Summary
Ce protocole décrit une technique améliorée pour la collection abondante de liquide céphalo-rachidien (LCR) sans la contamination du sang. Avec une plus grande collecte d’échantillons et de la pureté, des analyses plus peuvent être effectuées à l’aide de CSF pour faire avancer notre compréhension des maladies qui affectent le cerveau et la moelle épinière.
Abstract
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Il est l’un des fluides en contact plus proche avec le système nerveux central et ainsi, peut être utilisé pour analyser l’État malade du cerveau ou la moelle épinière sans accéder directement à ces tissus. Cependant, chez les souris, qu'il est difficile d’obtenir de la magna de cisterna en raison de sa proximité aux vaisseaux sanguins, qui contaminent souvent échantillons. La zone pour collection CSF chez la souris est aussi difficile à décortiquer à et souvent seulement de petits échantillons sont obtenus (maximum de 5-7 µL ou moins). Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore les méthodes actuelles de collecte pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du LCR (en moyenne que 10-15 µL peuvent être collectées). Cette technique peut servir à d’autres méthodes de dissection pour la collection de tissus provenant de souris, car il n’influe pas sur les tissus lors de l’extraction de la CSF. Ainsi, le cerveau et la moelle épinière ne sont pas affectés par cette technique et restent intacts. Avec une plus grande collecte d’échantillons de CSF et pureté, des analyses plus peuvent être utilisés avec ce fluide d’autre aide la recherche en neurosciences et mieux comprennent les maladies qui touchent le cerveau et la moelle épinière.
Introduction
Le CSF est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Le CSF est principalement fabriqué à partir de plasma sanguin, contenant peu de cellules (sans culots globulaires et seulement quelques cellules de sang blanches) et est presque exempt de protéines. C’est l’un des fluides en contact étroit avec le système nerveux central (CNS) et il peut passer des électrolytes beaucoup du cerveau et la moelle épinière vers le système périphérique. Chez l’homme, échantillons de LCR peuvent être recueillis pour aider à diagnostiquer la maladie ou à des fins de recherche dans les essais cliniques, comme une ponction lombaire (ou ponction lombaire) est une procédure invasive mineure : le fluide de CSF peut refléter des changements dans le système nerveux central sans avoir à accéder directement à ces tissus. Ainsi, ces dernières années, à des fins de recherche à la clinique, les échantillons de LCR ont été obtenus de patients atteints de maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et autres démences1,2,3. Il existe plusieurs tests de biomarqueurs qui ont été développés en utilisant des échantillons de LCR pour éventuellement aider dans le diagnostic des maladies à la clinique2,3. Cependant, il y a beaucoup de débats sur la fiabilité de ces tests pour produire des résultats constants et sensibles pour diagnostiquer précisément la maladie4,5. Donc, il y a un grand besoin pour le développement de la meilleure des dosages et des objectifs qui peuvent être trouvés dans le LCR, pour aider à produire une technique standard pour diagnostiquer les maladies neurodégénératives avec plus de sensibilité et de spécificité. En raison de l’importance potentielle des échantillons de LCR humaines dans la maladie, la collection du CSF de rongeurs dans la recherche en neurosciences est également intéressant.
Les souris sont des animaux importants dans la recherche biologique et médicale et permettant l’analyse de composés thérapeutiques potentiels et les études de validation avant d’essais cliniques humains. Cependant, chez les souris il est difficile d’obtenir des échantillons de LCR en raison de sa proximité au cerveau dans un petit animal, étant donné que la méthode habituelle de CSF collection chez la souris doit l’obtenir par l’intermédiaire de la cisterna magna, une ouverture entre le cervelet et la surface dorsale du bulbe rachidien. Cela provoque des difficultés dans la collecte d’échantillons de LCR car cette zone est difficile à décortiquer à et à proximité des vaisseaux sanguins, augmentant le risque de contamination par les globules. En raison de ces difficultés, la plupart des chercheurs ne peuvent obtenir une petite quantité de LCR pour analyse (habituellement soit le µL 5-7) et la contamination des échantillons de LCR par les globules est une préoccupation majeure pour les analyses6,7,8 , 9. contamination de sang peut obscurcir les résultats et ne reflète pas véritablement l’état de la CNS. En outre, limitée de l’échantillon recueillie peut avoir un impact recherche que la quantité habituelle provenant de souris suffit pour qu’une seule mesure (en double ou triple exemplaire) à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Ainsi, échantillons de LCR sont habituellement mis en commun de plusieurs souris afin d’avoir suffisamment d’échantillon pour exécuter plusieurs tests. Élaboration d’un protocole pour les abondants, collection non contaminée du FSC provenant de souris est vivement souhaitée et sera bénéfique dans l’amélioration de la recherche en neurosciences à l’aide de rongeurs.
Dans ce protocole, une technique pour les abondantes (en moyenne 10-15 µL) collection de peste porcine classique chez des souris anesthésiés est décrit en détail et améliore sur une méthode actuellement connue de collection de CSF pour minimiser la contamination du sang,10. Un protocole robuste pour collection CSF facilitera le développement de dosages de biomarqueurs axée sur le CSF, qui pourrait être utilisé pour aider à diagnostiquer la maladie, en plus d’améliorer la recherche sur les mécanismes qui sous-tendent les maladies affectant le système nerveux central.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux politiques de la société des neurosciences (USA) et des comités d’éthique Fudan University (Shanghai, Chine). Cette procédure est pour une chirurgie sans survie.
1. installation d’appareils de Collection CSF
- Tirez le verre capillaire (diamètre intérieur 0,75 mm, diamètre extérieur 1,0 mm) en utilisant un micropipettes (comme le montre Liu et al. 10; affûtée capillaire est illustré dans la Figure 1).
- Place un verre affuté capillaire dans le capillaire support monté solidement sur un micromanipulateur (Figure 1 a).
- Casser l’extrémité du capillaire affuté avec une pince droite sous un microscope à dissection, afin que le diamètre intérieur de la pointe cassée est sur 10 à 20 µm (Figure 1).
- Fixez un tube mince et une seringue à l’autre extrémité du porte-capillaire et relier le tube mince et la seringue avec un robinet à trois voies.
- Changer le robinet à trois voies pour ouvrir et plonger la seringue à souffler de l’air de la seringue à travers la tubulure sur le verre capillaire d’expulser tous les contaminants et créer une pression positive dans le tube capillaire.
- Répétez ceci plusieurs fois par dis-connexion et re-connecter la seringue à la vanne trois voies et établissant la seringue ~ 100-200 µL avant le dernier rebranchement de la seringue avec le robinet à trois voies (Figure 1 b).
- Déplacer le micromanipulateur avec le verre capillaire sur le côté pour éviter tout dommage au cours de la dissection de la souris.
Figure 1. Microscope, micromanipulateur et installation capillaire. (A) Microscope et micromanipulateur capillaire jointe setup, ainsi qu’une image plus proche de (B) la seringue connecté et la vanne trois voies pour ouvrir (ci-contre) ou fermer la tuyauterie et (C) un ininterrompue (droit) et cassé (gauche) pointe capillaire prête pour la collecte de la CSF. Une fois cassé, l’extrémité du capillaire doit avoir un diamètre intérieur de 0,75 mm, diamètre extérieur de 1,0 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
2. Dissection de la souris
- Anesthésier la souris.
Remarque : pour ce protocole, C57BL/6 et amyloïde précurseur protéique/préséniline 1 (APP/PS1) transgéniques souris (modèle murin de la maladie d’Alzheimer) ont été utilisés et anesthésiés à l’hydrate de chloral de 4 % (en dH20) à 10 µL/g de poids de la souris par voie intrapéritonéale injection. - Lorsque complètement anesthésiés, veiller à ce que la souris est anesthésiée convenablement. La réponse de retrait à l’orteil pincée, en légère extension des membres postérieurs et vous pincer les doigts et je regarde pour une réponse de retrait, est réalisée afin d’assurer une anesthésie adéquate. Vérifier en pinçant toutes les quatre membres ; s’il n’y a aucune réaction de la souris est correctement anesthésiée. Couper et tailler les cheveux à l’arrière de la tête de la souris par dessus les yeux, entre les oreilles vers le bas de la nuque à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 2 a). Alternativement, tondeuses ou la crème dépilatoire peut être utilisée pour aider à l’épilation.
- Fixer la tête de la souris à l’aide d’un adaptateur de souris (l’arrière de la tête vers le haut avec le nez pointé vers le bas à ~ 45 °, Figure 2 a). Fixer les barres d’oreilles entre les oreilles et les yeux de la souris et serrer. Assurez-vous que la tête ne peut pas bouger et est attachée fermement dans l’adaptateur en appuyant doucement sur la tête de la souris.
- Revérifiez la réponse de retrait aux pieds pincée avant de faire l’incision chirurgicale et régulièrement par la suite pour assurer un plan chirurgical de l’anesthésie. Visuellement, Notez tout changement de la fréquence respiratoire au cours de la procédure pour indiquer les changements dans les plans de l’anesthésie. Une technique propre et non aseptiques, peut être utilisée pour cette chirurgie sans survie courte. À l’aide de ciseaux et pinces courbées, couper à travers la peau et la première couche de muscle jusqu'à ce que la base du crâne est exposée avec seulement une fine couche de muscle.
NOTE : Couper à travers la peau de souris à l’arrière du cou et couper la peau vers le bas au milieu du crâne entre les oreilles et les yeux de la souris. Peau et du tissu puis peuvent être tirés à part et hors de la zone au cours de la cisterna magna. - Alors que Regarde un à travers le microscope à dissection, disséquer attentivement loin le dernier minces couches de muscle sur la base du crâne à l’aide de pinces et déplacer ces couches de muscle sur le côté et hors de la zone d’intérêt. Si le saignement se produit, utiliser des cotons-tiges pour enlever et contribuer à faire cesser le saignement.
- Une fois que la dure-mère au fil de la cisterna magna est exposée (en forme de triangle avec habituellement 1-2 gros vaisseaux sanguins qui traversent la zone ; d’ou entre les vaisseaux sanguins est optimale pour une insertion capillaire et collection de CSF, Figure 2 b), utiliser un humide coton-tige pour nettoyer la membrane puis utilisez un coton-tige sec pour sécher la zone.
Figure 2. Une configuration souris et dissection avec des images représentatives d’insertion capillaire pour collection CSF. Le programme d’installation de souris prête pour l’extraction de la CSF avec (A) rasé tête fixée en place pour la dissection et (B) d’image (10 x avis) d’une souris disséquée dura couvrant la cisterna magna (flèche en pointillé indique un vaisseau sanguin qui traverse la région et flèche pleine montre zone optimale pour insertion capillaire). Images détaillées (vue de x 10) (C) affûté pointe de verre capillaire aligné contre dura de cisterna magna, (D) le point auquel le capillaire perforations presque la dura, avec une certaine résistance de la dure-mère et (E), la pointe capillaire taraudé par le biais de la dure-mère pour recueillir des CSF. CSF devrait être un liquide clair, recueilli dans le capillaire de verre (flèches en pointillés). Toutes les barres d’échelle en bas à droite de chaque image microscopique indiquent 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. CSF Collection de souris anesthésiée
- Alignez le capillaire de verre à l’arrière de la tête de la souris de sorte que le point affûté est juste derrière la membrane à un ~ angle de 30-45 ° (Figure 2).
- Plonger la seringue une fois ou quelques fois et établit la seringue ~ 100-200 µL (pour s’assurer il n’y a aucun contaminant et il y a une pression négative dans le verre capillaire).
- En utilisant le micromanipulateur, déplacer le capillaire incliner plus près de la membrane jusqu'à ce que la résistance peut être vu, mais ne pas percer il (Figure 2D).
- Une fois que la résistance est observée entre l’extrémité du capillaire et la membrane, Tapotez doucement le tube capillaire à travers la membrane en cognant sur les contrôles de micromanipulateur. Utiliser le microscope pour voir le point aiguisé de la ponction capillaire dans la cisterna magna. CSF devrait être tracée dans le tube capillaire automatiquement une fois que l’ouverture a été percé (Figure 2E).
- Laisser le tube capillaire pour recueillir lentement CSF. Si la CSF a arrêté faisant ressortir, dessiner la seringue vers le haut un peu lentement (~ 50 µL) pour créer une pression négative plus dans le capillaire pour extraire la CSF.
Remarque : Vous pouvez également le capillaire peut être doucement et lentement tiré hors du cerveau en utilisant les contrôles de micromanipulateur fine pour permettre le CSF s’écouler dans le tube capillaire à nouveau. Un montant total de ~ 10-15 µL de CSF (~ 3-4 cm dans le tube capillaire) prend ~ 10-30 min et parfois de 20 µL ou plus peuvent être collectées. Bien que pas absolument nécessaire, il est recommandé d’utiliser un coussin chauffant pendant la collecte de la CSF. Collection de la CSF a été réalisée à température ambiante (~ 23 ° C). - Une fois que le montant de CSF désirée est perçu, fermer le tube en déplaçant la vanne trois voies pour fermer (pour arrêter le dessin sur le LCR).
- Retirez la seringue reliée au tuyau et ouvrez puis fermez le tube (pour créer pression égalisée dans le capillaire, les tubes et la zone en dehors du capillaire). Reconnecter la seringue avec le robinet à trois voies, mais ne pas plonger la seringue.
- Retirez délicatement le capillaire de verre de la souris en utilisant le micromanipulateur.
- Placer le tube de prélèvement (microtubes de 1,5 mL avec 1 µL de 20 x inhibiteur de protéase) sous le point aiguisé du verre capillaire.
- Ouvrir le tube et plonger doucement la seringue : le CSF devrait s’écouler hors du capillaire et dans le tube de prélèvement.
- Après le prélèvement, rapidement centrifuger (impulsion de spin pour 5 s à vitesse maximale en utilisant une centrifugeuse minie) le CSF à mélanger l’échantillon avec l’inhibiteur de protéase au bas de la tube de prélèvement.
Remarque : Les échantillons de LCR peuvent être aliquotés et ensuite stockées pour une analyse ultérieure à-80 ° C. Le reste de la souris peut être disséqué pour les autres tissus, tels que le cerveau et la moelle épinière. La souris est toujours vivante à ce stade et donc sang peut également être collecté, si nécessaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilisant la procédure décrite ici (Figure 1 et Figure 2), la CSF immédiatement recueilli dans le tube capillaire doit être transparent (Figure 2E), pas rose ou rouge. S’il y a une rose à la teinte rouge vers le liquide recueilli dans le tube capillaire, puis il y a eu contamination par le sang.
Comme un exemple de l’application de l’échantillon de CSF recueillies grâce à cette méthode, les niveaux de la protéine bêta-amyloïde (Aß) a été mesurée à l’aide d’ELISA. Niveaux de bêta-amyloïdes dans le LCR se mesure généralement en recherche sur la maladie d’Alzheimer7. CSF est le plus souvent sans protéines. Dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer (souris APP/PS1), niveaux d’humain Aβ42 augmentent considérablement, comme ces souris surexpriment APP humaine. Ceci peut être observé avec les échantillons de LCR prélevés chez des souris de 12 mois selon les méthodes décrites ici (0 pg/mL dans le LCR des souris de type sauvage (WT) par rapport à 1 303 pg/mL chez les souris de la CSF de APP/PS1, Figure 3).
Figure 3. Les résultats représentatifs pour l’échantillon de CSF recueillies. L’analyse de l’échantillon de CSF ELISA recueillies. Dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer (APP/PS1), il y a une augmentation significative des niveaux de humaine Aβ42 dans le LCR, comme ces souris surexpriment humaine Aβ42 (1 303 pg/mL). Dans le type sauvage (WT) souris là devraient être aucun humain Aβ42 détectés (0 pg/mL). Un non-appariés t-test a été utilisé pour mesurer l’importance, ** p < 0,01, barres d’erreur représentées sous la forme SEM, n = souris 3 et 4 à 12 mois, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore le cours méthodes10 collection CSF pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du CSF (en moyenne ~ 10-15 µL peuvent être obtenues) de souris. Lors de la rupture de la pointe capillaire, l’extrémité du capillaire ne doit pas être trop petite (comme à l’époque le CSF sera extrait de très lentement) ou trop gros (sera ne pas assez pour recueillir le CSF fine et tissus peuvent se loger dans le tube capillaire). Il faut veiller en disséquant la zone pour la collecte de CSF : tout saignement doit être arrêté et nettoyé de la zone d’insertion du verre capillaire du sang avec dH20 pour éviter la contamination de l’échantillon. L’anatomie de chaque souris est différent, mais la plupart des souris ont 1-2 principaux vaisseaux sanguins qui traversent la zone où le capillaire doit être inséré pour la collecte de la CSF. Choisir que le bon endroit pour l’insertion du capillaire est important, que l’insertion trop près de gros vaisseaux sanguins finira par contaminer le CSF avec du sang. Tel qu’illustré à la Figure 2, une zone claire de vaisseaux sanguins, par exemple dans les rapports entre ou un côté ou l’autre des principaux vaisseaux sanguins, est optimale pour l’insertion capillaire éviter la contamination. Si la CSF ne coule pas dehors à un rythme régulier et s’arrête après un certain temps, tirant un peu de la seringue (~ 50 µL) peut aider à relancer la circulation du LCR dans le capillaire. Alternativement, le capillaire elle-même peut être déplacé doucement et lentement dans ou hors de la souris avec le micromanipulateur pour redémarrer le débit d’extraction de la CSF. Il faut quand faire ces étapes que le sang puisse circuler dans le capillaire ainsi. Cette technique fonctionne bien en raison des différences de pression du cerveau et verre capillaire de faire ressortir la CSF de la souris. Ainsi, la souris peut seulement être perforée une fois, comme après le capillaire est inséré dans la souris et sorti, il y a une perte de pression dans le cerveau et CSF ne pourront plus être aspiré par le capillaire automatiquement si il est réinséré. Donc, la pratique sera parfaire cette technique pour ne produire aucun contaminant de sang et obtenir adéquate collection CSF sur la première insertion du capillaire dans la souris (par expérience, souris pratique de 10-20 sera suffisant pour arriver à ce stade).
Ce protocole est une méthode améliorée et efficace pour l’extraction de CSF de souris et si fait correctement, réduit la contamination du sang (Figure 1, Figure 2, Figure 3). Cette technique est limitée par le temps pris par le CSF à collecter. Normalement, il faut 30 min pour recueillir ~ 15 µL ou plus du LCR à température ambiante (~ 23 ° C). Pendant ce temps, la souris peuvent être gardée au chaude avec coton hydrophile ou un mouchoir, mais sans couverture ou coussin chauffant, CSF peut toujours être correctement collecté. Ajout d’un coussin chauffant ou le réchauffement de la souris avant que la procédure peut améliorer cette technique en augmentant le flux du LCR dans le cerveau et réduire le temps nécessaire pour la collection, tel que décrit dans les autres méthodes10,11. Mais dans le protocole décrit ici, aucun bouillote ou le réchauffement de la souris a été utilisé et entre les souris, il n’y avait aucune difficulté d’un montant de CSF qui pourrait être recueilli. Comme un exemple de l’application,, que cette technique peut être utilisée, niveaux des humains Aβ42 ont été mesurés à l’aide d’ELISA. Aβ est connu pour être collante et peut adhérer au verre et les tubes de prélèvement. Dans ce protocole, les capillaires en verre borosilicate et tubes en polypropylène ont servi à rassembler la CSF de souris. Alors que certains Aβ peut coller à la vitre capillaire et les parois des tubes collection, ELISA résultats montrent que les niveaux de bêta-amyloïdes peuvent être mesurés (Figure 3). Néanmoins, il est possible que les concentrations de bêta-amyloïdes mesurées à partir du CSF recueilli dans le présent protocole sont inférieures que celle décrite par d’autres études, mais les capillaires en verre sont nécessaires pour percer à travers la dure-mère de la souris pour collecter la CSF. Outre mesure Aβ, autres protéines d’intérêt peuvent également être mesurés à l’aide de la CSF recueilli.
Alors que la méthode précédemment publiée de CSF collection par Liu et al. 10 visait pour la collecte permanente de peste porcine classique chez des souris vivantes, la méthode décrite ici est pour la collection de peste porcine classique chez des souris d’être sacrifié pour l’analyse et de prélèvement tissulaire. Ainsi, cette technique peut être utilisée ainsi que les autres méthodes de dissection pour la collection de tissus de souris car elle n’affecte pas le cerveau et la moelle épinière et après le prélèvement de la CSF (c.-à-d., après 10 à 30 min pour ~ 10-15 µL de LCR), la souris devrait toujours être respirant et sous anesthésie. Par conséquent, les autres tissus comme le sang, cerveau, moelle épinière et le foie sont encore viables pour la collecte et l’analyse biochimique. Bien que le Liu et al. méthode CSF recueillies très rapidement (10 min par souris pour 3-7 µL du LCR), la méthode décrite ici prend plus de temps mais peut s’accumuler plus de CSF10. Une autre méthode pour la collecte de la CSF a également été décrit par Maia et al. 11 les deux le Liu et al. et méthodes de Maia et coll. décrivent rassembler des CSF des souris par main-tenant capillaires en verre ou bouts de chargeur de gel et de perforer dans la cisterna magna. La méthode décrite ici se distingue par la fixation du capillaire à un micromanipulateur. Cela garantit que le capillaire est maintenu immobile et diminue la contamination du sang pendant la collecte de la CSF. Le micromanipulateur permet également une plus grande précision et d’exactitude en perforant la cisterna magna pour obtenir des CSF. Bien que la méthode de al Maia a également pu obtenir 15-20 µL du LCR par souris, il faut percer la cisterna magna à plusieurs reprises à la main avec des bouts de chargeur de gel, ce qui peut augmenter le risque de contamination du sang ou des tissus. En outre, la Maia et coll. méthode peut diminuer la pression dans le cerveau avec chaque perforation séquentielle de la cisterna magna afin qu’il y a moins CSF recueillies chaque fois. La méthode décrite ici n'implique qu’une seule ponction et en laissant le capillaire dans la magna de cisterna de collecter davantage CSF qu’il remplit avec le CSF, tandis que la souris est sous anesthésie. Ainsi, le protocole décrit ici en permanence recueille les CSF et réduit la contamination possible des ponctions répétées dans la cisterna magna, mais aussi les perturbations du tissu environnant.
Avec une plus grande collecte d’échantillons de CSF et pureté, des analyses plus peuvent être utilisés avec ce fluide à une aide supplémentaire dans la recherche en neurosciences. Il est bien connu parmi les chercheurs que la collection de peste porcine classique chez des souris peut être fastidieuse et seul un échantillon limité peut être obtenu (généralement exprimé comme un maximum de 5-7 µL6,7,8,9). Dans la littérature, il y a pas beaucoup des protocoles publiés pour l’extraction de la CSF et ce protocole améliore la méthode précédemment publiée10 pour minimiser la contamination du sang, tout en conservant l’abondante collection de CSF. CSF a de nombreuses applications dans la recherche en neurosciences et comme l’un des plus proches fluides dans les tissus du SNC, c’est un exemple précieux pour la recherche. Il a été précédemment identifié qu’une souris adulte a un volume total de 40 µL de CSF12. Ainsi, le présent protocole est en mesure d’obtenir 25 %, voire plus du montant total de peste porcine classique dans une souris adulte. Sans compter que les souris C57BL/6 et APP/PS1 souches consanguines, la souche non consanguine imprégnation de la région de contrôle (ICR) souris ont également servis à recueillir avec succès CSF utilisant ce protocole. CSF de souris de différents âges (4 à 18 mois) ont été rassemblée avec succès à l’aide de ce protocole. Ainsi, il ne devrait avoir aucune difficulté à recueillir CSF différentes souches ou âges de souris avec cette méthode. Ce protocole détaillé servira je l’espère par beaucoup pour améliorer le développement de tests de CSF et autres techniques d’analyse qui aide dans la recherche pour comprendre les maladies neurodégénératives qui affectent le cerveau et la moelle épinière.
Il est essentiel que la tête de la souris être fixée solidement, donc il ne bouge pas pendant la dissection et la collection de CSF (article 3 du protocole). Le site de la piqûre initiale dans la cisterna magna est important pour l’obtention de CSF abondante, non contaminé. Le capillaire ne devrait pas être inséré trop près des vaisseaux sanguins pour éviter la contamination de l’échantillon prélevé. En outre, ajustement du capillaire est critique pour la collection optimale de CSF. L’utilisation de la micromanipulateur permet pour un réglage sans grandement perturber le tissu environnant et contamine le CSF. En utilisant les commandes du micromanipulateur, le capillaire peut être lentement déplacé dedans ou dehors pour permettre CSF s’écoule de la souris et dans le capillaire pour collection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (81650110527, 81371400) et la National clé base Research Programme of China (2013CB530900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. , (2016).
- You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
