脑 organoids 代表了一个新的模型系统来研究早期人脑发育体外。本文提供了详细的方法, 以有效地产生同种背前脑型 organoids 的人诱导多能干细胞, 包括关键的表征和验证步骤。
人类皮质高度膨胀, 呈现出具有特定功能区域的复杂结构, 提供更高的脑功能, 如认知。研究人类大脑皮层发育的努力受到了模型系统的可用性的限制。从啮齿类动物研究到人类系统的翻译结果受到物种差异的限制, 而人类原发性组织的研究由于缺乏组织的可用性以及伦理问题而受到阻碍。人类多能干细胞 (PSC) 技术的最新发展包括三维 (3D) 自组织器官培养系统的生成, 它在一定程度上模拟了人类特定的大脑发育体外。目前, 各种协议可用于整个大脑或脑区特定 organoids 的生成。从诱导 psc (iPSC) 中产生的同源和可重现前脑型 organoids 的方法, 我们在此之前建立和描述, 结合了 psc 对自组织的内在能力, 并将其引导分化为前神经谱系和基质嵌入支持连续神经细胞的形成。更具体地说, 本议定书涉及: (1) iPSC 聚合体的生成, 包括 iPSC 菌落向融合单层培养的转化;(2) 前外胚层的诱导;(3) 神经骨料在基质支架中的嵌入;(4) 从神经集料中产生前脑型 organoids;(5) 前脑型 organoids 的固定和验证。因此, 该协议提供了一种易于适用的系统, 用于生成标准化和可重现性的 iPSC 皮层组织结构体外。
人脑显然是最复杂的器官之一, 并对所有人类的智力能力负责。因此, 深入了解人类特定的大脑发育是理解人类认知能力的重要前提。传统上, 转基因动物充当模型生物体来研究大脑发育。这些模型为大脑发育的原理提供了基本的洞察力。我们现在知道, 所有哺乳动物大脑发育的一个共同特征是祖细胞增殖、神经形成和神经元迁移的精确编排。然而, 在模型生物体的大脑, 如啮齿动物和人类, 特别是在大脑皮层, 存在着显著的结构差异。已提出的主要机制, 以促进灵长类皮层的进化是增加增殖的茎和祖细胞, 以及生成外桡神经胶质细胞 (oRGCs), 这只是很少发现在啮齿目动物1 ,2,3。
人类大脑皮层发育模型的方法包括: PSC 衍生的 telencephalic 祖细胞和大脑皮层投射神经元作为单层培养物的生成。这些标准化的差异性协议重放了人类皮层发育的某些方面, 如皮层神经再生的常规时间顺序4。然而, 当涉及到器官发育过程的重述时, 如空间模式和形态发生, 它们就会出现短缺。干细胞生物学的最新发展导致了从公司的3D 化文化的建立, 这是革命性的研究的体外人类器官。利用公司的能力, 自我组织成器官结构, 各种 organoids, 反映器官的关键结构和功能的性质, 包括肾脏, 肠道, 眼睛和大脑已经建立5。此类 organoids 包含多个器官特异的细胞亚型, 在体内组织与发育器官非常相似的在活体中5,6。此外, 细胞组成, 血统关系, 和基因网络研究使用单细胞 RNA 测序显示, 人脑 organoids 忠实重述人类胎儿大脑皮层的发展, 如基因表达程序的主要方面7,8. 然而, 目前阻碍其广泛应用的一个主要缺点是, 批量变更和化化异构性9。
在这里, 我们提供了一个简单的和标准化的前脑型化文化系统的详细协议。该系统的关键特点是它有效地和性生成了 PSC 派生的 organoids 几乎独占的背 telencephalic 身份。该协议基于我们最近的单元报告文件10中使用的方法。它结合了干细胞的自组织能力与选择性诱导皮质神经细胞, 并能在3周内有力地生成早期背 telencephalic 组织的同源培养物.该协议建立在先前报告的 SMAD 信号和 Wnt 抑制策略上, 它引导 PSC 向前神经谱系的分化11,12与矩阵嵌入相结合, 这促进大型连续上皮结构的形成13。我们已经成功地在不同的 iPSC 线上使用了描述的方法, 每个个体有几个克隆。结果表明, 该系统适用于可重复性和均匀性都具有重要意义的下游应用, 如疾病建模等。当将该协议应用于患有严重皮质畸形患者的干细胞时, 我们能够重述该病的病理特征体外, 并确定新的分子机制导致表型更改10。我们建议, 所描述的化协议可以用来弥合简化 PSC 的皮层单层培养和体内研究之间的差距, 并表示它代表一个可靠和稳定的细胞为基础的模型系统, 以模拟早期人体皮质发育在健康和疾病之外的人体。
脑 organoids 代表了一个强大的工具, 研究人脑的发展在体外, 因为它们提供了相关的物种背景和复杂的3D 排列细胞在一个组织的背景。因此, 他们弥合非人类动物模型和简化人的二维单层细胞培养技术之间的差距。但是, 它们的应用程序由于缺乏重复性9而受阻。我们已经开发出一种前脑型化协议, 它通过将 iPSC 的自组织能力与它们的可结合起来, 从而克服了大样本到样本的变异性。具体地说, 干细胞被聚合以促进自组织, 并随后抑制 TGF-?/SMAD 信号, 通过向 BMP (LDN-193189) 和 TGF β型受体抑制剂 (A83-01) 暴露培养促进背皮质分化。此外, 还采用了一种抑制 Wnt 通路 (IWR) 的化合物来防止 posteriorization。与 “内在的” 脑化协议19不同, 它们是基于无外部控制的自组装而产生的非均匀的脑 organoids, 并表现出大量的间歇性变化 (以极化的效率来衡量神经外胚层形成15), 这里描述的协议性产生同质的前脑特定的 organoids 从人类干细胞。
这些前脑型 organoids 可用于各种应用, 如神经发育研究, 进化研究, 包括基因功能研究, 疾病建模和, 潜在的, 药物检测和治疗的目的。然而, 该议定书最适合于研究人类皮质发育的早期方面。例如, 我们用前脑型 organoids 来检查 vRGC 行为的人的特定方面。更具体地说, 病理生理学的变化与严重形式的 lissencephaly, 人类皮质畸形的特点是近没有皮质折叠, 是解决。只有某些方面的这种疾病可以模仿老鼠的大脑是自然 lissencephalic。当将化系统应用于 lissencephaly 患者的干细胞时, 我们可以可靠地重述该疾病的人的特定方面, 并确定潜在的机制。更具体地说, 我们可以证明, 病人获得的 organoids 显示, 由一个开关从对称到不对称的 vRGCs 细胞分裂造成的大小显著减少。这个开关与 vRGCs 的微管网络组织的改变有关, 破坏了 VZ 生态位的结构, 改变了细胞黏附分子的表达, 导致了 n-钙黏蛋白/β-蛋白的活化作用受损。信号轴10。注意: β-蛋白依赖性的 vRGC 分裂模式的调节被认为是人类特有的, 因为β-蛋白的过度表达导致了小鼠的切皮质扩张, 随后皮质折叠20。因此, 我们的数据强调, 前脑型化系统代表了一个有希望的工具, 以量化的方式研究早期皮质发育的人类特定方面的体外。
未来的一个主要挑战是保持 organoids 的均匀性, 以达到更成熟的神经元表型。这可能由以下一种或多种实现: 在生物反应器系统中培养 organoids14, 应用漂浮支架的15, 补充分化培养基与神经生长, 或神经元生存因子。最后, 通过将前脑型 organoids 与不同区域身份21,22的脑 organoids 融合, 可以实现大脑复杂性的控制增加。
两者结合在一起, 前脑型化协议提供了一个容易适用和可靠的工具, 为早期皮质结构的生成体外。该协议产生了高度均匀的早期皮质组织横跨多个 iPSC 线, 并可用于可靠地生成个别特定的皮质组织。因此, 该系统特别适用于需要高度的同质性和重现度 (如疾病建模) 的应用。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了北莱茵-威斯特伐利亚 (初级研究小组) 创新科学和研究部的支持, 并受到了时代网神经元 JTC 2015 神经发育紊乱的支助。
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |