Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية محسنة لمجموعة وفيرة من السائل الدماغي النخاعي (CSF) مع أي تلوث من الدم. مع أكبر جمع العينات والنقاء، يمكن إجراء مزيد من التحليلات باستخدام قوات الأمن المركزي لزيادة فهمنا للأمراض التي تصيب المخ والحبل الشوكي.
Abstract
السائل الدماغي النخاعي (CSF) سائل الجسم قيماً للتحليل في أبحاث علم الأعصاب. هو واحد من السوائل على اتصال أوثق بالجهاز العصبي المركزي، وهكذا، يمكن استخدامها لتحليل حالة المريضة من الدماغ أو الحبل الشوكي دون الوصول مباشرة إلى هذه الأنسجة. ومع ذلك، في الفئران من الصعب الحصول على ماغنا تشيستيرنا نظراً للتقارب في الأوعية الدموية، التي غالباً ما تلوث العينات. المنطقة لجمع السائل الدماغي النخاعي في الفئران من الصعب أيضا تشريح ويتم الحصول على عينات صغيرة غالباً فقط (الحد الأقصى من 5-7 ميليلتر أو أقل). يصف هذا البروتوكول بالتفصيل أسلوب الذي يحسن في الأساليب الحالية لجمع لتقليل التلوث من الدم والسماح لمجموعة وفيرة من السائل الدماغي النخاعي (في المتوسط يمكن أن تجمع 10-15 ميليلتر). يمكن استخدام هذا الأسلوب مع غيرها من أساليب التشريح لجمع الأنسجة من الفئران، كما أنها لا تؤثر على أي أنسجة أثناء استخراج السائل الدماغي النخاعي. وهكذا، المخ والحبل الشوكي لا تتأثر بهذا الأسلوب، وتظل على حالها. مع أكبر جمع عينة السائل النخاعي والنقاء، مزيد من التحليلات يمكن استخدامها مع هذا البحث الأعصاب السوائل لزيادة المعونة، وفهم أفضل للأمراض التي تصيب المخ والحبل الشوكي.
Introduction
الخدمات القطرية سائل الجسم قيماً للتحليل في أبحاث علم الأعصاب. الخدمات القطرية يتكون أساسا من بلازما الدم، التي تحتوي على بعض الخلايا (لا خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء قليلة فقط)، وهي خالية تقريبا من البروتين. أنها واحدة من السوائل على اتصال وثيق مع الجهاز العصبي المركزي (CNS) وأنه يمكن تمرير الشوارد العديد من من المخ والحبل الشوكي إلى النظام الطرفية. في البشر، وعينات السائل الدماغي النخاعي يمكن جمعها للمساعدة في تشخيص المرض، أو لأغراض البحث في التجارب السريرية، كالعمود الفقري الحنفية (أو البزل القطني) هو إجراء طفيفة والغازية: السائل السائل الدماغي النخاعي يمكن أن تعكس التغيرات في الجهاز العصبي المركزي دون الحاجة إلى الوصول مباشرة إلى هذه الأنسجة. وهكذا، وفي السنوات الأخيرة، لأغراض البحث في العيادة، حصلت عينات السائل الدماغي النخاعي من مرضى أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر وغيرها2،ديمينتياس،من13. وهناك العديد من فحوصات العلامات البيولوجية التي تم تطويرها باستخدام عينات السائل الدماغي النخاعي يحتمل أن تكون المساعدة في تشخيص الأمراض في عيادة2،3. ومع ذلك، هناك الكثير من النقاش حول موثوقية هذه الاختبارات لتحقيق نتائج متسقة والحساسة لتشخيص المرض4،5على وجه التحديد. لذا، هناك حاجة كبيرة لوضع أفضل من فحوصات والأهداف، التي يمكن العثور عليها في إطار الخدمات القطرية، للمساعدة في إنتاج تقنية قياسية لتشخيص أمراض الأعصاب بحساسية وخصوصية أكبر. نظراً للأهمية المحتملة للبشرية عينات CSF في الأمراض، جمع السائل النخاعي من القوارض في أبحاث علم الأعصاب أيضا للفائدة.
الفئران الحيوانات هامة في البحوث الطبية والبيولوجية والسماح للاختبار لإثبات مفهوم الدراسات قبل التجارب السريرية البشرية والمركبات العلاجية المحتملة. ومع ذلك، في الفئران من الصعب الحصول على عينات السائل الدماغي النخاعي نظراً لأن قربه من الدماغ في حيوانات صغيرة، كما الأسلوب المعتاد لمجموعة الخدمات القطرية في الفئران الحصول عليه عن طريق السيستيرنا ماجنا، فتح بين المخيخ والظهريه سطح سيسائيه لب. وهذا يسبب صعوبة في جمع عينات السائل الدماغي النخاعي كما من الصعب تشريح لهذا المجال أو بالقرب من الأوعية الدموية، ويزيد من خطر التلوث من خلايا الدم. نظراً لهذه الصعوبات، يمكن لمعظم الباحثين فقط الحصول على كمية صغيرة من السائل الدماغي النخاعي للتحليل (وعادة ما ذكر ميليلتر 5-7) وتلوث عينات السائل الدماغي النخاعي بخلايا الدم هو الشاغل الرئيسي للتحليلات6،،من78 , 9-تلوث الدم يمكن أن يحجب النتائج وليس حقاً تعكس الحالة من الجهاز العصبي المركزي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر عينة محدودة جمعت البحوث حسب المبلغ المعتاد التي جمعت من الفئران بما فيه الكفاية لقياس واحد فقط (في تكرار أو ثلاث نسخ) باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). وهكذا، مجمعة عينات السائل الدماغي النخاعي عادة من الفئران متعددة كي يكون عينة كافية لتشغيل فحوصات متعددة. وضع بروتوكول لوفرة، جمع غير ملوثة من السائل النخاعي من الفئران هو المطلوب إلى حد كبير وسوف تكون مفيدة في تحسين بحوث علم الأعصاب باستخدام القوارض.
في هذا البروتوكول، تقنية لوفرة (في متوسط 10-15 ميليلتر) مجموعة من الخدمات القطرية من الفئران تخديره هو وصف بالتفصيل ويقوم بتحسين طريقة جمع السائل الدماغي النخاعي لتقليل التلوث من الدم10معروفة حاليا. بروتوكول قوية لجمع السائل الدماغي النخاعي سيساعد في تطوير فحوصات العلامات البيولوجية على أساس الخدمات القطرية، التي يمكن استخدامها للمساعدة في تشخيص المرض، فضلا عن تحسين البحث في الآليات التي تكمن وراء الأمراض التي تؤثر الجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لسياسات المجتمع "علم الأعصاب" (الولايات المتحدة الأمريكية) واللجان الأخلاقية في جامعة فودان في شانغهاي (الصين). ويتم هذا الإجراء لجراحة غير البقاء على قيد الحياة.
1-إعداد جهاز جمع السائل الدماغي النخاعي
- سحب الزجاج الشعرية (القطر الداخلي 0.75 ملم، القطر الخارجي 1.0 مم) باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي (كما هو موضح في ليو et al. 10؛ شحذ الشعرية ويرد في الشكل 1).
- مكان زجاج شحذ شعرية في حامل الشعيرات الدموية التي شنت بشدة على ميكرومانيبولاتور (الشكل 1A).
- كسر غيض الشعرية شحذ مع الملقط على التوالي تحت مجهر تشريح، حيث يكون القطر الداخلي لنصيحة مقطوعة عن 10-20 ميكرومتر (الشكل 1).
- إرفاق أنبوب رفيع وحقنه في الطرف الآخر من صاحب الشعرية، وقم بتوصيل أنبوب رفيع والمحاقن مع صمام ثلاثي.
- تحويل صمام ثلاثي لفتح ويغرق حقنه بضربه جوية من المحاقن من خلال الأنبوب للزجاج الشعرية طرد أي ملوثات وخلق ضغط إيجابي في الأنبوبة الشعرية.
- كرر ذلك عدة مرات بتضليل الاتصال وإعادة الاتصال حقنه بصمام ثلاثي، ووضع المحاقن ~ 100-200 ميليلتر قبل إعادة الاتصال الأخير من المحاقن مع صمام ثلاثي (الشكل 1B).
- تحريك ميكرومانيبولاتور مع الزجاج الشعرية إلى جانب منع الضرر أثناء تشريح الفأر.
رقم 1. المجهر، ميكرومانيبولاتور، والإعداد الشعرية. مجهر (A) وميكرومانيبولاتور مع شعري تعلق الإعداد، فضلا عن صورة أوثق من (ب) بحقنه متصلة وصمام ثلاثي لفتح (الموضح هنا) أو إغلاق الأنابيب، و (ج) دون انقطاع (يمين) وكسر (يسار) نصيحة شعرية جاهزة لجمع السائل الدماغي النخاعي. مرة واحدة مكسورة، ينبغي أن يكون غيض من شعري بالقطر الداخلي 0.75 مم والقطر الخارجي من 1.0 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2-تشريح الماوس
- تخدير الماوس.
ملاحظة: لهذا البروتوكول و C57BL/6 اميلويد السلائف البروتين/presenilin 1 (التطبيق/PS1) المعدلة وراثيا كانت تستخدم الفئران (طراز الماوس مرض الزهايمر) وتخديره مع 4% كلورال هيدرات (في dH20) في 10 ميليلتر/غرام وزن الماوس عبر داخل حقن. - عند تخديره تماما، ضمان أن يتم تخديره الماوس على نحو كاف. يتم تنفيذ استجابة الانسحاب إلى أخمص القدمين قرصه، بتمديد أطرافه هند قليلاً ومعسر أصابع القدم ومشاهدة استجابة انسحاب، لأؤكد للتخدير الكافي. تحقق من معسر جميع أطرافه الأربعة؛ إذا لم يكن هناك أي رد فعل من تخديره الماوس بشكل صحيح. قص وتشذيب الشعر في الجزء الخلفي من الرأس للماوس فوق العينين، وبين الأذنين إلى أسفل الرقبة باستخدام مقص تشريح (الشكل 2A). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مقص أو كريم مزيل الشعر للمساعدة في إزالة الشعر.
- تأمين رأس الماوس باستخدام محول ماوس (مؤخرة الرأس مواجهة مع الآنف وأشار إلى أسفل في ~ 45 °، الشكل 2 أ). إصلاح القضبان الإذن بين الأذنين والعينين للماوس وتشديد. تأكد من الرأس لا يمكن نقل وتأمين محكم في المحول عن طريق دفع بلطف إلى أسفل إلى رأس الماوس.
- إعادة فحص استجابة الانسحاب إلى أخمص القدمين رشة قبل إجراء الشق الجراحي وبصورة منتظمة بعد ذلك أن أؤكد للطائرة الجراحية التخدير. بصريا ملاحظة أي تغير في معدل التنفس أثناء الإجراء للإشارة إلى التغييرات في الطائرات للتخدير. يمكن استخدام تقنية نظيفة وغير معقمة، لهذه الجراحة غير البقاء على قيد الحياة قصيرة. باستخدام المقص والملقط المنحنية، قطع من خلال الجلد والطبقة الأولى من العضلات حتى يتم كشف قاعدة الجمجمة مع سوى طبقة رقيقة من العضلات.
ملاحظة: قطع طريق الجلد الماوس عبر الجزء الخلفي الرقبة وثم قطع الجلد أسفل منتصف الجمجمة بين الأذنين والعينين من الماوس. الجلد والأنسجة يمكن ثم سحبها بعيداً والخروج من المنطقة عبر ماجنا تشيستيرنا. - بينما العرض من خلال مجهر تشريح، بعناية تشريح بعيداً آخر رقيقة طبقات من العضلات على قاعدة الجمجمة استخدام الملقط ونقل هذه الطبقات من العضلات إلى الجانب والخروج من مجال الاهتمام. إذا كان هناك نزيف، استخدام براعم القطن لإزالة وتساعد على وقف النزيف.
- عندما يتعرض لها دوراً أكثر ماغنا تشيستيرنا (الثلاثي في الشكل مع عادة الأوعية الدموية الكبيرة 1-2 يمر عبر المنطقة؛ أما الجانب أو بين الأوعية الدموية الأمثل للإدراج الشعرية وجمع السائل الدماغي النخاعي، الشكل 2)، استخدم رطب براعم القطن مسح الغشاء نظيفة ومن ثم استخدام برعم القطن جافة لتجفيف المنطقة.
رقم 2. إعداد الماوس والتشريح بالصور التمثيلية للإدراج الشعرية لجمع السائل النخاعي. إعداد الماوس جاهزة لاستخراج السائل الدماغي النخاعي مع (أ) حلق الرأس فرضت في مكان لتشريح و (ب) تفاصيل الصورة (العرض x 10) دوراً الماوس تشريح تغطي ماجنا تشيستيرنا (سهم متقطع يظهر الأوعية الدموية يمر عبر المنطقة و سهم خالص يظهر المجال الأمثل للإدراج الشعرية). الصور مفصلة (العرض x 10) (ج) شحذ غيض زجاج الشعرية المنحازة ضد دوراً السيستيرنا ماجنا، (د) النقطة الذي مدبب شعري تقريبا دوراً، مع بعض المقاومة من دوراً، و (ه) نصيحة الشعرية استغلالها من خلال دوراً لجمع السائل الدماغي النخاعي. يجب أن يكون السائل الدماغي النخاعي سائل واضحة جمعت في الزجاج الشعرية (سهم منقط). تشير إلى كافة أشرطة الجدول في أسفل كل صورة مجهر الحق 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-الخدمات القطرية جمع من تخديره من الماوس
- محاذاة الشعرية الزجاج إلى الجزء الخلفي الرأس الماوس حتى لا يكون نقطة شحذ خلف الغشاء في ~ زاوية 30-45 درجة مئوية (الشكل 2).
- يغرق حقنه مرة واحدة أو بضع مرات، ورسم حقنه ~ 100-200 ميليلتر (للتأكد من أن هناك لا الملوثات، وهناك ضغط سلبي في الزجاج الشعرية).
- استخدام ميكرومانيبولاتور، الانتقال الشعرية تلميح أقرب للغشاء حتى يمكن رؤية المقاومة، ولكن لا ثقب ذلك (الشكل 2D).
- مرة واحدة ويعتبر المقاومة بين الحافة شعري والغشاء، بلطف اضغط الأنبوبة الشعرية عبر الغشاء من يطرق على عناصر التحكم ميكرومانيبولاتور. استخدام المجهر لرؤية شحذ نقطة ثقب الشعرية إلى ماجنا السيستيرنا. تلقائياً يمكن استخلاصها الخدمات القطرية في الأنبوبة الشعرية مرة واحدة وقد تم فتح ثقب (الشكل 2E).
- اترك شعري ببطء جمع السائل الدماغي النخاعي. إذا تم إيقاف الخدمات القطرية استخلاص، رسم المحاقن تصل كمية صغيرة ببطء (~ 50 ميليلتر) لخلق ضغط سلبي أكثر في شعري لاستخراج خارج إطار الخدمات القطرية.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، الشعرية يمكن أن تكون بلطف وبطء انسحبت من الدماغ باستخدام عناصر التحكم ميكرومانيبولاتور الجميلة للسماح لقوات الأمن المركزي تتدفق شعري مرة أخرى. مبلغ إجمالي قدرة ~ 10-15 ميليلتر للخدمات القطرية (~ 3-4 سم الشعرية) يأخذ ~ 10-30 دقيقة، وفي بعض الأحيان 20 ميليلتر أو أكثر يمكن جمعها. على الرغم من أن ليس من الضروري على الإطلاق، ينصح باستخدام لوحة حرارة أثناء جمع السائل الدماغي النخاعي. تم تنفيذ مجموعة الخدمات القطرية في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية). - حالما يتم جمع كمية السائل النخاعي المطلوب، قم بإغلاق الأنبوب بتحويل صمام ثلاثي لإغلاق (لإيقاف الرسم خارج إطار الخدمات القطرية).
- إخراج حقنه متصلة بالأنابيب، وثم فتح وإغلاق الأنبوب (لخلق ضغط التعادل في الشعرية وأنابيب ومنطقة خارج شعري). إعادة المحاقن مع صمام ثلاثي، لكن لا يغرق المحاقن.
- بلطف إزالة شعري الزجاج من ميكرومانيبولاتور باستخدام الماوس.
- ضع أنبوب جمع (1.5 مل microtubes مع 1 ميليلتر من 20 x مثبط البروتياز) تحت النقطة شحذ الزجاج الشعرية.
- فتح الأنبوب ويغرق حقنه بلطف: الخدمات القطرية ينبغي أن تنبثق من الشعرية وإلى أنبوب جمع.
- بعد جمع، بسرعة الطرد المركزي (نبض تدور 5 s بالسرعة القصوى باستخدام أجهزة الطرد مركزي مصغرة) الخدمات القطرية لخلط العينة مع مثبط البروتياز في الجزء السفلي من أنبوب جمع.
ملاحظة: يمكن أن تكون عينات السائل الدماغي النخاعي الكوتيد ثم تخزينها لمزيد من التحليل في-80 درجة مئوية. يمكن تشريح بقية الماوس للأنسجة الأخرى، مثل المخ والحبل الشوكي. الماوس لا يزال حيا في هذه المرحلة، وهكذا الدم يمكن أن تجمع أيضا، إذا لزم الأمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء المذكورة هنا (الشكل 1 و الشكل 2)، ينبغي أن يكون السائل الدماغي النخاعي جمعت فورا في شعري واضحة (2E الشكل)، ولا الوردي أو الأحمر. إذا لم يكن هناك وردي لمسحه حمراء للسائل التي تم جمعها في شعري، ثم كان هناك تلوث بالدم.
كمثال لتطبيق عينة السائل الدماغي النخاعي جمعت بهذه الطريقة، تم قياس مستويات البروتين اميلويد بيتا (Aβ) استخدام أليسا. عادة يتم قياس مستويات Aβ في الخدمات القطرية في أبحاث مرض الزهايمر7. الخدمات القطرية في معظمها خالية من البروتين. في نموذج الفأر من مرض الزهايمر (التطبيق/PS1 الفئران)، مستويات البشرية Aβ42 هي زيادة كبيرة، كما أوفيريكسبريس هذه الفئران البشرية التطبيق. ويمكن ملاحظة هذا مع العينات من السائل الدماغي النخاعي جمعت من 12 شهرا الفئران باستخدام الأساليب الموضحة هنا (0 بيكوغرام/مل في إطار الخدمات القطرية للفئران (WT) البرية من نوع مقارنة pg/mL 1,303 في الفئران الخدمات القطرية للتطبيق/PS1، الشكل 3).
الشكل 3. جمعت نتائج تمثيلية لعينات السائل الدماغي النخاعي. أليسا تحليل عينة من السائل الدماغي النخاعي جمعت. في نموذج الفأر من مرض الزهايمر (التطبيق/PS1)، هناك زيادة كبيرة في مستويات البشرية Aβ42 في إطار الخدمات القطرية، كما أوفيريكسبريس هذه الفئران البشرية Aβ42 (1,303 pg/mL). ينبغي أن يكون الفئران هناك في البرية من نوع (WT) لا البشرية Aβ42 الكشف عن (0 pg/mL). مزاوج تي-تم استخدام اختبار لقياس أهمية، * * ف < 0.01، أشرطة الخطأ ممثلة بوزارة شؤون المرأة، n = 3 و 4 من الفئران في غضون 12 شهرا عمر على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل أسلوب الذي يحسن في الأساليب الحالية10 جمع السائل الدماغي النخاعي لتقليل التلوث من الدم، والسماح لمجموعة وفيرة من الخدمات القطرية (في المتوسط ~ يمكن الحصول على 10-15 ميليلتر) من الفئران. عند كسر تلميح الشعرية، غيض من الشعرية لا ينبغي صغيرة جداً (كما ثم الخدمات القطرية سيتم استخراج ببطء شديد) أو كبير جداً (سوف لا تكون كافية لجمع الخدمات القطرية بشكل جيد والأنسجة يمكن أن تصبح استقرت في شعري). وينبغي توخي الحذر عند تشريح المنطقة لجمع السائل الدماغي النخاعي: ينبغي وقف أي نزيف وتنظيف المنطقة لإدراج الزجاج الشعرية من الدم مع dH20 لتجنب التلوث بالعينة. تشريح لكل الماوس مختلف، ولكن معظم أجهزة الماوس بالأوعية الدموية الرئيسية 1-2 يمر في المنطقة حيث شعري يحتاج إلى إدراج لجمع السائل الدماغي النخاعي. اختيار المكان الصحيح للإدراج شعري مهم، كإدراج قريبة جداً من الأوعية الدموية الرئيسية سوف تلوث السائل الدماغي النخاعي مع الدم. كما هو مبين في الشكل 2، مساحة واضحة من الأوعية الدموية، مثل العلاقة بين أو على أي من جانبي الأوعية الدموية الرئيسية، الأمثل للإدراج الشعرية لتجنب التلوث. إذا كان إطار الخدمات القطرية لم تتدفق بمعدل مطرد وتوقف بعد بعض الوقت، رسم المحاقن قليلاً (~ 50 ميليلتر) يمكن أن يساعد على إعادة تدفق السائل النخاعي إلى شعري. بدلاً من ذلك، الشعرية نفسها يمكن نقلها بلطف وبطء أو الخروج من الماوس مع ميكرومانيبولاتور لإعادة تدفق استخراج السائل الدماغي النخاعي. يجب توخي الحذر عند القيام بهذه الخطوات كالدم يمكن أن تتدفق الشعرية كذلك. يعمل هذا الأسلوب أيضا بسبب الاختلافات في الضغط من الدماغ والزجاج الشعرية لاستخلاص السائل النخاعي من الماوس. وهكذا، الماوس يمكن إلا تكون ثقب مرة واحدة، كما بعد الشعرية يتم إدراجها في الماوس وأخرجت، وهناك فقدان الضغط في الدماغ والسائل الدماغي النخاعي لن يعد الانجرار إلى شعري تلقائياً إذا يتم إدراجها مرة أخرى. ولذلك، سوف الكمال ممارسة هذا الأسلوب لإنتاج لا ملوثات الدم والحصول على مناسبة لجمع السائل الدماغي النخاعي على الإدراج الأولى شعري في الماوس (من التجربة، 10-20 الممارسة الفئران ستكون كافية للوصول إلى هذه المرحلة).
هذا البروتوكول هو أسلوب محسنة وفعالة لاستخراج السائل النخاعي من الفئران، وإذا فعلت بشكل صحيح، يقلل من تلوث من الدم (الشكل 1و الشكل 2، الشكل 3). هذا الأسلوب يحد من الوقت الذي يستغرقه للخدمات القطرية التي سيتم جمعها. عادة، هناك حاجة إلى 30 دقيقة لجمع ~ 15 ميليلتر أو أكثر من الخدمات القطرية في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية). خلال هذا الوقت، يمكن الاحتفاظ الماوس دافئة مع القطن والصوف أو الأنسجة، ولكن دون غطاء أو وسادة الحرارة، الخدمات القطرية يمكن لا يزال بنجاح جمع. إضافة لوحة حرارة أو الاحترار الماوس قبل الإجراء قد تحسين هذا الأسلوب عن طريق زيادة تدفق السائل النخاعي من الدماغ وتقليل الوقت اللازم لجمع، كما هو موضح في10،أساليب أخرى11. ولكن استخدمت في البروتوكول هو موضح هنا، لا لوح الحرارة أو ارتفاع درجة حرارة الماوس وبين الفئران لا توجد صعوبة مبلغ الخدمات القطرية التي يمكن جمعها. كمثال للتطبيق هذه التقنية يمكن أن تستخدم ل، قيست مستويات البشرية Aβ42 استخدام أليسا. ومن المعروف أن تكون لزجة Aβ ويمكن أن تنضم إلى الزجاج وأنابيب جمع. في هذا البروتوكول، واستخدمت زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية وأنابيب البولي بروبيلين لتجميع الخدمات القطرية من الفئران. بينما يجوز التمسك Aβ بعض الزجاج الشعرية وجدران أنابيب جمع، ELISA النتائج تبين أن مستويات Aβ يمكن قياسها (الشكل 3). ومع ذلك، إمكانية أن مستويات Aβ يقاس من السائل الدماغي النخاعي جمعت في هذا البروتوكول أقل من التي وصفها بدراسات أخرى، ولكن الزجاج الشعيرات الدموية ضرورية للثقب عن طريق دوراً للماوس لتجميع الخدمات القطرية. وإلى جانب قياس Aβ، البروتينات الأخرى ذات الاهتمام يمكن أيضا قياس استخدام الخدمات القطرية التي تم جمعها.
في حين نشرت سابقا طريقة جمع السائل الدماغي النخاعي قبل ليو et al. 10 المقصود لجمع السائل الدماغي النخاعي المستمر من الفئران الحية، الأسلوب الموصوفة هنا لجمع السائل النخاعي من الفئران يمكن التضحية بها لجمع الأنسجة والتحليل. وهكذا، يمكن استخدام هذه التقنية جنبا إلى جنب مع غيرها من أساليب التشريح لجمع الأنسجة الماوس كما أنه لا يؤثر على المخ والحبل الشوكي، وبعد جمع السائل الدماغي النخاعي (أيبعد 10-30 دقيقة ل ~ 10-15 ميليلتر للخدمات القطرية)، ينبغي أن يكون لا يزال يتنفس الماوس و تحت التخدير. ولذلك، الأنسجة الأخرى مثل الدم والمخ والحبل الشوكي والكبد لا تزال قابلة للتطبيق لجمع وتحليل الكيمياء الحيوية. على الرغم من أن ليو et al. أسلوب جمع الخدمات القطرية بشكل سريع جداً (10 دقيقة لكل الماوس ميليلتر 3-7 من السائل الدماغي النخاعي)، الأسلوب الموصوفة هنا تستغرق وقتاً أطول، لكن يمكن جمع أكثر الخدمات القطرية10. أيضا قد وصف طريقة أخرى لجمع السائل الدماغي النخاعي مايا et al. 11 على حد سواء ليو et al. وتصف مايا et al. أساليب جمع السائل النخاعي من الفئران باليد-عقد الزجاج الشعيرات الدموية أو هلام محمل نصائح وثقب في ماغنا تشيستيرنا. يختلف الأسلوب الموصوفة هنا عن طريق تحديد الشعرية ميكرومانيبولاتور. وهذا ما يضمن أن الشعرية يتم الاحتفاظ بها غير متحرك ويقلل من التلوث من الدم أثناء جمع السائل الدماغي النخاعي. ميكرومانيبولاتور يسمح أيضا للمزيد من الدقة والدقة في ثقب ماجنا تشيستيرنا للحصول على الخدمات القطرية. على الرغم من أن أسلوب et al. مايا كان أيضا قادراً على الحصول على 15-20 ميليلتر للخدمات القطرية للماوس، فإنه يتطلب ثقب ماجنا تشيستيرنا مرارا وتكرارا باليد مع هلام محمل النصائح، التي قد تزيد من خطر التلوث من الدم أو الأنسجة. وعلاوة على ذلك، مايا الأسلوب et al. قد ينخفض الضغط في الدماغ مع كل ثقب متسلسلة من ماغنا تشيستيرنا حيث أن هناك أقل وأقل السائل الدماغي النخاعي جمعت في كل مرة. يتضمن الأسلوب الموصوفة هنا ثقب واحد فقط وترك شعري في ماغنا تشيستيرنا مواصلة جمع الخدمات القطرية كما أنه الغيارات مع الخدمات القطرية بينما الفأر تحت التخدير. وهكذا، البروتوكول وصف هنا بشكل مستمر يجمع السائل الدماغي النخاعي ويقلل من التلوث المحتمل من ثقوب المتكررة في السيستيرنا ماجنا فضلا عن الإخلال بالانسجة المحيطة.
مع أكبر جمع عينة السائل النخاعي والنقاء، يمكن استخدام مزيد من التحليلات مع هذا السائل إلى زيادة المعونة في أبحاث علم الأعصاب. فمن المعروف جيدا لدى الباحثين أن جمع السائل النخاعي من الفئران يمكن أن تكون مملة وفقط يمكن الحصول على عينة محدودة (وذكر عادة كحد أقصى من 5-7 ميليلتر6،7،،من89). في الأدب، ليس هناك العديد من تفاصيل البروتوكولات المنشورة لاستخراج السائل الدماغي النخاعي ويحسن هذا البروتوكول على طريقة منشورة سابقا10 لتقليل التلوث من الدم، مع الحفاظ على مجموعة وفيرة من الخدمات القطرية. الخدمات القطرية العديد من التطبيقات في أبحاث علم الأعصاب كواحد من السوائل الأقرب إلى أنسجة الجهاز العصبي المركزي، نموذج قيمة للبحث. وقد حددت مسبقاً أن ماوس الكبار بإجمالي حجم 40 ميليلتر للخدمات القطرية12. وهكذا، هذا البروتوكول غير قادرة على الحصول على نسبة 25 في المائة، وربما أكثر من المبلغ الإجمالي للخدمات القطرية ماوس الكبار. إضافة إلى السلالات الفطرية C57BL/6 والتطبيق/PS1 الفئران، سلالة أووتبريد ولﻷخذ منطقة (الممثل المدني) لمكافحة الفئران أيضا استخدمت بنجاح جمع السائل الدماغي النخاعي باستخدام هذا البروتوكول. وتم جمع السائل النخاعي من الفئران من مختلف الإعمار (4 و 18 شهرا) بنجاح باستخدام هذا البروتوكول. وبالتالي، ينبغي أن يكون هناك أي صعوبة في جمع الخدمات القطرية من سلالات مختلفة أو لسن من الفئران باستخدام هذا الأسلوب. نأمل ستستخدم هذا البروتوكول مفصلاً بكثير لتحسين تطوير فحوصات السائل النخاعي وغيرها من تقنيات التحليل للمساعدة في البحث لفهم أمراض الأعصاب التي تؤثر على المخ والحبل الشوكي.
من الأهمية بمكان أن يتم تثبيتها رأس الماوس محكم، حيث لم تتحرك خلال التشريح ومجموعة الخدمات القطرية (القسم 3 من البروتوكول). الموقع لثقب الأولية إلى ماجنا تشيستيرنا مهم للحصول على الخدمات القطرية وفيرة، غير الملوثة. الشعرية لا ينبغي أن تدرج قريبة جداً أي الأوعية الدموية لتجنب تلوث العينة التي تم جمعها. وعلاوة على ذلك، التكيف شعري أمر حاسم لجمع السائل الدماغي النخاعي الأمثل. يسمح استخدام ميكرومانيبولاتور لتعديلات دقيقة دون الإخلال بالانسجة المحيطة إلى حد كبير وتلويث الخدمات القطرية. استخدام عناصر تحكم خير من ميكرومانيبولاتور، شعري يمكن ببطء نقل داخل أو خارج للسماح للخدمات القطرية تتدفق من الماوس والشعرية لجمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل "الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية" (81650110527، 81371400) و "الوطنية المفتاح الأساسي البحث برنامج الصين" (2013CB530900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. , (2016).
- You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
