz ben dayanıklı parçacıklar) olarak ifade edilir.
    3. Başlangıç malzemeleri AAV konsantrasyonları hesaplayın. Fotoğraflarda viral DNA % 66,7 temsil ettiği Equation 3 başlangıç materyallerde viral DNA'sı, 1.7 109 parçacıklar/mL x 1 ng-eq karşılık Equation 4 .
      Not: Eğer başlangıç materyali bulunan viral DNA kaybı olmadan bir membran üzerinde deyimiyle Bu düzeltme gerekli değildir (bkz. Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nicel nokta lekeleri büyük ölçüde üretilen saf AAV vektör stoklarının Nefelometri için temsil edici bir sonucu Şekil 1' de gösterilen. Bu dot blot yöntemi ile bir çift iplikçikli AAV2G9-CMV-GFP vektör hisse senedi titresi tespit edilmiştir. Vektör yoğunluğu-gradient ultrasantrifüj diyaliz yukarıda açıklanan20ardından sezyum klorür (CsCl) iki tur tarafından saflaştırıldı. Genel olarak, saf AAV vektör stokları için yinelenen bir değişiklik ile yukarıda tanımlanan nokta leke yordamı için üç farklı birimler her AAV vektör stokunun (Örneğin, 0.3 µL, 0.1 µL ve 0,03 µL) tabi tutulmaktadır. DNaz I enzim A S. marcescens endonükleaz adım 3.2 yerine kullanılır ve hulâsa ve viral DNA arındırmak için piyasada bulunan bir kit ( Tablo malzemelerigörmek) 3.4 adımda kullanılır. Şekil 1' de gösterilen örnekte, her plazmid DNA standart (Şekil 1A) elde edilen sinyal yoğunluk değerleri (rasgele birimi) bilinen DNA miktarları karşı bir korelasyon gösteren standart eğri (Şekil 1B), çizmek için çizildi 0.998 katsayısı. Bu standart eğri kullanarak, bu 0.3, 0.1 ve 0,03 µL aliquots AAV2G9 vektörünün 1.487 ve 1.522 ng-eq (0.3 µL), 0.487 ve 0.507 ng-eq (0.1 µL) ve 0,158 ve 0,171 ng-eq (0.03 µL) gösterdi ilişkilendirme tarafından belirlendi. Bunu aşağıdaki altı değerleri verdi: vektör ortalama 5,16 ± 0,27 ng-eq/µL (ortalama ± SD) önde gelen hisse senedi, 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 ve bu özel AAV2G9 için ng-eq/µL 5.700. (PEMBL-CMV-GFP) Standart 5,848 olduğu gibi kullanılabilir plazmid uzunluğu beri bp, bu AAV2G9 vektör titresi 8.0 x 1011 vg/mL denklem 2 göre adım 3.8.2 olmaya kararlıydım. Bu tahlil AAV vektör stoklarının son titreleri belirlemek için en az iki kez tekrarlanır.

AAP bağımlılık VP3 kapsid derleme ve AAPs için yeteneği VP3 proteinler Contegra kökenli bir araya olarak değerlendirmek için çapraz-uluslara deneyleri temsilcisi sonucu Şekil 2' de görüntülenir. AAV vitro çalışmalar genellikle virüs arıtma sonuçlara yapmak gerekmez ve unpurified virüs ürünleri ham hücre lysates ve virüs içeren kültür medya gibi kullanarak deneyler anlamlı sonuç vermeye yeterlidir. Bu deneyde, AAV viral parçacık üretim arasında AAV5, AAV9 ve yılan AAV VP3-Hayır AAP kombinasyonları dahil olmak üzere tüm AAV VP3-AAP kombinasyonları dan bir nicel nokta leke tahlil tarafından değerlendirildi. Bir deney yinelenen birtakım elde örnekleri 1 x ve 10 x dilutions deyimiyle (Set A ve ayarla B Şekil 2A, sırasıyla). Gösterilen Şekil 2B grafik nokta kantitatif analiz özetler. Sonuçları gösteriyor ki: (1) AAV5VP3 çeviren AAP5 daha az AAP9, (3) daha etkili bir şekilde çalışır, ancak trans içinde (2) AAP5 ve AAP9 AAV9VP3 kapsid derleme teşvik sağlanan AAP olup olmadığını ne olursa olsun ne AAP5 ne de AAP9 sergileyen etkinliği teşvik bir derleme Yılan AAV VP3 ve (4) yılan AAP sadece yılan AAV VP3 Meclisi teşvik. (1) ve (2) önceki gözlemler6ama benzersiz olarak belirli AAV VP3-AAP doğrultusunda yılan AAV etkileşiminde bu deneyde yeni bir keşif olduğunu. Bir nicel nokta leke göre çapraz-uluslara testin negatif kontrol her zaman tamamen ortadan olamaz arka plan sinyalleri kayda değer düzeyde gösterir zayıflıktır. Bu nedenle, tek başına nokta leke tahlil olasılığını dışlayamazsınız Testin duyarlılığı aşağıda bir seviyeye Bu kapsid toplanır. Bu bağlamda, negatif denetimleri oluşturmak için bir koşul altında hangi AAV viral genom katlanarak kapsid VP3 protein yokluğunda Çoğalt kullanıldığını, unutulmamalıdır. Negatif gibi denetimleri HEK 293 hücreleri pAAV-muhabir, pHLP-Tem ve pHelper (Tablo 2) transfecting tarafından oluşturulan ve yanlış pozitif azaltmak için kullanılır.

DNaz ben yaygın olarak bir nükleaz nokta leke ve qPCR tabanlı deneyleri AAV Nefelometri için kalan plazmid DNA'lar ve AAV hazırlıkları kirlenmiş ambalajsız viral genom kaldırmak için kullanılmıştır. Bu kirleticiler Aksi takdirde titreleri bir tahmindi için yol açacak; Bu nedenle, nükleaz sindirim doğru viral genom titreleri miktarının için çok önemli bir adımdır. DNaz ben enzimlerdir çeşitli üreticileri ve ticari satıcıları; Ancak, DNaz seçimine önem ı AAV Nefelometri underappreciated görünüyor. Nükleaz seçimi nokta leke tahlil sonuçlarını nasıl etkileyeceğini öğrenmek için aşağıdaki üç nükleaz yukarıda 2 adımda açıklandığı gibi hazırlanan AAV vektör içeren kültür ortamından arka plan sinyalleri kaldırmak yeteneklerini için karşılaştırıldı ve 3: DNaz ben enzim A, DNaz I enzim B ve S. marcescens endonükleaz (Malzemeler tablo). Yayınlanan çalışmalar eski iki DNaz kullandım ben enzimler13,21,22,23,24 ve biz kullanıyor S. marcescens endonükleaz önceki ve geçerli çalışmalar. Bizim için sürpriz, bu enzim A DNaz I hiç de yüksek arka plan sinyalleri DNaz I enzim B süre negatif denetiminden sonuçlanan çeşitli koşullarda test, virüs içeren medyayı kullanarak nokta leke tahlil için uygun bir seçim değil tespit edildi ve S. marcescens endonükleaz etkili DNaz I enzim B varlık arka plan sinyalleri ~ S. marcescens endonükleaz (Şekil 3A, B) 2 kat daha etkili. DNaz I enzim C Ayrıca arka plan sinyalleri (veri gösterilmez) azaltmak çok etkili olduğu bulundu. Bu veriler nükleaz sindirim etkili küçük bir zaman olmalı rağmen enzim reaksiyonları unpurified AAV hazırlıkları ne zaman gerçekleştirileceğini enzim aktiviteleri piyasada bulunan enzimler arasında önemli farklılıklar vardır göstermek Arıtılmış viral preps miktarı en iyi duruma getirilmiş bir şartla kabul edilir. Böylece, ne zaman unpurified AAV hazırlıkları bir nicel nokta leke veya qPCR tahlil tabi bu veri nükleaz tahlil doğru seçilmesi önemini vurgulamak.

Figure 1
Resim 1: bir CsCl saf AAV vektör titresi belirlemek için temsilcisi dot blot analizi. (A)çift iplikçikli AAV2G9-CMV-GFP vektör HEK 293 hücrelerde bir standart büyük ölçüde adenovirus ücretsiz üç plazmid transfection yöntemi tarafından üretilen ve diyaliz tarafından takip CsCl degrade ultrasantrifüj iki tur tarafından arıtılmış. 0.3, 0,1 ve (en sağdaki sütunu deyimiyle) saf AAV vektör Stok 0,03 µL yinelenen yinelenen plazmid DNA standartları (CYBH) iki kümesi ile kantitatif nokta leke tahlil için tabi tutuldu. Leke 32P olarak etiketlenmiş GFP sonda (0,77 kb) ile melezleşmiştir ve görüntü sistem tarama bir fosfor görüntü kullanarak elde edildi. (B) A standart eğri bilinen plazmid DNA miktarları (ng-eq, x ekseni) ve nokta yoğunluklarda (rasgele birimi (AU), y ekseni) arasındaki ilişkiyi gösteren. Y ekseni olusan sistem taraması fosfor görüntü ile elde edilmiştir. Pearson korelasyon katsayısı R gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: AAV VP3-AAP çapraz-uluslara nokta leke tahlil. Çift iplikçikli AAV-CMV-GFP vektör parçacık üretim AAV5, AAV9 ve yılan AAV VP3 proteinler için varlığı veya yokluğunu soydaş onların AAPs veya AAPs kapaklı kökenli huzurunda nda test edildi. (A) tahlil gerçekleştirilen deneyler (Set A ve B ayarla) S. marcescens endonükleaz ile 4 h kuluçka süresi ile biyolojik olarak yinelenen kümesi ve her arada gelen elde AAV vektör titresi nicel bir nokta tarafından belirlendi Protokol bölümünde açıklanan yöntemi leke. Her nokta üçte iki temsil eder (5. ve 6 satırları, % 66,7) veya iki thirtieths (7 ve 8 satır, % 6.7) orta her 200 µL kurtarılan DNA'ın toplanan örnekleri veya negatif kontrol. En iyi dört satır (1-4 satır) yinelenen (yani, Çift iplikçikli AAV-CMV-GFP vektör üretim için kullanılan plazmid Doğrusallaştırılmış pEMBL-CMV-GFP plazmid) plazmid DNA standartları (STD 1 ve STD 2) iki set deyimiyle temsil eder. Nokta leke membran ile 32P olarak etiketlenmiş GFP probe probed. Yuvarlak köşeli dikdörtgenler ile belirtilen nokta çifti negatif denetimleridir. En iyi iki satır (STD 1) orijinal leke derinliklerinden vardır ama edilmiş kesim ve her iki plazmid standartları (STD 1 ve STD 2) yan yana görüntülemek için görüntü yoğunluğu değiştirmeden yukarı taşındı. Bu manipülasyon şekilde siyah bir çizgi ile gösterilir. (B) Viral titresi VP3 kombinasyonları için kararlı olduğunu ve tahlil AAP proteinler tarafından nokta leke. Grafik veri, iki Panel A ve iki gösterilmez başka bir nokta leke biyolojik olarak quadruplicated bir kümesini temsil eder. Hata çubuklarını gösterir demek + / SD (n = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir karşılaştırma enzimatik unpurified AAV vektör müstahzarları farklı enzimler faaliyetlerinin. (A) A kantitatif nokta leke arka plan sinyalleri giderilmesinde her nükleaz tedavi etkinliğinin gösterilen. Bir çift iplikçikli AAV9-CMV-GFP hazırlık ("AAV9 vektör") vektör içeren ve bir "Hayır-kapsid denetimi" HEK 293 hücre transfection ile plazmid DNA'lar tarafından üretilen ve tahlil için tabi. Hayır-kapsid kontrol viral parçacıkların içermiyordu ancak katlanarak güçlendirilmiş ambalajsız CMV GFP vektör genleri içeriyordu. MgCl2 0.8 mM MgSO4 ortamda mevcut dikkate almadan, bir veya üç-kez önerilen (6 mM ve 18 mM için DNaz I enzim A; ve 2.5 mM ve DNaz I enzim B için 7.5 mM) tutarların takıma. S. marcescens endonükleaz ile tedavisi için sadece bir şartla protokol bölümünde açıklanan test edildi. Tüm örnekleri için 1 h her nükleaz ile tedavi edildi. Nokta leke membran ile 32P olarak etiketlenmiş GFP probe probed. Şu iki sütun (STD 2) orijinal leke soldan vardır ama edilmiş kesim ve her iki plazmid standartları (STD 1 ve STD 2) yan yana görüntülemek için görüntü yoğunluğu değiştirmeden sağa taşındı. Bu manipülasyon şekilde ince siyah bir çizgi ile gösterilir. Hayır-kapsid kontrol örnekleri panelinde A (B) nokta sayılabilir ve görüntülenen ortalama ± | her değer — demek değer |. Yedi DNaz I enzim A (yıldız ile belirtilen) ile tedavi 12 örnekleri dışında sadece ve en yüksek standart biraz daha yüksek değerleri gösterir; Bu nedenle, karşılaştırma için bu grafikte dahil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Serratia marcescens Endonükleaz arabellek
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
4 M NaOH ile pH 8,5 için ayarlayın.
10 x İndinavir K arabellek
100 mM Tris-HCl pH 8.0
100 mM EDTA pH 8.0
%5 SDS
2 x alkalin çözüm
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175.3 g NaCl
88.2 g sodyum sitrat Tribazik (Na3C6H5O7)
Denhardt'ın çözüm 100 x (50 mL)
1 g Sığır serum albumin (Kesir V) Not: Filtre arka plan hibridizasyon sinyalleri onlar neden küçük parçacıklar kaldırmak için önemlidir.
1 g Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidone
20 ml 55 ° C su banyosu suda çözülür.
50 ml nihai ses düzeyini ayarlayın.
Filtre-0.22 mikron filtre ile sterilize.
Hibridizasyon arabellek
% 1 SDS Not: Mağaza hibridizasyon arabellek 4 ° C ve ısı kullanmadan su banyosu önce 65 ° c.
6 x SSC
Denhardt'ın çözüm x 5
10 mM Tris-HCl pH 8.0
Yıkama arabellek
%0.1 SDS
0,1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) çözüm (1 mg/mL, 500 mL)
500 mg PEI 450 mL su ekleyin ve karıştırın. Not:-80 ° C daha uzun depolama için önerilir.
Konsantre HCl pH aşağı getirmek için Ekle < PEI çözülmeye 2.0 (yaklaşık 800 µL HCL gerekli olacak).
10 M NaOH pH ilâ 7.0 getirmek için Ekle (yaklaşık 500 µL 10 M NaOH-ecek var olmak gerekli).
500 mL su için ses düzeyini ayarlayın.
Filtre-0.22 mikron filtre ile sterilize.
Aliquot ve mağaza-20 ° C'de
Fenol-kantitatif nokta kurutma için kloroform (1:1 mix)
Arabellek doymuş fenol (pH 8.0) ekleyin ve 1:1 oran 50 mL polipropilen konik tüp içinde kloroform. Not: organik katmanı kapsayan tampon tüp, Eğer pipetting üzerinden örnek tüpler içine devredilmesini ve tahlil yanlış yapabilir.
Girdap tüp kuvvetle karıştırın.
Santrifüjü tarafından faz ayrılması için izin ve sulu katman tamamen kaldır.
4 ° C'de mağaza

Tablo 1: çözüm ve arabellek tarifleri. Çözümler ve nicel nokta tamamlamak için gereken arabellekleri için yemek tarifleri Protokolü leke.

Plazmid AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negatif kontrol (μg) Transfection denetimi (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0,4 0,4
pCMV-bayrak-AAPx 0,4
pAAV-muhabir 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
pCMV (boş) 0,4 0.8
pCMV-GFP 2.0
Toplam 2.0 2.0 2.0 2.0

Tablo 2: plazmid kombinasyonları AAV VP3-AAP çapraz-uluslara tahlil için gerçekleştirilen 6-şey plaka biçiminde. Plazmid HEK 293 hücre transfection deneysel her grup için kullanılacak DNA'lar kombinasyonları gösterilir. pCMV-AAVx-VP3, AAV serotip ifade bir plazmid x (x = 1, 2, 3, vb) VP3 protein altında CMV-IE enhancer-organizatörü; pCMV-bayrak-AAPx, bir plazmid AAV serotip ifade x (x = 1, 2, 3, vb) AAP protein altında CMV-IE enhancer-organizatörü; pAAV-muhabir, iki ters AAV2 terminal yineler (ITRs) ve rekombinant AAV vektör üretimi için tasarlanmış bir plazmid; pHLP-Tem, AAV2 Rep protein ifade bir plazmid; pHelper, adenovirus yardımcı plazmid; pCMV (boş), boş bir plazmid deneysel koşullar kontrol etmek için eklendi; pCMV-GFP, başarılı transfection doğrulamak için bir floresan marker gen (Örneğin, GFP) ifade bir plazmid. Transfections 6-şey levha yapıldığı ve plazmid DNA'lar 2 µg toplam'ı kullanırsınız.

Mix A 10 tüpler (μL)
Serratia marcescens Endonükleaz arabellek 91.2
0.1 M NaOH 8.8
Toplam 100
Mix B 10 tüpler (μL)
Serratia marcescens Endonükleaz arabellek 91.2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonükleaz (250 adet/μL) 0.176
Toplam 100
Mix C 10 tüpler (μL)
10 x İndinavir K arabellek 400
İndinavir K (20 mg/mL) 100
H2O 1300
Toplam 1800
Mix D 10 tüpler (μL)
% 100 etanol 8.000
3 M sodyum asetat (pH 5.2) 320
İstiridye glikojen (20 mg/mL) 10
Toplam 8,330

Tablo 3: Ana mix reaktifler listesi. Mix A ve Mix B adım 3.2 S. marcescens endonükleaz tedavisinde kullanılır. Bu iki karışımları Magnezyum hidroksit yağış önlemek için ayrı ayrı yapılması gerekir. Mix C adım 3.3 İndinavir K tedavi için kullanılır. Mix D adım 3.4.3 etanol yağış için kullanılır. Ana mix kimyasalları 10 tüpler için tabloda belirtilen birimleri vardır.

Plazmid DNA standart (ng) Birimler (µL) 25 pg/µL plazmid DNA çift çözüm Birimler (µL) su Toplam hacim (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1,25 150 450 600
0.625 75 525 600
0,313 37.5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0.078 9,4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Tablo 4: nicel nokta leke plazmid DNA standartları. 25 pg/µL plazmid DNA standart çözüm ve su veya TE plazmid DNA standartları tarafından iki kat seri dilutions (600 µL/tüp) hazırlamak için gerekli birimler gösterilir. Plazmid DNA standart sütunundaki sayıları (0.039-5 ng) DNA miktarı 200 µL her plazmid DNA standart çözüm vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu raporda, nicel nokta leke deneyleri AAV AAPs ve kapsid derleme içindeki rollerine çalışmaya yardımcı programı açıklanır. Bu çalışmalardan elde bilgi AAPs işlevsel rolü farklı serotipleri arasında ve doğuştan gelen farklar AAV kapsid montaj sürecinde ayrıntılı kazandırabileceğini. Bu bağlamda AAV VP3-AAP çapraz-uluslara nokta leke yılan AAV VP3 soydaş, AAP kapsid derleme için ortak ifade sıkı bir bağımlılık görüntülenen ve yılan AAP Contegra serotipleri kapsid Meclisi teşvik değil ortaya tahlil . Bu gözlem ilginç çünkü AAP bağımlı AAV bu serotypes daha önce incelenmiş (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 ve 12) tüm derleme en azından işlemek bir dereceye kadar bir kapaklı AAP6kullanarak edebiliyoruz.

Nicel nokta veya yuvası blot hibridizasyon nükleik asitlerin uygun şekilde25içinde aynı anda birden çok örnekleri bulunan Nefelometri için geleneksel bir yöntemdir. QPCR 1990'larda26,27' yaygın olana kadar yaygın olarak DNA ve RNA Nefelometri için kullanılmıştı. Her ne kadar qPCR nicel nokta leke üzerinde avantajları vardır ve bu qPCR diğer hibridizasyon tabanlı deneyleri sergileyen bir daha yüksek hassasiyet ve daha geniş bir dinamik alan, aynı zamanda böyleydi katlanarak hataları bilmeden, güçlendirme, doğal bir risk taşıyor için titreleri AAV vektör stokları qPCR13,23tarafından belirlenir. Nicel nokta leke deneyleri ile ucuz bir maliyet kolayca ayarlanır ve araştırmacılar nokta leke Membranlar ile radyoaktif bir probe melezleşmiştir gelen sinyaller elde edebilirsiniz nicel bir moleküler görüntüleme sistemi erişiminiz olduğu sürece kolayca yürütülen veya bir radyoaktif olmayan chemiluminescent veya floresan sonda. 32P olarak etiketlenmiş radyoaktif probları sinyal algılama için bu protokolü kullanır rağmen diğerleri başarıyla radyoaktif olmayan DNA Probe prob doğrudan bir piyasada bulunan opsonins alkalen fosfataz28' etiketli kullanın. Nokta leke deneyleri basit bir prensip kullanın ve tek başına tahlil sanatçılar için teknik bir sorun teşkil etmez; Bu nedenle, sonuçlar genellikle bile deneyimsiz kişiler tarafından tekrarlanabilir.

Burada anlatılan uygulamaların yanı sıra, rutin olarak yarı ölçmek AAV parçacıklar sürede nokta leke prosedürü basitleştirilmiş ve hızlandırılmış sürümünü kullanın. Bu bağlamda nokta leke deneyleri avantajları şunlardır: (1) tahlil arıtma gerektirmez veya alır saat, ısı ve alkali denatürasyon (2) bir arada enzimatik viral genom amplifikasyon AAV parçacıklar bir örnekte kırmak yeterli çözüm ve yayın nokta leke membran ve (3) yüksek tuz varlığı bağlamak hazır çözüm içine viral genom denatüre örnekleri konsantrasyonlarda önemli ölçüde tahlil sonuçları etkilemez. Örneğin, CsCl-zengin çözümler (Örneğin, CsCl yoğunluğu-gradient ultrasantrifüj tarafından elde edilen kesirler) yarı ölçmek mümkün AAV parçacıklar küçük aliquot (≤10 µL) koyarak örnekleri 1 100 ° Isıtma alkalin çözüm x 100 µL içine taşıyor C 10 dk ve üzerine bir membran ile ya da ezelî standartlar önceden hazırlanmış, ardından 15 dk hibridizasyon, 3 x 3 dk yıkama ve maruz kalma bir fosfor 15dk için ekran görüntüleme (veya daha uzun bir sonda ile azalan radyoaktivite kullanırken) kurutma için. Bir kez Kullanıcı yordamı ile tanıdık olur tüm prosedürü 1s içinde tamamlanabilir. Biz alışıldığı "kaynar dot blot yöntemi" dediğimiz bu hızlandırılmış yöntemi kullanın, AAV tanımlamak için parçacık zengini CsCl kesirler vektör arıtma sırasında işlemek ve kabaca titreleri arıtılmış AAV vektör stoklarının geniş başlamadan önce belirlemek vektör karakterizasyonu için işlemleri. Böylece, nokta leke deneyleri nükleik asitler ölçmek ve zaten bilimsel disiplinlerden geniş bir alanda PCR tabanlı çeşitli yöntemlerle yerini almış demode bir yöntem olarak izlendi olabilir rağmen hala bir dizi vardır gerekir bu yöntemin avantajları araştırmacılar kendi laboratuvarlarında istihdam dikkate olun.

En kritik protokolündeki örnekleri nükleaz tedavisinde adımdır. Bu adım en uygun bir durumda gerçekleştirilir değil, bu yüksek arka plan sinyalleri neden olur. S. marcescens endonükleaz DNaz yaparken kullandığımız ben farklı kaynaklardan enzimler yaygın viral DNA miktar için diğer laboratuvarlarda kullanılan. DNaz ben sığır pankreas kökenli en yaygın araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Sığır pankreas DNaz ilk tespit ve en kapsamlı biyokimyasal olarak karakterize29kısmen olmasıdır. DNaz ben Pichia pastoris (DNaz ı enzim A), (Örneğin, DNaz I enzim B), sığır pankreas arıtılmış doğal formu gibi birkaç farklı biyolojik kaynaklardan üretilen enzimler Şu anda ticari satıcıları tarafından sağlanan ve Rekombinant enzim bir Maya türler veya Escherichia coli (DNaz I enzim C) üretti. Bu DNaz bulduk ben enzimler üçü bu farklı kaynaklardan gelen yayımlanmış AAV vektör Nefelometri çalışmalarda; kullanılan Ancak, bizim bilgi için önceki çalışmalarda hiçbiri farklı kaynaklardan eşit derecede etkili bulaşıcı DNA molekülleri AAV vektör müstahzarları sindirerek enzimlerdir olup olmadığını araştırdı. Bu unutulmamalıdır bu DNaz ben tedavi AAV vektör deneyleri için sık sık yapılmaktadır kültür orta ve hücreleri elde yabancı maddelerin varlığı nedeniyle olmayan koşullar altında. DNaz I enzim A yalnızca biz kullanılan kültür ortamında kısmen etkindir gözlem nokta leke ve qPCR tarafından AAV vektör Nefelometri için tahlil tasarımında önemli etkileri vardır ve araştırmacılar bu evvelce tanımlanamayan sorunu için uyarır. Bu bağlamda, S. marcescens endonükleaz E. coli, ifade sadece AAV vektörel çizimler üretim amacıyla aynı zamanda AAV vektör Nefelometri için ideal bir endonükleaz var. Enzimatik faaliyete pH değerleri geniş bir yelpazesi ve magnezyum iyonları ve monovalent katyon konsantrasyonları üzerinde muhafaza edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, ve S. marcescens endonükleaz yaklaşık DNaz I enzim B başına birim baına 2 kez daha ucuz olduğu için biz rutin nicel nokta leke analizleri içinde S. marcescens endonükleaz kullanmayı tercih eder.

Özetle, nicel nokta leke deneyleri kolayca bilgi çeşitli koşullarda oluşan viral parçacıkların üretmek için yeteneği sağlayabilir nispeten basit bir yordam bulunmaktadır. QPCR gibi alternatif titering yaklaşımlara göre küçük, varsa, en iyi duruma getirme bu yaklaşım gerektirir. Bu da kolayca herhangi bir serotip vektörlerinin uygulanabilir ve her iki tek - ve çift iplikçikli vektörler iletişim kuralını değiştirmeden titresi için kullanılabilir. Aşağıdaki transfections ve hasat AAV vektör içeren örnekleri (kültür orta ve/veya hücreleri), tüm protokol bir günde, böylece hızla yeteneği dahil olmak üzere çeşitli koşullar viral parçacıkların üretmek için ilgili soruları yanıtlayan tamamlanabilir AAV VP3 ve AAP proteinler çeşitli birleşimleri. Nicel nokta lekeleri VP-AAP etkileşimler olarak çeşitli cevapsız sorular ve rolleri çeşitli farklı AAV serotipleri ve yalıtır kapsid derlemesinde gidermek için uygun bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Xiao Xiao Kuzey Carolina Üniversitesi, Chapel Hill pEMBL-CMV-GFP plazmid ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Christopher Cheng ve Samuel J. Huang el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından desteklenmiştir (NIH R01 NS088399 ve T32 EY232113) halk sağlığı hizmeti verir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Biyoloji sayı: 136 Adeno ilişkili virüs (AAV) derleme aktive protein (AAP) çapraz-uluslara nicel nokta leke tahlil viral titresi gen tedavisi
Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter