Cerebral organoids representerar nya modellsystem att undersöka tidiga mänskliga hjärnans utveckling i vitro. Denna artikel tillhandahåller detaljerade metoden för att effektivt generera homogen dorsala framhjärnan-typ organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller inklusive kritiska karakterisering och validering steg.
Mänskliga hjärnbarken är starkt expanderad och uppvisar en komplex struktur med specifika funktionsområden, som ger högre hjärnfunktion, såsom kognition. Ansträngningar att studera mänskliga hjärnbarken utveckling har varit begränsad av tillgången på modellsystem. Att översätta resultaten från gnagare till det mänskliga systemet begränsas av arter skillnader och studier på mänskliga primära vävnader hämmas av en brist på vävnad tillgänglighet samt etiska frågor. Senaste utvecklingen i mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) teknik inkluderar generationen av tredimensionella (3D) självorganiserande organotypic kultur system som efterliknar till en viss utsträckning mänskliga-specifika hjärna utveckling i vitro. För närvarande, det finns olika protokoll för generering av antingen hela hjärnan eller hjärnregionen specifika organoids. Metoden för generering av homogena och reproducerbara framhjärnan-typ organoids från inducerad PSC (iPSC), som vi tidigare har fastställts och beskriver här, kombinerar PSC inneboende förmåga att själv ordna med guidade differentiering mot den främre neuroektodermala härstamning och matrix inbäddning för att stödja bildandet av en kontinuerlig neuroepithelium. Mer specifikt innebär detta protokoll: (1) generering av iPSC aggregat, inklusive konvertering av iPSC kolonier till en konfluenta enskiktslager kultur; (2) induktion av främre neuroectoderm; (3) för inbäddning av neuroektodermala aggregat i en matris byggnadsställning; (4) generation av framhjärnan-typ organoids från neuroektodermala aggregat; och (5) för fixering och validering av framhjärnan-typ organoids. Som sådan, ger det här protokollet en lätt tillämpliga systemet för generering av standardiserade och reproducerbara iPSC-derived kortikal vävnad strukturer i vitro.
Den mänskliga hjärnan är helt klart en av de mest komplexa organ och ansvarar för alla människors intellektuella förmågor. Således, en djupare förståelse av mänskliga-specifika hjärnans utveckling är en avgörande förutsättning för att förstå människans kognitiva förmågor. Traditionellt, transgena djur serveras som modellorganismer att studera hjärnans utveckling. Dessa modeller föreskrivs grundläggande insikt i principerna för hjärnans utveckling. Vi vet nu att gemensamt för hjärnans utveckling hos alla däggdjur är en exakt koreografi av stamceller spridning, neurogenes och neuronala migration. Det finns, dock betydande strukturella skillnader mellan hjärnor modellorganismer, såsom gnagare och människor, särskilt i hjärnbarken. De primära mekanismer som har föreslagits bidra till primater kortikala evolution är en ökad spridning av stamceller och stamceller celler samt generering av yttre radiella gliaceller (oRGCs), som mycket sällan återfinns i gnagare1 ,2,3.
Metoder att mänskliga hjärnbarken modellutveckling inkluderar generationen av PSC-derived telencephalic stamceller och hjärnbarken projektion nervceller som enskiktslager kulturer. Dessa standardiserade differentiering protokoll repris vissa aspekter av mänskliga kortikala utveckling såsom den stereotypa temporal beställer av kortikala neurogenes4. De, faller dock kort när det kommer till sammanfattningen av utvecklingsprocesser för organogenes såsom rumsliga mönster och morfogenes. Senaste utvecklingen i stamcellsbiologi ledde till etableringen av 3D organoid kulturer från PSC, som revolutionerar forskningen av in vitro- mänskliga organogenes. Utnyttja de gemensamma kontaktpunkterna förmåga att själv ordna i organotypic strukturer, har olika organoids, som avspeglar viktiga strukturella och funktionella egenskaper hos organ inklusive njurar, tarm, ögat och hjärnan varit etablerade5. Sådant organoids innehåller flera organ-specifika cellulära subtyper, som gruppera och rumsligt organisera mycket liknar utveckla organ i vivo5,6. Dessutom avslöjade cell sammansättning, härstamning relation och gen nätverk studier med encelliga RNA-sekvensering att mänskliga cerebral organoids troget recapitulate viktiga aspekter av mänskliga foster neocortex utveckling såsom gen uttryck program 7 , 8. en stor nackdel, som hindrade deras breda program hittills, var dock de stora sats till sats variationer och organoid-till-organoid heterogenitet9.
Här, ger vi ett detaljerat protokoll för en enkel och standardiserad framhjärnan-typ organoid kultur system. Det viktigaste inslaget i detta system är att det effektivt och reproducibly genererar PSC-derived organoids nästan exklusivt dorsala telencephalic identitet. Protokollet är baserat på de metoder som används i vår senaste Cell Reports papper10. Det kombinerar iPSCs självorganisering kapacitet med selektiv induktion av kortikal neuroepithelium och robust kan generera homogen kulturer tidig dorsala telencephalic vävnad inom 3 veckor. Protokollet bygger på tidigare rapporterade SMAD signalering och Wnt hämning strategi som vägleder differentiering av PSC mot den främre neuroektodermala härstamning11,12 i kombination med matrix inbäddning, som främjar bildandet av stora och kontinuerlig neuroepithelial strukturer13. Vi har framgångsrikt använt den beskrivna metoden på olika iPSC linjer, med flera kloner per individ. Vi visade att detta system är lämpligt för nedströms tillämpningar där reproducerbarhet och homogenitet är av större betydelse såsom sjukdom modellering. När tillämpa protokollet till iPSCs härrör från patienter som lider av en svår kortikala missbildning, kunde vi att recapitulate patologiska kännetecken för sjukdomen i in vitro- och identifiera nya molekylära mekanismer som leder till den fenotypiska ändrar10. Vi föreslår att protokollet beskrivs organoid kan utnyttjas för att överbrygga klyftan mellan reduktionistiska PSC-derived kortikala enskiktslager kulturer och in-vivo studier, och att det utgör en tillförlitlig och stabil cell-baserad modellsystem att simulera tidigt mänskliga kortikala utveckling vid hälsa och sjukdom utanför den mänskliga kroppen.
Hjärnan organoids utgör ett kraftfullt verktyg för att studera hjärnans utveckling i vitro som ger relevanta arter bakgrunden och det komplexa 3D arrangemanget av celler i en vävnad sammanhang. Med det överbrygga de klyftan mellan icke-mänskliga djur modeller och reduktionistisk mänskliga tvådimensionell enskiktslager cell kultur tekniker. Sina program, dock hämmas av bristande reproducerbarhet9. Vi har utvecklat ett framhjärnan-typ organoid protokoll, som övervinner de stora prov till prov variationen genom att kombinera iPSC självorganiserande kapacitet med deras föredragandens till mönstring faktorer. Specifikt, iPSCs var samman för att främja självorganisering och därefter hämmar TGF-ß/SMAD signalering att främja dorsala cortex differentiering genom att utsätta kulturerna till en BMP (LDN-193189) och en TGF-β typ I receptor hämmare (A83-01). Dessutom tillämpades en förening att hämma Wnt vägen (IWR) för att förhindra posteriorization. I motsats till ‘inneboende’ cerebral organoid protokoll19, som baseras på självmontering utan extern kontroll ger upphov till ganska heterogena hjärnan organoids och uppvisar stor batch variationer (mätt med effektivitetsvinsterna av polariserade neurala ektoderm bildandet15), det protokoll som beskrivs här reproducibly genererar homogen framhjärnan-specifika organoids från iPSCs mänskliga.
Dessa framhjärnan-typ organoids kan användas för en mängd applikationer såsom nervsystemets studier, evolutionära studier inklusive gen funktion studier, sjukdom modellering, och eventuellt läkemedel testning och terapeutiska ändamål. Protokollet är dock mest lämplig att studera tidiga aspekter av mänskliga kortikala utveckling. Till exempel har vi använt den framhjärnan-typ organoids för att undersöka mänskliga-specifika aspekter av vRGC beteende. Mer specifikt, patofysiologiska förändringar i samband med en allvarlig form av Lissencefali, en mänskliga kortikala missbildning som kännetecknas av en nära avsaknad av kortikal vikning, åtgärdades. Endast vissa aspekter av denna sjukdom kan modelleras i möss som mus hjärnan är naturligt lissencephalic. När gäller Lissencefali patientderiverade iPSCs organoid systemet, kunde vi tillförlitligt recapitulate mänskliga-specifika aspekter av sjukdomen och identifiera bakomliggande mekanismer. Mer specifikt, kunde vi visa att patientderiverade organoids visar en betydande minskning i storlek som orsakas av en switch från symmetriska till asymmetrisk celldelning av vRGCs. Denna växel var förknippad med förändringar i organisationen av vRGCs’ mikrotubulära nätverket, en störning av arkitekturen av den VZ nischen och förändrat uttryck av Celladhesionmolekylar, leder till en försämrad aktivering av den N-cadherin/β-catenin signalering axel10. Notera: β-catenin-beroende reglering av vRGC uppdelning lägen föreslogs vara mänskliga-specifika eftersom överuttryck av β-catenin hos möss leder till tangentiella cortex expansion och därefter kortikala fällbara20. Således markera vår data att framhjärnan-typ organoid systemet representerar ett lovande verktyg för att studera i ett kvantifierbart sätt de mänskliga-specifika aspekterna av tidig kortikala utveckling i vitro.
En stor utmaning för framtiden är att upprätthålla enhetligheten av organoids över längre period för att uppnå mer mogen neuronala fenotyper. Detta kan förverkligas genom en eller flera av följande: odling av organoids i en bioreaktor system14, tillämpa flytande ställningar15, komplettera det differentiering mediet med neurala tillväxt eller neuronal överlevnad faktorer. Slutligen kan en kontrollerad ökning av hjärnans komplexitet uppnås genom att smälta den framhjärnan-typ organoids med cerebral organoids olika regionala identitet21,22.
Sammantaget erbjuder framhjärnan-typ organoid protokollet presenteras här ett enkelt tillämpliga och tillförlitligt verktyg för generering av tidig kortikala strukturer in vitro. Protokollet ger upphov till mycket homogen tidiga kortikal vävnad över flera iPSC linjer och kan utnyttjas för att på ett tillförlitligt sätt generera individ-specifika kortikal vävnad. Systemet är således särskilt lämplig för applikationer som kräver en hög grad av homogenitet och reproducerbarhet såsom sjukdom modellering.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av ministeriet för Innovation vetenskap och forskning av norr Rhine-Westphalia (Junior forskningsgrupp) och av ERA-NET NEURON, JTC 2015 kind, STEM-MCD.
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |