Summary
このプロトコルではない汚染血液から脳脊髄液 (CSF) の豊富なコレクションのための改善された技術について説明します。大きいサンプル コレクションと純度で、脳や脊髄に影響を与える病気の私達の理解を促進するため CSF を使用してより分析を実行できます。
Abstract
脳脊髄液 (CSF) は、神経科学研究の分析のための貴重な体液です。それは流体の 1 つは、最も身近な中枢神経系、したがって、これらの組織に直接アクセスしなくても脳や脊髄の病気の状態を分析する使用できます。ただし、マウス血管への近さのため槽から取得することは困難だ、これはしばしば、サンプルを汚染します。マウスにおける CSF コレクションのエリアもに解剖することは困難、(最大 5 7 μ l 以下) に頻繁にだけ小さいサンプルが得られます。このプロトコルは、血液からの汚染を最小限にし、(1 日平均 10-15 μ L を収集できる) CSF の豊富なコレクションは、コレクションの現在の方法を改善する技術を詳しく説明します。この手法は、CSF の抽出時に任意の組織は影響しません、マウスから組織の採取その他の郭清方法で使用できます。したがって、脳と脊髄をこの手法で受けず、そのまま。大きい CSF 標本と純度より分析はこのさらに流体援助神経科学研究で使用できるし、脳と脊髄に影響を与える疾患を理解します。
Introduction
脳脊髄液は神経科学研究の分析のための貴重な体液です。CSF (ない赤血球とだけいくつかの白い血液細胞) 数の細胞を含む血液の血漿から作られた主、ほとんどタンパク質無料します。中枢神経系 (CNS) と密接な接触で流体の一つだ、それは周辺システムに脳と脊髄からの多くの電解質渡すことができます。ヒトでは、CSF サンプル病の診断で支援するために収集することができますまたは臨床試験で研究目的のため脊髄をタップ (または腰椎穿刺) としてはマイナーな侵襲的なプロシージャ: CSF 流体は、これらに直接アクセスすることがなく中枢神経系に対する変更を反映できます組織。したがって、近年、診療所の研究目的のためアルツハイマー病や他の痴呆1,2,3などの神経変性疾患の患者から髄液のサンプルを得られています。潜在的クリニック2,3で病気の診断を支援するため髄液のサンプルを使用して開発している多くのバイオ マーカー分析があります。ただし、病4,5を具体的に診断する機密性の高い、一貫性のある結果を生成するこれらのアッセイの信頼性に関する多くの議論があります。だから、高い感度と特異性の神経変性疾患を診断する標準的な技術の生産を支援するより良いアッセイおよび CSF で見つけることができる、ターゲットの開発のための大きい必要があります。病気の人間の脳脊髄液サンプルの潜在的な重要性、神経科学研究の齧歯動物から CSF のコレクションも興味のです。
マウスは医学生物学の重要な動物のおよび潜在的な治療上の化合物とひと臨床試験の前に概念実証研究のテストを可能にします。マウスのそれは、小動物では、脳への近さのため髄液のサンプルを得ることが困難槽は、小脳と延髄の背側表面の開口部を介して取得するマウスにおける CSF コレクションの通常の方法は。これにより、難易度を分析することは困難は脳脊髄液サンプルを収集し、血液細胞からの汚染のリスクを増加させる、血管に近接。これらの難しさのためほとんどの研究者が分析 (通常 5-7 μ として記載) のため髄液の少量を取得できるだけで、血液細胞による CSF 試料の汚染分析6,7,8の最大の関心事,9. 血液汚染することができます結果を隠すし、本当に中枢神経系の状態を反映します。マウスから収集された量は、通常は (重複 3 通の) 1 つだけ測定のために十分に、限られたサンプルの収集研究を影響さらに、酵素免疫測定法 (ELISA) を使用します。したがって、脳脊髄液のサンプルは通常、十分なサンプルを複数のアッセイを実行するために複数のマウスからプールされます。豊富なプロトコルを開発、マウスから脳脊髄液の汚染されていないコレクション目的と大きくとげっ歯類を用いた神経科学研究の改善に有益になります。
このプロトコルでは、豊富な技術で (10-15 μ L の平均) 麻酔下マウスから CSF のコレクションで詳しく説明し、CSF コレクション血10からの汚染を最小限に抑えるための現在知られている方法の改善します。CSF のコレクションのための堅牢なプロトコルは、病を診断するに役立つだけでなく、中枢神経系に影響を与える疾患の根底にあるメカニズムに研究を向上させるために使用できるバイオ マーカーの CSF ベースの試金の開発に役立ちます。
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Protocol
すべての動物実験を神経科学 (アメリカ)、復旦大学 (中国・上海) 倫理委員会の学会の方針に基づき行った。この手順は、生存非手術です。
1. CSF コレクション装置のセットアップ
- ガラスの毛細管を引く (内径 0.75 mm、外径 1.0 mm) (劉らのように、マイクロ ピペットの引き手を使用10;シャープのキャピラリーは、図 1に示す)。
- マイクロマニピュレーター (図 1 a) にしっかりとマウントされている毛細血管のホルダーに尖ったガラスの場所。
- 解剖顕微鏡の下でまっすぐ鉗子で削ったキャピラリーの先端を破る壊れた先端の内側の直径が 10-20 μ m (図 1)。
- キャピラリーのホルダーの他の端に細いチューブと注射器を接続し、三方バルブと細いチューブと注射器を接続します。
- 開き、任意の汚染物質を追放し、キャピラリー チューブで肯定的な圧力を作成する毛細管ガラスに管を通して注射器から空気を吹き、シリンジを突入する三方弁をシフトします。
- これを数回投接続し再三方バルブにシリンジを接続し、注射器を策定によって繰り返し 〜 3 方向制御弁付き (図 1 b) 注射器の最後の再接続前に 100-200 μ L。
- ガラス管とマイクロマニピュレーターをマウス解剖時に損傷を防ぐために側に移動します。
図 1。顕微鏡、マイクロマニピュレーター、キャピラリー セットアップします。(A) 顕微鏡と接続されている毛細血管マイクロマニピュレーターをセットアップする (B) 像が近いだけでなく、接続されたシリンジと三方バルブを開き (図を参照) 閉じたり、配管、および (C) 切れ目のない (右)、(左) が壊れてキャピラリー先端 CSF コレクションの準備ができて。0.75 mm の内径、外径 1.0 mm. のキャピラリーの先端を持つ必要があります一度は壊れてこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
2. マウスの解剖
- マウスを麻酔します。
注: このプロトコル、C57BL/6、アミロイド前駆体タンパク質/プレセニリン 1 (アプリ/PS1) 形質転換のため (アルツハイマー病モデルマウス) マウスは使用され、4% 水クロラール (dH20) 腹腔内投与によるマウスの重量の 10 μ L/g で麻酔インジェクション。 - 完全に麻酔したときは、マウスが適切に麻酔したことを確認します。少し後肢を拡張する足の指をつまむと撤退の応答を見て、ピンチをつま先へ撤退の応答は、適切な麻酔を保証するために実行されます。すべての 4 つの手足をつまんでチェックします。反応がない場合、マウスは正しく麻酔します。カット、解剖はさみ (図 2 a) を使用して首の下へ耳の間、目の上からマウスの頭の後ろに髪の毛をトリミングします。また、バリカンまたは脱毛クリームは、脱毛で支援するために使用できます。
- マウスのアダプターを使用してマウスの頭部を固定 (背面に下向き鼻頭上向き 〜 45 °、図 2 a)。マウスの目、耳と耳のバーを固定・締付け。頭を移動できないアダプターで慎重にマウスの頭の上に押し下げてでしっかりと保護されてことを確認します。
- 外科的切開を行う前にピンチをつま先まで撤退応答を再確認し、定期的に麻酔外科平面を確保するためにその後。視覚的に麻酔の平面の変化に示す手順の中に呼吸の変更に注意してください。きれいな、非無菌技術は、この短い非生存の手術に使用できます。頭蓋底は筋肉の薄い層のみで公開されるまで、皮膚、筋肉の最初のレイヤー カットはさみとカーブタイプ鉗子を使用しています。
注: マウス皮膚を通して首の後ろ全体を切り取ってマウスの目、耳と頭蓋骨の真ん中、切り傷。皮膚や組織がする上に引っ張った離れて、領域外槽。 - 解剖顕微鏡を使って表示を離れて慎重に解剖最後薄い筋層鉗子を用いた頭蓋底の上、関心のある領域の内外側に筋肉のこれらの層を移動します。そこは出血している場合は、綿棒を使用して削除し、出血を止めるに役立ちます。
- 一度槽上硬膜を公開 (形は三角形で通常流れる; 1-2 大きな血管や血管の間のいずれかの側に最適です毛細管挿入および CSF コレクション、図 2 b)、ウェットを使用綿棒膜をきれいに拭くし、領域を乾燥する乾燥綿棒を使用します。
図 2。CSF コレクションの毛細管挿入の代表的な画像とマウスと郭清のセットアップ。マウス (A) 髄液抽出の準備ができてのセットアップ坊主頭の郭清と (B) の詳細についてカバー彎解剖マウス硬のイメージ (10 x ビュー) の場所に固定 (破線の矢印が流れる血管を示していて、実線の矢印を示していますエリア毛細管挿入に最適)。詳細画像 (10 x ビュー) (C) の槽、(D) ポイントを毛細血管ほとんど穴タップ硬膜および (E) キャピラリー先端からいくつかの抵抗で、硬膜の硬膜に対して並べガラス管の先端を削ったを通じて CSF を収集する硬。CSF は、ガラスの管 (点線矢印) で収集した透明な液体をする必要があります。各顕微鏡画像の右下にすべてのスケール バーを示す 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 麻酔下マウスから CSF コレクション
- 尖った点で膜のすぐ後ろには、マウスの頭の後ろにガラス管を合わせ、~ 30 ~ 45 ° 角度 (図 2)。
- 一度の注射器やいくつかの回し、注射器を策定 〜 (汚染物質がないと、毛細管ガラスに否定的な圧力があることを確かめる) を 100-200 μ L。
- 毛細血管を移動、マニピュレーターを使用して抵抗を見ることができるまで膜に近い方のヒントがありません (図 2 D) それの穴をあけます。
- 毛細血管の先端と膜の間に抵抗がわかれば優しくマイクロマニピュレーター コントロールをノックによって膜をキャピラリー チューブをタップします。顕微鏡を使用すると、大槽に毛細血管穿刺の削ったポイントを確認できます。開口部には穴を開けて一度はキャピラリー チューブに髄液を描画するかは自動的に (図 2 e)。
- ゆっくりと CSF を収集するために毛細血管を残します。CSF は、引き出しを停止している場合は少量を注射器の描画が遅い (~ 50 μ L) CSF を抽出すると毛細血管のより否定的な圧力を作成します。
注: 別の方法として、キャピラリー引っ張ることができる静かにゆっくりと微動マイクロマニピュレーター。 コントロールを使用して再び毛細血管に流れる脳脊髄液の脳。総額 ~ CSF の 10-15 μ L (~ キャピラリー中で 3-4 cm) かかる 〜 10 〜 30 分と時折 20 μ L 以上を集めることができます。全く必要のない、CSF コレクション中に熱パッドを使用することをお勧めします。室温で CSF コレクションを行った (~ 23 ° C)。 - 必要な CSF の量を収集した後は、(CSF を描画を停止) に三方弁をシフトすることによってチューブを閉じます。
- 管に接続されている注射器を取ると開くし、(キャピラリー、チューブ、キャピラリーの外側の領域でイコライズ圧力を作成する) にチューブを閉じます。三方バルブにシリンジを接続し、注射器を突入しません。
- 慎重マニピュレーターを使用してマウスからガラス管を取り外します。
- キャピラリー ガラスのシャープ ポイントの下でコレクションの管 (プロテアーゼ阻害剤 x 20 の 1 μ L で 1.5 mL マイクロ チューブ) を配置します。
- 管を開き、注射器をゆっくり突入: CSF は、キャピラリーとコレクションの管に流れる必要があります。
- コレクションの後すぐに遠心分離機 (5 のためのスピンをパルス ミニ遠心分離機を使用して最大速度で s) コレクションの管の下部にプロテアーゼ阻害剤とサンプルを混合する CSF。
注: CSF 試料検体でき、-80 ° C で詳しく分析するために格納されてマウスの残りの部分は、脳や脊髄などの他の組織の解剖することができます。マウスはこの段階ではまだ生きていると、このように血液収集することも、必要な場合。
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Representative Results
(図 1および図 2) ここで説明する手順を使用して、すぐに毛細血管で収集した CSF は、ピンクや赤ではなく、クリア (図 2 e) をする必要があります。毛細血管に収集流体に赤い色合いをピンク、血液の混入があった。
CSF のサンプルのアプリケーションの例は、このメソッドで収集された、elisa 法を用いたタンパク質のアミロイド β (a β) のレベルが測定されました。一般に脳脊髄液の a β のレベルはアルツハイマー病研究7で測定します。CSF は主蛋白質無料です。アルツハイマー病 (アプリ/PS1 マウス) のマウス モデルは、人間の a β42のレベルが大幅増加これらのマウス ノザン人間アプリ。これは、CSF (脳脊髄液 CSF のアプリ/PS1 マウス、図 31,303 pg/mL と比較して野生型 (WT) マウスの 0 pg/mL) ここで説明する方法を使用して 12 ヶ月齢マウスから収集のサンプルを観察できます。
図 3。CSF のサンプルの代表的な結果を収集します。ELISA による CSF のサンプルが収集されました。アルツハイマー病 (アプリ/PS1) のマウス モデルは、これらのマウスはノザン人間 a β42 (1,303 pg/mL) と人間 a β42 CSF 内のレベルの大幅な増加があります。野生型 (WT) でマウスがあるない人間 a β42検出 (0 pg/mL) をする必要があります。対になっていないt-テストされた意義を測るため * * p < 0.01、SEM、として表される誤差範囲 n = 3 と 4 のマウス生後 12 か月それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルを記述する詳細に CSF 血からの汚染を最小限に抑え、CSF の豊富なコレクションでは、コレクションの現在の方法10向上させる手法 (平均 ~ 10-15 μ L を得ることができる) マウスから。キャピラリーの先端は小さすぎる (と、脳脊髄液が抽出されます非常にゆっくり) ならない先端部にキャピラリーを壊すときや大きすぎる (脳脊髄液を集めるための罰金し、組織は、毛細血管に引っかかってができませんが)。CSF のコレクションのための領域に切り裂く場合に注意が必要: 任意の出血を停止し、dH2サンプルの汚染を避けるために 0 とは、血液からきれいにガラス管の挿入のための領域。各マウスの解剖学は、ほとんどのマウスが 1-2 主な血管は、毛細血管が CSF のコレクションに挿入する必要がある領域を介して実行しています。挿入に接近しすぎると、重要な毛細血管の挿入のための正しい場所を選択する主要な血管は血液と脳脊髄液を汚染します。図 2のように、血管との間や主要な血管のどちら側の明確な領域は汚染を避けるために毛細血管の挿入に最適です。脳脊髄液が流出しない安定した速度と停止でいくつかの時間後場合、は、少し注射器を描画 (~ 50 μ L) 毛細血管への脳脊髄液の流れを再起動することができます。また、キャピラリー自体移動できます静かにゆっくりとやマニピュレーターにマウスのうち髄液抽出の流れを再起動します。同様の毛細血管に流れることができる血としてこれらの手順を行うときに注意が必要があります。この手法は、脳マウスから CSF を引き出すガラスキャピラリから圧の違いも動作します。したがって、毛細血管をマウスに挿入し、取り出して、脳内の圧力の損失が、CSF は、もはや後に引き込まれる毛細血管自動的にそれが再度挿入された場合に、マウスがパンクのみすることができます一度。したがって、練習は血液汚染物質が生成されないと、マウスに毛細血管の最初の挿入に十分な CSF のコレクションを取得するこの手法を完成する (経験から 10-20 練習マウス十分になりますこの段階に到達する)。
このプロトコルはマウスから CSF を抽出するための改善と効率的な方法で、正しく行わ血 (図 1図 2図 3) からの汚染を最小限にできます。この手法は、収集する CSF の所要時間によって制限されます。通常は、30 分を収集する必要がある ~ 15 μ L 以上室温での CSF の (~ 23 ° C)。この時間の間にマウスが脱脂綿やティッシュ、暖かい保つことができるが、カバー、熱パッドなし CSF まだ正常に収集できます。熱パッドや手順が脳から脳脊髄液の流れを増やすことによってこの技術の向上し、他の方法10,11で説明するようにコレクションに必要な時間を短縮する前にマウスを温暖化の追加。しかし、ここで説明したプロトコルでない熱パッドやマウスの温暖化が使用され、マウス間は集めることができる脳脊髄液量難易度はなかった。この技術を使用できるアプリケーションの例として人間の a β42のレベルは、elisa 法を使用して測定されました。A β が粘着する、ガラスおよびコレクション チューブに付着することが。このプロトコルではホウケイ酸ガラス管、ポリプロピレン管はマウスから CSF を収集するために使用されました。いくつかの a β がガラス管と、管の壁に固執する、ELISA 結果 a β レベルをすることができることを示す (図 3) を測定しました。それにもかかわらず、それはこのプロトコルで収集した CSF から測定した a β レベルは他の研究によって説明されるよりも小さいが、ガラス管は CSF を収集するマウスの硬膜を穿刺する必要が可能性です。A β を測定する以外にも興味の他の蛋白質も収集 CSF を使用して測定することがことができます。
劉らによって CSF コレクションの以前に発行されたメソッドをしながら10は、ここで説明した方法は、組織の採取と分析のために犠牲にするマウスから CSF のコレクション、生きているマウスから脳脊髄液の継続的なコレクションのものだった。この手法がマウス組織コレクション他の郭清方法と共に使用することができます脳や脊髄に影響を与えないよう、CSF コレクション後したがって、(すなわちのための 10-30 分後 〜 CSF の 10-15 μ L)、マウスはまだ呼吸する必要があります、麻酔では。したがって、血液、脳、脊髄、肝臓などの他の組織はまだ実行可能なコレクションと生化学的解析のためです。ただし、劉らメソッドは、非常に迅速に (CSF 3 7 μ のマウスあたり 10 分) の CSF を収集する、ここで説明する方法長い時間がかかりますより多くの CSF10を集めることができます。CSF のコレクションのための別の方法は、マイアらが記載されています。11両方、劉らマイアらメソッド説明マウスから手ガラス管またはゲル ローダーのヒントと槽に穿刺 CSF を収集します。ここで説明した方法は、マイクロマニピュレーターと毛細血管を固定することによって異なります。これにより毛細血管が不動保持し、CSF コレクション中に血液からの汚染を減少させます。マニピュレーターは、脳脊髄液を取得する精度と槽を貫通で精度を向上できます。マイアらの方式は、CSF マウスあたりの 15-20 μ L を取得もできた、ゲル ローダー ヒントは、血液や組織からの汚染のリスクを高める可能性があります手で槽を繰り返し穿刺が必要です。さらに、マイアらの方式が各連続穴をあける彎症は少なくなりで脳圧を低下 CSF は、各時間を収集しました。ここで説明したメソッドには、1 つだけ穿刺し麻酔下マウスが脳脊髄液でそれを補充、さらに脳脊髄液を収集する槽で毛細血管を残してが含まれます。したがって、継続的にここで説明されているプロトコルは CSF を収集し、周囲の組織の破壊と同様、槽に繰り返し穿刺からの可能な汚染を最小限に抑えられます。
大きい CSF 標本と純度、神経科学の研究に役立つこの流体により分析を使用できます。それは、マウスから CSF のコレクション、退屈と唯一の研究者の間でよく知られている (通常 5-7 μ L6,7,8,9の最大値として記載) の限られたサンプルを得ることができます。本邦では髄液抽出の公開プロトコルの詳細の多くと CSF の豊富なコレクションを維持しながら、血液の汚染を最小限に抑えるために以前公開方法10にこのプロトコルを向上させます。CSF アプリケーションの多くを持っては、神経科学の研究で、中枢神経系の組織に最も近い流体の一つとして、研究のための貴重なサンプルです。以前ではアダルト マウスの CSF1240 μ L の容量が確認されました。したがって、このプロトコルは 25% そしておそらく成体マウスの CSF の合計より多くを取得することができます。交 C57BL/6 アプリ/PS1 マウスほかザイモグラムのひずみ制御領域 (ICR) を刷り込みマウスも使用されている正常にこのプロトコルを使用して CSF を収集します。さまざまな年齢層 (4 から 18 ヶ月) マウスから髄液は、このプロトコルを使用して正常に収集されています。したがって、この方法で異なる系統またはマウスの週齢から CSF を収集の難しさはないはずです。この詳細なプロトコルは、髄液と脳と脊髄に影響を与える神経変性疾患を理解する研究を支援するための他の分析手法の開発を改善するために多くの人にうまくいけば使用されます。
郭清および CSF コレクション (プロトコルのセクション 3) 中に動かないようにマウスの頭がしっかりと固定することが重要です。槽に初期パンクのサイトは豊富な非汚染の CSF を取得するため重要です。収集されたサンプルの汚染を避けるために、血管にキャピラリーを余りに近くに挿入しないように。さらに、毛細血管の調整が最適な CSF のコレクションにとって重要です。マニピュレーターの使用を大幅に周囲の組織を破壊し、脳脊髄液を汚染することがなく微調整できます。マニピュレーターの細かいコントロールを使用するキャピラリーゆっくり移動できますズームアウト CSF マウスから、コレクション用キャピラリーに流出するを許可します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国家自然科学基金、中国の (81650110527, 81371400) とキー基本的な研究プログラムの中国国家 (2013CB530900) によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
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