Zerebrale Organellen repräsentieren eine neue Modellsystem, frühe menschliche Gehirn Entwicklung in Vitrozu untersuchen. Dieser Artikel enthält die detaillierte Methodik um homogene dorsalen Vorderhirn-Typ Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen einschließlich kritische Charakterisierung und Validierung Schritte effizient zu generieren.
Der menschlichen Hirnrinde ist stark erweitert und weist eine komplexe Struktur mit bestimmten Funktionsbereichen, Bereitstellung von höheren Gehirnfunktion, wie Kognition. Anstrengungen zur Entwicklung der menschlichen Hirnrinde studieren haben durch die Verfügbarkeit von Modellsystemen begrenzt. Ergebnisse von Nagetier Studien der menschlichen System zu übersetzen durch Artenunterschiede eingeschränkt ist und Studien über menschliche primäre Gewebe werden durch einen Mangel an Gewebe Verfügbarkeit sowie ethische Bedenken behindert. Aktuelle Entwicklung im menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSC) Technologie beinhalten die Generation der dreidimensionalen (3D) selbstorganisierende organotypischen Kultur Systeme, die zu einem bestimmten Ausmaß Mensch-spezifische Gehirn Entwicklung in Vitrozu imitieren. Derzeit stehen verschiedene Protokolle für die Erzeugung von entweder ganze Gehirn oder Gehirn-Region spezifische Organellen. Die Methode für die Generierung von homogenen und reproduzierbare Vorderhirn-Typ Organellen von induzierten PSC (iPSC), die wir bisher geschaffen und hier beschreiben, verbindet die intrinsische Fähigkeit des PSC, mit geführten Differenzierung gegenüber selbst zu organisieren, die vorderen Neuroectodermal Abstammung und Matrix einbetten, um die Bildung eines kontinuierlichen Neuroepithelium zu unterstützen. Genauer gesagt, dieses Protokoll umfasst: (1) die Generation der iPSC-Aggregate, einschließlich der Umstellung der iPSC Kolonien zu einer konfluierende Monolayer Kultur; (2) die Induktion der vorderen Neuroectoderm; (3) die Einbettung von Neuroectodermal Aggregate in einem Matrix-Gerüst; (4) die Generation des Vorderhirns-Typ Organellen von Neuroectodermal Aggregaten; und (5) die Fixierung und Validierung des Vorderhirns-Typ Organellen. Dieses Protokoll bietet ein leicht einsetzbares System zur Erzeugung von standardisierten und reproduzierbaren iPSC-abgeleitete kortikalen Gewebe Strukturen in Vitro.
Das menschliche Gehirn ist eindeutig eines der komplexesten Organe und ist verantwortlich für alle menschlichen intellektuellen Fähigkeiten. Somit ist ein tieferes Verständnis der Mensch-spezifische Gehirnentwicklung eine entscheidende Voraussetzung für das Verständnis der menschlichen kognitiven Fähigkeiten. Traditionell serviert transgene Tiere als Modellorganismen, die Entwicklung des Gehirns zu studieren. Diese Modelle zur Verfügung gestellt grundlegenden Einblick in die Prinzipien der Entwicklung des Gehirns. Wir wissen jetzt, dass ein gemeinsames Merkmal der Entwicklung des Gehirns bei allen Säugetieren eine präzise Choreografie der Stammvater Proliferation, Neurogenese und neuronalen Migration. Allerdings gibt es erhebliche strukturelle Unterschiede zwischen den Gehirnen von Modellorganismen wie Nagern und Menschen, vor allem in der Großhirnrinde. Die wichtigsten Mechanismen, die vorgeschlagen wurden, zu Primaten kortikalen Entwicklung beitragen sind eine erhöhte Proliferation von Stamm-und Vorläuferzellen sowie die Erzeugung von äußeren radialen Glia-Zellen (oRGCs), die nur sehr selten bei Nagetieren1 gefunden ,2,3.
Methoden der menschlichen Hirnrinde Modellentwicklung zählen die Generation der PSC abgeleitet Teleenzephalischer Vorläuferzellen und Großhirnrinde Projektion Neuronen als Monolayer-Kulturen. Diese Differenzierung standardisierte Protokolle Abspielen bestimmter Aspekte der menschlichen kortikalen Entwicklung wie die stereotype zeitliche Reihenfolge der kortikalen Neurogenese4. Sie fallen jedoch kurz, wenn es darum geht, die Reprise von Entwicklungsprozessen der Organogenese wie räumliche Musterbildung und Morphogenese. Neuere Entwicklungen in der Stammzellbiologie führte zur Gründung von 3D organoide Kulturen von EAP, die die Erforschung von in-Vitro menschliche Organogenese revolutioniert werden. Mit Hilfe der Handlungsfähigkeit der einheitlichen Ansprechpartner in organotypischen Strukturen selbst zu organisieren, wurden verschiedene Organellen, die wichtige strukturelle und funktionelle Eigenschaften der Organe einschließlich der Nieren, Darm, das Auge und Gehirn reflektieren etablierte5. Solche Organellen enthalten mehrere Organ-spezifische zelluläre Untertypen, die Gruppe zusammen und organisieren räumlich sehr ähnlich wie die entwickelnden Organe in Vivo5,6. Darüber hinaus ergab Zelle Komposition, Linie Beziehung und gen Netzstudien mit einzelligen RNA Sequenzierung, dass menschliche zerebrale Organellen treu wesentliche Aspekte der Entwicklung der menschlichen fetalen Neokortex wie Ausdruck Genprogramme rekapitulieren 7 , 8. einen großer Nachteil, die ihre breite Anwendung bisher verhindert, war jedoch der große Variationen von Charge zu Charge und organoide-organoide Heterogenität9.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine einfache und standardisierte Vorderhirn-Typ organoide Kultursystem. Das zentrale Merkmal dieses Systems ist, dass es effizient und reproduzierbar PSC-abgeleitete Organellen der nahezu ausschließlichen dorsalen Teleenzephalischer Identität erzeugt. Das Protokoll basiert auf den Methoden unserer jüngsten Cell Reports Papier10. Es verbindet die Selbstorganisation Kapazität des iPSCs mit selektiven Induktion der kortikalen Neuroepithelium und erzeugen robust homogenere Kulturen der frühen dorsalen Teleenzephalischer Gewebe innerhalb von 3 Wochen. Das Protokoll baut auf den bereits gemeldeten SMAD Signalisierung und Wnt-Hemmung-Strategie, die die Differenzierung des PSC in Richtung der vorderen Neuroectodermal Linie11,12 in Kombination mit einbetten, die Matrix führt fördert die Bildung von großen und kontinuierliche neuroepithelialer Strukturen13. Wir haben erfolgreich das beschriebene Verfahren auf verschiedenen iPSC-Linien, mit mehreren Klonen pro Person verwendet. Wir haben gezeigt, dass dieses System in der Reproduzierbarkeit und Homogenität von großer Bedeutung wie Krankheit Modellierung sind für downstream-Anwendungen geeignet ist. Bei der Umsetzung des Protokolls zu iPSCs von Patienten mit einer schweren kortikalen Fehlbildung abgeleitet, konnten wir um pathologische Kennzeichen der Krankheit in Vitro zu rekapitulieren und neue molekulare Mechanismen, die die phänotypische identifizieren 10ändert. Wir empfehlen, dass die beschriebenen organoide Protokoll genutzt werden kann, dass die Lücke zwischen reduktionistischen PSC abgeleitet kortikalen Monolayer-Kulturen und in Vivo Studien und es steht für eine zuverlässige und stabile zellbasierte Modellsystem, früh zu simulieren kortikale Bildungsforschung in Gesundheit und Krankheit außerhalb des menschlichen Körpers.
Gehirn Organellen sind ein mächtiges Werkzeug für menschliche Gehirn Entwicklung in Vitro zu studieren, da sie die relevanten Arten Hintergrund und die komplexen 3D Anordnung der Zellen in einem Gewebe-Kontext liefern. Damit Lücke sie die zwischen nichtmenschlichen Tiermodelle und reduktionistischen menschlichen zweidimensionale Monolage Zelle Kulturtechniken. Ihre Anwendungen sind, jedoch durch mangelnde Reproduzierbarkeit9behindert. Wir haben ein Vorderhirn-Typ organoide Protokoll entwickelt, die große Variabilität von Probe zu Probe überwindet durch die Kombination der selbstorganisierenden Kapazität des iPSC mit ihrer Bereitschaft zur Musterung Faktoren. Insbesondere iPSCs wurden zur Förderung der Selbstorganisation und anschließend hemmen TGF-ß/SMAD-Signalisierung, dorsalen Cortex Differenzierung zu fördern, indem man die Kulturen auf einem BMP (LDN-193189) zusammengefasst und TGF-β Typ I Rezeptor Hemmer (A83-01). Darüber hinaus wurde eine Hemmung des Wnt-Signalweg (IWR) um Posteriorization zu verhindern Verbindung angewendet. Im Gegensatz zu “intrinsische” zerebrale organoide Protokolle19, die auf basieren Selbstmontage ohne externe Steuerung zu recht heterogene Gehirn Organellen und ausstellenden Großserien-Variationen (gemessen an der Effizienz der polarisiert neuronale Ektoderm Bildung15), das Protokoll beschriebenen reproduzierbar erzeugt homogene Vorderhirn-spezifische Organellen von menschlichen iPSCs.
Diese Organellen Vorderhirn-Typ eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen wie Entwicklungsstörungen Studien, evolutionäre gen Funktionsstudien, einschließlich Krankheit Modellierung und potenziell, Drogen Tests und therapeutischen Zwecken. Das Protokoll ist jedoch am besten geeigneten frühe Aspekte der menschlichen kortikalen Entwicklung untersuchen. Wir haben zum Beispiel die Vorderhirn-Typ Organellen verwendet, um Mensch-spezifische Aspekte von vRGC Verhalten zu untersuchen. Genauer gesagt, pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit einer schweren Form der Lissenzephalie, eine menschliche kortikalen Fehlbildung zeichnet sich durch eine in der Nähe von Abwesenheit von kortikalen Falten, wurde behoben. Nur bestimmte Aspekte dieser Krankheit können bei Mäusen modelliert werden, wie das Gehirn der Maus natürlich Lissencephalic ist. Wenn die organoide System auf Lissenzephalie Patienten abgeleitet iPSCs anwenden, könnten wir zuverlässig rekapitulieren Mensch-spezifische Aspekte der Erkrankung und zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren. Genauer gesagt, konnten wir zeigen, dass Patienten-abgeleitete Organellen eine signifikante Reduktion in der Größe durch einen Schalter von symmetrischen auf asymmetrischen Zellteilung der vRGCs verursacht zeigen. Dieser Schalter wurde im Zusammenhang mit Veränderungen in der Organisation des vRGCs Mikrotubuli-Netzwerk, eine Störung der Architektur des VZ-Nische und Ausdruck der Zelle Adhäsionsmoleküle, was zu einer Beeinträchtigung Aktivierung des N-Cadherin/β-Catenin verändert Signalisierung Achse10. Note: β-Catenin-abhängige Regelung der vRGC Abteilung Modi wurde Mensch-spezifische Überexpression von β-Catenin bei Mäusen tangential Kortex Expansion führt und anschließend kortikalen Falten20vorgeschlagen. So zeigen unsere Daten, dass organoide Vorderhirn-Typsystem ein viel versprechendes Instrument stellt, in gewissem Sinne quantifizierbare Mensch-spezifische Aspekte des frühen kortikalen Entwicklung in-vitro-Studie.
Eine große Herausforderung für die Zukunft ist die Homogenität der Organellen über längere Zeiträume beibehalten, um reifer neuronalen Phänotypen zu erreichen. Dies könnte durch eine oder mehrere der folgenden Schritte realisiert werden: Kultivierung der Organellen in einem Bioreaktor System14,15, zur Ergänzung der Differenzierung Medium mit Nervenwachstum oder neuronale überleben Faktoren Gerüste Anwendung schweben. Schließlich kann eine kontrollierte Steigerung im Gehirn Komplexität erreicht werden, durch die Verschmelzung der Vorderhirn-Typ Organellen mit zerebralen Organellen von verschiedenen regionalen Identität21,22.
Zusammengenommen bietet das Vorderhirn-Typ organoide Protokoll hier vorgestellten eine leicht anwendbare und zuverlässiges Werkzeug für die Generation der frühen kortikalen Strukturen in Vitro. Das Protokoll zu sehr homogenen frühen kortikalen Gewebe auf mehrere iPSC-Zeilen und kann genutzt werden, um zuverlässig individuelle kundenspezifische kortikalen Gewebe erzeugen. Somit ist das System besonders geeignet für Anwendungen, die ein hohes Maß an Homogenität und Reproduzierbarkeit wie Krankheit Modellierung erfordern.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit wurde durch das Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung von Nordrhein-Westfalen (Junior Research Group) und der ERA-NET NEURON, JTC 2015 Neuroentwicklungsstörungen, Stamm-MCD unterstützt.
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |