Summary
脳 organoids 早期脳開発生体外で調査する新しいモデルのシステムを表しています。この資料では、効率的に重要な特性評価および検証手順などひと誘導多能性幹細胞から同種の背側前脳型オルガノイドを生成する詳細な方法論を提供します。
Abstract
人間の大脳皮質は、高を拡大し、認知などの高次脳機能を提供する特定の機能分野の複雑な構造を展示します。人間の大脳皮質発達を研究する努力は、モデル システムの可用性によって制限されています。種差に限定され人間システムに齧歯動物の調査からの結果を翻訳、人間の主要な組織の研究は、倫理的な問題と同様、組織の可用性の欠如によって妨げられています。ひと多能性幹細胞 (PSC) 技術の最近の発展には、三次元 (3 D) 自己組織切片培養システムを一定程度人間固有の脳開発体外を模倣の生成が含まれます。現在、さまざまなプロトコルは、全脳の脳領域特定 organoids 世代使用できます。メソッドから均一で再現可能な脳型オルガノイドの世代以前に確立した PSC (iPSC) を誘発し、ここでは、説明を組み合わせた自己誘導分化の時点で整理する PSC の本質的な能力、前方の神経系統と連続神経上皮の形成をサポートする埋め込み行列。具体的には、このプロトコルが含まれます: (1) iPSC コロニーのコンフルエント単層培養への変換を含めて、iPSC 集計の生成(2) の前部のように誘導(マトリックス足場; 神経外胚葉性骨材を埋め込む 3)(神経外胚葉性総計; から前脳型オルガノイドの 4) の生成(5) と固定と前脳型オルガノイドの検証。そのため、このプロトコルは、標準化され、再現性のある iPSC 由来の大脳皮質組織構造の in vitroの世代のため簡単に該当するシステムを提供します。
Introduction
人間の脳は最も複雑な器官の一つでは明らかに、すべての人間の知的能力を担当。したがって、特定の人間の脳の発達のより深い理解は、人間の認知能力を理解するための重要な前提条件です。伝統的には、トランスジェニック動物は、脳の発達を研究するためのモデル生物として提供しています。これらのモデルは、脳の発達の原理に基本的な洞察力を提供します。すべての哺乳類の脳の発達の一般的な機能は前駆細胞増殖、神経新生、そして神経細胞移動の正確な振り付けであることが分かっています。ただし、齧歯動物および人間、特に新皮質などのモデル生物の脳の重要な構造的な違いがあります。霊長類大脳皮質の進化に貢献する提案されている主なメカニズムは、幹・前駆細胞増殖の亢進だけでなく、1 の齧歯動物に見られる非常に稀ただ外側の放射状グリア細胞 (oRGCs) の生成 ,2,3。
モデル人間の大脳皮質の開発方法には、単層培養として PSC 派生胎生前駆細胞と大脳皮質投射ニューロンの生成が含まれます。これら分化の標準化されたプロトコルは、皮質ニューロン新生4のステレオタイプ的な時間順序など皮質発達の特定の側面を再生します。空間パターン形成と形態形成などの器官の発達プロセスの反復になるとき、彼らはしかし、短い落ちる。幹細胞生物学の最近の進展は、Psc は、人間の器官培養の研究に革命を起こしているから 3 D における文化の確立につながった。Psc の脊髄構造自己組織化能力を利用して、腎臓、腸、目、脳などの器官の構造と機能のキー プロパティを反映する様々 な organoids は確立された5とされています。このような organoids には、一緒にグループ化、空間的整理5,体内の開発機関6非常のような複数の臓器特異細胞サブタイプが含まれます。人間脳 organoids が忠実に遺伝子発現プログラムなど人間の胎児の大脳新皮質の開発の主要な側面を要約に加えて、セル構成、系統関係と単一細胞 RNA シーケンスを用いた遺伝子ネットワークの研究が明らかにしました。7,8. ところに彼らの広範なアプリケーションを防止するには、1 つの主要な欠点は、しかし、大きなバッチに変化や organoid-における不均一性9。
ここでは、シンプルで標準化された前脳型 organoid 文化システムの詳細なプロトコルを提供します。このシステムの主な特徴、効率的かつ再現性をもって生成ですほとんど排他的な背胎生アイデンティティの PSC 派生 organoids。プロトコルは、最近セル レポート用紙10使用方法に基づいています。それは皮質神経上皮の選択的誘導と Ips の自己組織化能力を組み合わせた、. 3 週間以内初期背胎生組織の均質な文化を生成すること確実以前に報告した SMAD シグナリングと埋め込みをマトリックスとの組み合わせで前方の神経外胚葉性系統11,12に向けて PSC の分化をガイド Wnt 抑制戦略構築プロトコル13大規模かつ継続的な上皮細胞内構造の形成を促進します。正常に様々 な iPSC ライン、個人あたりのクローンのいくつかにこの方法を使いました。このシステムは再現性と均質性が重要疾患モデリングなどの下流のアプリケーションに適していることを示した.体外病の病理学的特徴を要約して、表現型につながる新しい分子メカニズムを識別することができました Ips にプロトコルを適用することは、深刻な脳の奇形を患っている患者から派生される場合10をに変更します。還元 PSC から派生した皮質単層培養と生体内研究間のギャップを説明 organoid プロトコルを利用できることと、早くをシミュレートする信頼性と安定したセル ベースのモデル システムを表すことをお勧め健康と人間の体内外の病気の人間の皮質発達。
Protocol
1. iPSC 集計の生成
- IPSC の植民地から単一セルの単一層文化の生成
- 基底膜抽出 (BME) コーティング 6 ウェル プレートを準備します。2-3 h の 4 ° C で氷の上の BME を解凍、冷たいダルベッコ変更イーグル培地 F12 で希釈 (DMEM F12; 1:50 希釈)、1 ml/BME 薄めたのもプレートをカバーし、4 ° C で一晩プレートを保管
- 培地を吸引し、植民地を 4 分間室温 (RT) の PBS で 0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の孵化前に二度リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 0.5 mM EDTA の 6 ウェル プレートの少なくとも 2 井戸のまま iPSC 植民地を洗ってください。EDTA 溶液を吸引し、F12 DMEM 培地 5 mL を皿の底を離れてそれらを洗浄することにより植民地を注意深く取り外します。15 mL チューブにそれらを収集し、遠心分離 (常温 1,200 x gで 4 分) によってそれらをペレットします。
注:市販繊維芽細胞から書き換え Ips が正常に使用される10をされています。 - 上清を吸引し、37 ° C で 6 分間細胞解離試薬の 500 μ L で iPSC コロニーを孵化させなさい
- 細胞懸濁液残りのセルのクラスターを単一のセルに分割する 1 mL ピペットで数回軽く上下をピペットで移しなさい。
- 細胞解離試薬を希釈する細胞懸濁液に DMEM f12 キーの 4 つの mL を追加します。
- 室温 4 分 1,200 x gで下セルをスピンします。
- 5 μ M と iPSC 培の 2 mL の細胞を再懸濁します Y-27632 と種子コーティング BME 6 ウェル プレートの 1 つのウェルに細胞します。
注:単一細胞単層 iPSC 培養のための材料表で指定された iPSC 媒体を使用します。 - 次の日、Y-27632 を欠けている新鮮な iPSC 媒体に媒体を置き換えます。この時点から、Ips が 100% 合流まで毎日変化して培地、細胞の培養を続けます。細胞株および開始の井戸の confluency、によって 2-4 日間かかります。
- 一度合流、通路、Ips。培地を吸引し、細胞の細胞解離試薬の 500 μ L を適用します。
- 37 ° C で 5 ~ 10 分の細胞をインキュベートします。セルをデタッチするプレートを優しく揺する。
- 井戸からセルを洗浄して DMEM f12 キーの 2 ml と 15 mL チューブでそれらを収集します。5 mL の容量の DMEM f12 キーを追加します。
- RT で 4 分間 1,200 x gで細胞を回転し、上清を吸引します。
- セルをシード iPSC 培 5 μ m で、BME で 1:4 の比率を 1:2 に Y-27632 コーティング 6 ウェル プレート (2 mL/媒体の井戸)。
- 引き続き 2-5 日間の培養し、毎日 Y-27632 を欠けている iPSC 媒体を変更します。一度合流、通路 Ips (手順 1.1.4-1.1.8)。
注:IPSC 集計の生成のための細胞は培養条件に適応するためにそれらを使用する前に材料のテーブルで指定された iPSC 媒体における単分子膜として少なくとも 2 通路の Ips の文化.
- 単層 iPSC 培養する際 iPSC の集計の生成、70-90% 合流。
注:単一細胞はストレスになりやすい、培養条件に適応した iPSC 解離および集計するときに細胞死に 。単層 iPSC 培養分化の証拠と典型的な多能性の形態を表示する必要があります。マイコ プラズマ汚染のため定期的に文化をテストします。マイコ プラズマ無料 iPSC 文化でのみ動作します。- 6 ウェル プレートの 1 つの井戸から培養液を吸引し、細胞の細胞解離試薬の 500 μ L を適用します。
- 37 ° C で 5 ~ 10 分の細胞をインキュベートします。セルをデタッチするプレートを優しく揺する。
- 井戸から細胞を洗う DMEM f12 キーの 2 ml と 15 mL チューブでそれらを収集します。10 mL の容量の DMEM f12 キーを追加します。
- 細胞数、細胞懸濁液から 25 μ L を取るし、トリパン ブルーに死んだ細胞の 25 μ L でそれをミックスします。カウントのチャンバーを用いた生細胞をカウントします。
- 15 mL チューブに細胞懸濁液から十分な細胞 (iPSC 集計あたり 4,500 細胞) を収集します。
- RT で 4 分間 1,200 x gで細胞を回転し、上清を吸引します。
- 50 μ m iPSC 培の適切なボリュームで細胞を再懸濁します Y-27632 150 μ L あたり 4,500 の生きているセルを取得します。
注:Y-27632 の高濃度を使用して (50 μ M) は、Ips の生存のために重要です。 - 各 150 μ L をプレート低添付ファイル 96 ウェルの U 下部のプレートし、37 ° C、5% CO2でインキュベーターで配置。
注:IPSC 集計を生成、するときは、少なくとも 6 organoids が 20 (セクション 5 を参照) の日に品質管理のため必要であることを検討してください。
2. 前方の次の誘導
- 4 X、10 X 力レンズを用いた培養顕微鏡下で毎日 iPSC 凝集体の形態変化を注意深く監視します。日 1、明確な国境を持つ細胞凝集塊を観察します。37 ° C、5% CO2でインキュベーターで培養 iPSC 集計続けます。
注:死んだ細胞/ウェル数は正常であり、organoid 世代は影響しません。 - IPSC 集計 2 日目から始まって、そして下部細胞凝集塊を妨げないで媒体の約 2/3 を軽く吸引して一日おきと続きをフィードします。Y-27632 を欠けている iPSC 媒体の追加の 100 μ L を追加します。
注:4-6 日以内、細胞凝集塊は直径 350 450 μ m をされ、滑らかなエッジを展示します。 - この段階でプール セルは N2 サプリメント (レバレッジ)、B27 サプリメント (1: 100)、グルコース (0.2 mg/mL)、繰返し DMEM f12 キーを含む皮質誘導培地でカット 100 μ L ピペット チップで低添付ファイル 6 cm 皿 (最大 20 集計/皿) に集約します。アデノシン一リン酸塩 (キャンプ; 0.15 μ G/ml)、0.5% 非必須アミノ酸 (NEAA) 1 %l-アラニル-L-グルタミン、ヘパリン (10 μ G/ml)、LDN 193189 化合物 (180 nM)、A83 01 (500 nM)、および wnt シグナル応答 1 (IWR-1) の阻害剤 (10 μ G/ml)。皮質誘導培地に 6 cm の皿にそれらを転送した後 3 日を変更することによって、細胞凝集塊をフィードします。
- 4 X 力レンズを用いた培養顕微鏡下皮質誘導中に形態学的変化を注意深く監視します。
注:皮質誘導培地で 4-5 日後細胞凝集塊の端は神経外胚葉性の分化を示す表面で明るくが開始されます。この段階では、偽重層上皮の放射状組織が現れます。BME マトリックスに細胞集塊を埋め込むにはセクション 3 に進んでください。
3. マトリックス足場で集計神経外胚葉性の埋め込み
- BME 2 3 十分な量で分注の原液 BME のための 4 ° C で氷の上を解凍します。
- 埋め込みのプロシージャのプラスチック パラフィン フィルム シートを準備します。4 cm × 4 cm 大で滅菌はさみを使用してプラスチック パラフィン フィルム、プラスチックの部分を入れ、部分 100 μ L のヒント、空 100 μ L チップ トレイ上フィルムをパラフィン、プラスチック パラフィン フィルム シートに小さなえくぼが (1 di が作成されるよう手袋をはめた指で押してカット例/セルの集計が必要)。70% エタノールでプラスチック パラフィン膜をきれいにし、紫外線照射 (電力: 15 ワット、波長: 435 nm) 30 分間閉じた無菌ベンチの下。
- 各セルの集計を 100 μ L カット 1.5-2 mm 径で開くプラスチック パラフィン フィルム シートの 1 つのディンプルに転送します。融合した場合は、2 つの集計セル、区切っていないが、1 つのディンプルに一緒に転送します。
- 優しくノーカット 100 μ L のピペット チップを使用して細胞凝集塊を囲む媒体を吸い出しなさい。
注:これは凝集体を損傷するため、先端に細胞集塊を吸うこと注意ください。 - 原液の BME の 40 μ L を各セルの集計に追加します。
- 各セルの集計、BME の真ん中には、ノーカットの 100 μ L ピペット チップを使用してドロップ位置。
注:ピペット チップの開発神経を害することのない非常に注意します。 - 慎重に 10 cm シャーレに滅菌鉗子 (または別の十分な細胞培養ディッシュ) プラスチック パラフィン フィルム シートを転送し、固める BME を許可するように 15 〜 20 分のためのインキュベーターに皿を置きます。
- 一方、皮質誘導培地 5 mL を含む低添付ファイル 6 センチメートルの皿を準備します。
- BME の重合後プラスチック パラフィン フィルム シートからセルの集計を含む液滴を削除します。滅菌鉗子を使用してプラスチック パラフィン フィルムを裏返して、穏やかにわずかに傾いた細胞凝集塊を絞る (約 30 °) 低添付ファイル 6 cm 皿プラスチック パラフィン フィルム シートから水滴が落ちるまで。1 つの 6 cm 皿に最大 16 細胞凝集塊を転送します。
- 37 ° C で細胞凝集塊をインキュベートし続ける
4. 神経外胚葉性から前脳型オルガノイドの生成の集約します。
- BME マトリックスへの埋め込み後の 1 日は、傾斜角 5 ° ・ 14 rpm、携帯文化のインキュベーターでインストールとロッキング細胞文化シェーカーに organoid 培養皿を置きます。
- 毎日オルガノイドを監視します。均質な上皮細胞内ループのような構造は、BME マトリックスへの埋め込み後徐々 に開発します。
- 上皮細胞内ループ構造が表示されているときは、媒体を organoid 分化培 DMEM-F12 N2 サプリメント (レバレッジ)、B27 サプリメント (1: 100)、グルコース (0.2 mg/mL)、キャンプ (0.15 μ g/mL)、0.5% に変更 NEAA、1 %l-アラニル L グルタミンインスリン (2.5 μ g/mL)
- 差別化目的の時点に到達するまで 3-4 日おき organoid 分化培地を交換します。その後、修正 organoids (セクション 5 を参照)。
注:時折、組織はループ構造を持たない光半透明組織の芽を示すことがあります。これは理想的ではありませんがこれは皮質構造の開発を影響されていません。オルガノイドは、40 日間 organoid 分化培地で培養することができます。拡張された文化期間 (40-100 日) organoid 分化培地が 1:50 で補完することができます組織の複雑さを増加する BME と BDNF と GDNF が神経細胞の生存と成熟14,15を許可します。
5. 固定と前脳型オルガノイドの検証
- 検証、20 日目で 6 オルガノイドを収集します。MRNA の分離および PCR 解析 3 オルガノイドを使用します。3-3.5 mm の開口部をもつ固定とシーケンシャルの免疫細胞化学的解析のカット 1 mL ピペット チップを使用して PBS を含む 24 ウェル プレートに追加 3 オルガノイドを転送します。
- 慎重に PBS を吸引し、5 mL のピペットを使用して新鮮な PBS に置き換えることによって 2 回、オルガノイドを洗います。冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) (pH 7.4) で 15 分間オルガノイドを修正します。
注意:PFA は知られている人間の発癌物質であることに注意してください。ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで、すべての作業を行う必要があります。安全眼鏡を着用することをお勧めします。ホルムアルデヒドは角膜に不可逆的な損傷を引き起こすことができます。 - PFA を慎重に吸引し、洗浄 3 回 10 分間室温 PBS を使用します。
- PBS を 30% ショ糖液に置き換える (wt/巻、PBS ベース) 退避オルガノイドを許可する 4 ° C で試料を保存と。さらに処理まで最大 7 日間オルガノイドを格納できます。
- 1 日固定後は、前約 1:50 セクショニング手順中、オルガノイドの可視化を許可するように 10 分でトリパン ブルー色素を追加することによって脱水オルガノイドを染色します。
- 7.5% ゼラチン wt/巻、PBS で 10% ショ糖を含む埋め込みメディアの準備、それが液体になるまでそれを 75 ° C に暖かい。
- 埋め込みメディアを 30% ショ糖液を交換し、オルガノイドを平衡に 15 分間加熱プレート (60 ° C) 24 ウェル プレートを転送します。
- 埋め込みメディアの層で埋め込み型の底をカバーし、重合を氷の上に置きます。
- 埋め込みに 24 ウェル プレートから organoids 金型重合埋め込みメディアを含む転送を追加追加埋め込み媒体上、オルガノイド覆われている 100% エタノール/ドライアイス風呂 (凍結にすぐに型を置く温度は、-30 ~-50 ° C の間でなければなりません) ショック凍結する少なくとも 1 分。
- ドライアイスを一時的に鉗子とそれら-80 ° c または直接続行セクショニングどちらのストアを持つ金型を配置します。
- 20 μ m の厚みで収集 Cryosection オルガノイドのセクションの順序スライド (シーケンシャル取り込み) 追跡を維持、顕微鏡スライドのセクション。-80 ° C で保存または直接免疫組織化学的染色を行う前にいくつかの時間、スライド上で乾燥するセクションを許可します。
Representative Results
通常ここに記述されている標準化された前脳型 organoid プロトコル栽培 (プロトコルの概要を図 1の 20 日以内人間 Ips からほとんど専ら背側皮質のアイデンティティの非常に均質な organoid 文化を生成します。A). 定義されているプロトコルの時間中にいくつかの品質管理手順を実行するは、勧めとしてここで: '行く' (分化プロセスを続行) と 'ノー' (準文化お勧めバッチを終了させる) (図 1).また、画像やメモを取ってしても各品質管理手順を文書化することをお勧めします。
前脳型オルガノイドを生成する最初の重要なステップは、高品質の iPSC 文化を開始します。Ips には、分化した細胞のより大きい分数が含まれていないことが重要です。のみ (1 b、C の数字の) 開始人口の未分化細胞の均一膜として提示 iPSC 文化を使用します。また、iPSC 集計のため特定のセル番号を開始することが重要です。2 日目の iPSC 集計の最初の詳細な検査を行わなければなりません。この段階で集計する必要がありますと形成しているコンパクトなセルサイト芽滑らかなエッジ ('go') 不規則な出現の集計または空洞を破棄 ('行く') (数字 1 E) をする必要があります一方。プロトコルの 10 日目で次の品質管理手順を実行します。この時点で細胞凝集塊を見せろ円滑かつ光学的透明組織このような組織の不在を示す次善の神経誘導に対し次 ('go') の誘導を表す外側の表面に ('ノー') (図 1 f、G).半透明の表面 (図 1F) を示す集計だけは、BME の行列に埋め込む必要があります。埋め込まれると、皮質オルガノイドは迅速に拡大する連続的な上皮細胞内ループのような構造を開発します。図 1H, J ('go') で示すよう、オルガノイドが開発した偏光神経外胚葉をあるかどうかを調べることで 15 日目と 20 日目で皮質誘導の効率を分析します。Organoids として ('ノー'K は図 1に示すように) そのような上皮細胞内芽を批判的に開発していないというケースでトラブルシューティングの実行の品質管理手順を修正します。(図 2 a, B)、生成したときしっかりと次のプロトコル、高度に標準化 organoid バッチになります神経外胚葉形成内のバッチ (図 2C) を偏光の ≥ 90% の均一性が表示されます。可変性偏光神経外胚葉の形成につながる一般的な間違い iPSC 集計の開始セル数を増やす、マイコ プラズマなどで開始する低品質の iPSC 文化汚染の文化や文化を含む分化した細胞。
20 日目で生成されたオルガノイドの背胎生 id の詳細な検証を行わなければなりません。そのために、3 organoids 固定、蛍光分析に使用します。重層上皮細胞内ループ (図 3A) 神経幹細胞マーカー Sox2 を表現 (図 3B, D)、Pax6 と Otx2 前脳マーカー (図 3、E)、および Emx1 背側皮質マーカー (図 3F). これらの皮質ループはさらに N 型カドヘリンおよび ZO-1 (図 3、H)、心室ゾーン放射状グリア細胞 (vRGC) の頂ローカリゼーションによって特徴付けられる-微小管は、頂端から構造 (の基底側にまたがる派生図 3私、頂に位置するリン酸化ビメンチン陽性染色細胞分裂と (p-ビメンチン,図 3J)。細胞死における構造物内部に存在かもしれない。アポトーシスは正常であり、大脳皮質組織の開発には影響しません。さらに、遺伝子発現解析により、プロトコルの均一性を評価する 3 オルガノイドを使用ください。中脳 (FoxA2、Pax5) の式中に前脳型オルガノイド表示 (FoxG1、Otx2、Emx1)、前脳の背側のマーカーの発現と脳 (HoxB2、HoxA4、HoxB4、HoxB6) マーカーではない検出 (図 3K)。
品質制御オルガノイドのバッチは、頂放射状グリア細胞の分裂面の分析のような様々 な用途に使用できます。そのために、提案する p ビメンチンと Tpx2 抗体による二重染色を行う (図 3J)。P ビメンチンが有糸分裂の CDK1 によるリン酸化し、核にある、従ってすべての原子核分裂期16をマーキングします。Tpx2 胎生17,18の間に紡錘および根尖部のプロセスを視覚化することができます関連付けられている微小管蛋白質であります。これらのマーカーを使用して、vRGC 部門の 3 つの側面原則的に分析できる: (I) かどうかセル部門起こる根尖側 (II) の平面の分割が一直線に並べられた縦 (ことを示す対称細胞分裂)、水平、または斜めの (かどうか非対称的な細胞分裂を示す) 頂端表面、および (III) ために通常形成がセンター微小管を整理するかどうか。
Organoids より複雑な整理および層状皮質組織構造にもさらに区別できます。日 35 ± 2 organoids 内の皮質構造で構成されます (VZ) 心室ゾーン-、内縁と外縁下帯 (SVZ) と同様、皮質板 (CP) - エリアのような。VZ と内縁と外縁下帯、vRGCs、中間前駆細胞 (IPs) と oRGCs を連想させる細胞を識別できます。内 Ctip2 Tbr1 と Satb2、上部皮質ニューロン皮質深部ニューロンで CP に似た領域に層状皮質の初期形成を観察できるさらに、外側の領域の10のリーリン発現細胞だけでなく。
図 1: Organoid プロトコルおよび '行く' と 'ノー' 基準の図の図式的な概観します。(A) プロトコルの図式的な概観。CI 媒体: 皮質誘導培地;CD: 皮質分化培地。(B-C)最適な 90% コンフルエント iPSC 単層培養 (B) と (C) の分化を示す非適切な iPSC 文化のイメージ。(D-E)IPSC 集計最適サイズ、細胞密度、表面外観 (D) で、いずれかのセルを示す 2 つの 'ノー' 細胞凝集塊スペア空洞 (E、上部の集計) または不規則なエッジ (E、低い骨材) 2 日間次のセルの集計。(F-G)半透明で滑らかなエッジ (F) と光に欠けている細胞凝集塊を示す細胞凝集塊 (G) をクリアします。関心のある領域、黄色の線を可視化します。(H-K)連続的な上皮細胞内ループ (H, J) で最適な器官毛細と放射状の開発に失敗した organoid 15 日と 20 日にそれぞれイメージ (私、 K) 次を開催しました。尺度バー、B C 500 μ m;D K 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 均一性と再現性脳型におけるプロトコルの。(A-B)日 15 (A) と (B) 26 日に 1 つのバッチからオルガノイドの代表的な明るいフィールド画像。20 日目でオルガノイドの定量分析: (C)。Organoids 神経上皮、明るいフィールドに明確なボーダーと放射状の細胞構造の証拠明確な光学的表面的な組織としての認識が外表面に表示された定量化 (n = あたり少なくとも 16 オルガノイドの iPSC 1行 3実験)。スケール バー、AB 500 μ m. エラー バー ± SD.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 20 日目に脳型オルガノイドの検証します。(A-J)オルガノイドの免疫細胞化学的特性。複数の上皮細胞内ループ (ADAPI で counterstained) でオルガノイドを整理します。組織内の細胞上皮細胞内ループ エクスプレス神経幹細胞マーカー Sox2 (B D) 前脳マーカー Pax6 を成層 (C, D) と Otx2 (E) 背脳マーカー Emx1、(F)。皮質ループ構造展示罰金付着接合ベルト N-カドヘリン (G) とソナ毛細血管蛋白質 1 (ZO-1; の蓄積でせいぜい尖H). 心室 Rgc 微小管ネットワーク (アセチル化された α-チューブリン、Ac 浴槽染色) を (私) ループ構造の基底側に頂端から拡張します。P ビメンチン (p-Vim) を発現する増殖細胞は頂端表面に配置されます。Tpx2。 代表的な高い倍率の画像を用いた垂直分裂、染色、右側 (J) 平面を水平分割が表示されます。(K) オルガノイドの 2 つの独立したセットの 20 日目で領域特異的転写因子の RT-PCR 解析異なる iPSC の 2 行から派生します。FB: 胎児の脳コントロール;AB: 大人の脳コントロール。尺度バー、A ~ D 200 μ m;E-10 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| エピトープ | 希釈 |
| Sox2 | 1-300 |
| Pax6 | 1-500 |
| Otx2 | 1-500 |
| Emx1 | 1-50 |
| N-カドヘリン | 1-500 |
| ZO-1 | 1-100 |
| P ビメンチン | 1-1000 |
| Tpx2 | 1-500 |
| アセチル化された α-チューブリン | 1-500 |
| Alexa488 ms アンチ | 1-1000 |
| Alexa488 rb アンチ | 1-1000 |
| Alexa555 ms アンチ | 1-1000 |
| Alexa555 rb アンチ | 1-1000 |
20 日オルガノイドの品質制御のためのテーブル 1: 抗体。
| プライマー | シーケンス |
| Otx2 前方 | tgcaggggttcttctgtgat |
| Otx2 リバース | agggtcagagcaattgacca |
| FoxG1 前方 | ccctcccatttctgtacgttt |
| FoxG1 リバース | ctggcggctcttagagat |
| Emx1 前方 | agacgcaggtgaaggtgtgg |
| Emx1 リバース | caggcaggcaggctctcc |
| FoxA2 前方 | ccaccaccaaccccacaaaatg |
| FoxA2 リバース | tgcaacaccgtctccccaaagt |
| Pax5 前方 | aggatgccgctgatggagtac |
| Pax5 リバース | tggaggagtgaatcagcttgg |
| HoxB2 楽しみ | tttagccgttcgcttagagg |
| HoxB2 リバース | cggatagctggagacaggag |
| HoxA4 楽しみ | ttcagcaaaatgccctctct |
| HoxA4 リバース | taggccagctccacagttct |
| HoxB4 前方 | acacccgctaacaaatgagg |
| HoxB4 リバース | gcacgaaagatgagggagag |
| HoxB6 楽しみ | gaactgaggagcggactcac |
| HoxB6 リバース | ctgggatcagggagtcttca |
| 18 秒前方 | ttccttggaccggcgcaag |
| 18 歳の逆 | gccgcatcgccggtcgg |
表 2: プライマーと遺伝子発現プロファイルのためのプライマー シーケンス。
Discussion
脳オルガノイドの勉強脳開発体外彼らは関連する種の背景と組織コンテキスト内のセルの複雑な三次元整理を提供するための強力なツールを表します。それで、彼らはヒト以外の動物モデルと還元主義的人間二次元単層細胞培養技術のギャップを埋めます。応用は、ただし、9再現性の欠如によって妨げられています。パターン化する要因に、こうしてと iPSC の自己組織化能力を組み合わせることで大型のサンプル-サンプルのばらつきを克服する脳型 organoid プロトコルを開発しました。具体的には、Ips は、自己組織化を促進し、その後 TGF-β/SMAD BMP (LDN-193189) に培養をさらすことによって背側皮質の分化を促進するシグナル伝達を阻害するのに集約され、TGF-β 受容体阻害剤 (A83-01) 型します。さらに、Wnt 経路 posteriorization を防ぐために (IWR) を阻害する化合物が適用されました。'組み込み' 脳におけるプロトコル19とは対照的に基づいている自己組織外部制御ではなく異種脳オルガノイドを生じ、大規模なバッチのバリエーションを展示なし (の効率を用いて偏波神経外胚葉形成15)、再現性をもってここに記載されているプロトコル人間 Ips から同種の前脳特異オルガノイドを生成します。
これら脳型オルガノイド神経発達学, 遺伝子機能の研究を含む進化の研究など幅広く使える疾患モデリングと、潜在的に、薬物検査と治療を目的。プロトコルは、しかし、皮質発達初期の側面を検討に最適です。たとえば vRGC 行動の人間固有の側面を調べる脳型オルガノイドを使いました。具体的には、滑脳症皮質折り畳みの近くの不在によって特徴付けられる人間の脳奇形の深刻なフォームに関連付けられている病態が修正されました。マウスの脳は自然に lissencephalic として、この病気の特定の側面のみをマウスのモデリングできます。滑脳症患者由来 Ips organoid システムに適用し, 病気の人間固有の側面を要約するだろう確実にし根本的なメカニズムを特定できました。具体的には、我々 は患者由来 organoids 対称からスイッチによる vRGCs の非対称細胞分裂サイズの大幅な削減を示すを示すことができます。このスイッチは vRGCs の微小管ネットワーク、VZ ニッチのアーキテクチャの混乱の組織の変化に関連付けられていた、N カドヘリン/β-カテニンの障害活性化につながる、細胞接着分子の発現変化シグナル伝達軸10。ノートの: ヒト特有の過剰発現マウスにおける β-カテニンの接線方向の皮質拡大につながると、その後皮質折り畳み20vRGC 分割モードの β-カテニン依存規制が示唆されました。したがって、我々 のデータは、前脳型 organoid システムが定量化できる方法で体外早期皮質発達の人間固有の側面を勉強する有望なツールを表すことを強調表示します。
今後の主な課題より成熟した神経細胞を達成するために、長時間にわたって、オルガノイドの均一性を維持するためにです。これは、次の 1 つ以上によって実現可能性があります: バイオリアクター システム14オルガノイド培養、フローティングを適用する骨格の15、脳の発達や神経細胞生存要因と分化培地を補完します。最後に、脳の複雑さの制御の増加は、異なる地域のアイデンティティ21,22の脳オルガノイドの前脳型オルガノイドを融合させることで達成可能性があります。
一緒に取られて、紹介前脳型 organoid プロトコルは、初期皮質構造体外の世代のため簡単に適用可能な信頼性の高いツールを提供しています。プロトコル与える複数の iPSC 行高均一初期皮質組織に上昇個人特有の大脳皮質組織を確実に生成することが出来、.したがって、システムは高度な均一性と再現性疾患モデリングなどを必要とするアプリケーションに特に適して。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
仕事は、科学技術革新省と研究のノルトライン = ヴェストファーレン州 (短期研究グループ) と時代ネット ニューロン、JTC 2015 神経発達障害、幹 MCD にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
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