Summary
Denne protokol beskriver en reproducerbar og pålidelig metode til sublimation-baserede fremstilling af formalin faste væv bestemt til billedbehandling massespektrometri.
Abstract
Brug af matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri imaging (MALDI MSI) er blevet hurtigt udvidet, da denne teknik analyserer et væld af biomolekyler fra narkotika og lipider til N-glycans. Selvom forskellige prøve forberedelse teknikker findes, forbliver afsløre peptider fra formaldehyd bevaret væv en af de vanskeligste udfordringer for denne type af massespektrometriske analyse. Derfor har vi skabt og optimeret en robust metode, der bevarer den geografisk information indeholdt i prøven, mens fremkalde det største antal ionizable peptider. Vi har også sigtede på at opnå dette på en omkostningseffektiv og enkel måde, hvorved man undgår potentiel bias eller forberedelse fejl, som kan opstå, når du bruger automatiseret instrumentation. Slutresultatet er en reproducerbar og billig protokol.
Introduction
Matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri imaging (MALDI MSI) har været ansat som et billede baseret teknik for to årtier1,2, analysere en række biomolekyler herunder: lipider3, peptider2 ,4, proteiner2,5, metabolitter6,7, N-glycans8og syntetiske molekyler såsom terapeutiske lægemidler9,10. Antallet af publikationer påvise nytten af denne teknik er vokset betydeligt i det sidste årti6,11,12,13. Visse molekyler, såsom lipider, er relativt nemme at analysere via MALDI MSI, som de ionisere let på grund af deres kemiske karakter og dermed kræver lidt forudgående forberedelse3. Men for mere vanskelige mål såsom peptider, de nødvendige skridt til at effektivt ionisere disse molekyler er omfattende og generelt komplicerede14. Der er i øjeblikket meget få publikationer, der har til formål at adresse eller påvise reproducerbarhed i de metoder, der er ansat til at forberede denne unikke visuelle teknik15væv. Derfor har vi udarbejdet observationer og gennemført optimeringer i en enkelt, let at gennemføre, metode, der bør kræver lidt at ingen ændring, til analyse af peptider fra en formaldehyd tværbunden væv kilde14.
I dette manuskript har vi beskrevet en valideret, lave omkostninger reproducerbar metode til påvisning og geografisk kortlægning af peptider, genereret fra formalin-fast frosset (FFF) og formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) væv sektioner. Denne metode kræver eller stole på nogen specialiserede instrumentation3. Specifikt, vi tager fat på de mange aspekter af specialiserede prøveforberedelse nødvendigt at analysere peptider; trin som antigen hentning16 og matrix belægning. Vores protokol udnytter også billigt materiel og reagenser, hvilket gør denne metode tilgængelig for et bredere samfund, der ellers ville være afskåret fra råd til alternative robot apparater17.
Ræsonnementet bag udviklingen af præparationsmetode manuel prøve var to gange: for det første brug af en sublimator skaber en konsekvent og ensartet belægning af matrix krystaller, der er ~ 1 µm i længde18, noget uopnåeligt med mere fælles sprøjtning teknikker. For det andet, den relativt lille nedsat omkostninger: de samlede omkostninger af den brugerdefinerede apparater var <$ 1500 AUD. Vi bemærker med hensyn til omkostningseffektivitet, pris pr. prøve er langt billigere, når der er ingen robot maskiner involveret. Brugen af sublimation er blevet rapporteret tidligere, dog at bedste af vores viden, trinvise metoder, der beskriver denne proces og prøve forberedelse ikke har været rapporteret eller beskrevet i litteraturen.
Denne protokol er beregnet til at hjælpe forskere, der har adgang til en MALDI massespektrometer og der er opsat på at skabe geografisk information i forbindelse med en bio-molekyle af interesse19. I det væsentlige er MALDI MSI en form for histologiske screening at ikke stole på antistoffer eller pletter2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Advarsel: Alle gældende sikkerhedsforanstaltninger bør følges, når du udfører denne procedure, herunder anvendelse af passende personlige værnemidler (PPE) (fx lab frakker, nitrilhandsker, sikkerhedsbriller, osv.)
1. forberedelse af reagenser og udstyr
-
Forberedelse af løsninger
- For at forberede 500 mL Carnoys væske, blandes 100% ethanol (EtOH), kloroform og iseddike i en 6:3:1 v/v/v forhold i et rent glas Schott flaske.
- For at gøre flydende nitrocellulose (NC), opløses NC membran (almindeligt anvendt i western blotting) i pæn acetone, ved blid agitation, til en slutkoncentration på 40 mg/mL.
-
Forberedelse af NC belagt dias
- Brug en teknik svarende til den, der anvendes til fremstilling af blod udstrygningspræparater for histologisk undersøgelse20 at forberede NC belagt dias.
- Der afpipetteres 40 µL af flydende NC på kanten af objektglas en ledende indium-tin oxider (ITO). Ved hjælp af en regelmæssig glas objektglas, træk NC under overfladespænding på tværs af diaset og oprette en selv tynd film belægning.
- Tillad NC tørre ved stuetemperatur til 20 s og derefter butikken indtil det skal bruges ved stuetemperatur. Opbevaring af prøver under disse betingelser kan være ubestemt forudsat væv vedligeholdes og fri for støv.
Bemærk: Denne metode til forberedelse er bedre kendt som "tynd film" og vil producere en ensartet belægning, der bygger på NC viskositet samt dens mangel på overfladespænding til selv-niveau på diaset. Den eneste pleje der skal træffes, når forberedelse dias ikke er bevæger sig for hurtigt, som vil skabe striber af NC snarere end en komplet dækning.
Forsigtig: Som flydende NC tørrer meget hurtigt, det er vigtigt at arbejde hurtigt for at undgå udtørring af løsning, før den er blevet korrekt spredt. Også bør udvises forsigtighed ved håndtering af NC i den flydende tilstand, da det er en meget energisk sammensatte og ikke bør kontakte en kilden til tændingen at forhindre brandbomber eksplosion. NC gennemgår også endoterm overgange når tørring og kan forårsage kolde forbrændinger hvis lov til at komme i langvarig berøring med huden eller behandskede hænder. For at minimere alle dermed forbundne risici, kun små mængder bør være forberedt på hver gang (< 1 mL anbefales). Når tør er det stabilt ved stuetemperatur. NC kan dog fortsat eksplosive, når de findes i store mængder.
-
Oprettelse af brugerdefinerede vapor kamre
- Skære et stykke af tyk trækpapir med en saks stor nok til at passe nederst halvdel af en standard plastic petriskål (94 mm i diameter og 3 mm tyk).
- Klippe papir, forlader en rektangulær stribe i midten, samme størrelse som et objektglas, forlader nok overskydende, så papiret vil fastholde sin position i petriskål (tillægs figur 1).
2. forberedelse af væv sektioner
-
FFPE væv21.
- Vælg den ønskede væv blok og del det på 12 µm tykkelse i en standard bænk monteret mikrotomen og float montere på NC overfladebelagt ITO dias.
- Dykke dias i frisk xylen til at fjerne resterende paraffin i 2 min., og Gentag handlingen en anden gang.
Bemærk: Hvis paraffin blok er især udbredt eller væv er relativt små i forhold til paraffin blok, prøverne kan opvarmes ved 60 ° C til at smelte fleste væk før vask i xylen. - Vaske de deparaffinized prøver af nedsænkning dias i en gradueret opløsningsmiddel serie: 70% v/v EtOH/vand, 100% EtOH, Carnoys væske, 100% EtOH, ultra rent vand og 100% EtOH. Varigheden af hver nedsænkningen skal være 30 s, undtagen Carnoys væske, som skal vare 2 min.
Forsigtig: Carnoys væske og xylen skal opbevares og anvendes i et stinkskab, da de er meget giftig ved indånding.
-
Formalin-fast frosset (FFF) væv
Bemærk: Prøver bør allerede være frosne, passende ifølge prøvetypen.- Reagensglasset væv blok på driftstemperaturen af mikrotom for 20 min22.
Bemærk: Ækvilibrering temperatur er afhængig af typen af væv. - Afsnit væv ved hjælp af en mikrotom på 12 µm og tø mount sektioner på en forberedte NC belagt ITO slide.
- Gemme diasene i et vakuum ekssikkator på bænken i mørke.
Bemærk: Prøver kan opbevares i flere uger under disse betingelser. - Vask prøver i en gradueret opløsningsmiddel serie som anført for FFPE væv (2.1.3).
Bemærk: Der er ikke behov for en xylen deparaffinisation skridt som prøven ikke er integreret.
- Reagensglasset væv blok på driftstemperaturen af mikrotom for 20 min22.
3. methylen bitmapgenkendelse hydrolyse
- Læg prøven dias (enten FFF eller FFPE) i en plast slide boks, som er fyldt til toppen med 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Forsegle boksen og anbringes i et vandbad, der indeholder 500 mL vand, giver mulighed for at røre bunden. Derefter varme det i 15 min. ved 120 ° C i en trykkoger, som kan opnå et driftstryk på 70 kPa.
- Fjern dias, tillade dem at køle, og lad dem tørre ved omgivende temperatur i 15 min.
4. væv fordøjelsen
- Når hydrolyseret, frakke prøver med 10 µL af trypsin løsning (1 mg/mL) i ultra-rene vand, af pipettering 10 µL af opløsningen på kanten af afsnittet væv, derefter ved hjælp af samme pipette spidsen, trække slipværktøjet over hele overfladen af vævet under overfladen spænding.
Bemærk: Undgå at ridse væv overfladen med pipette spids og over sprede enzym ud over grænserne af væv kanter. - Tillad prøver at tørre ved omgivelsestemperatur.
- Når tør, montere prøver inde i toppen af den tidligere beregnede vapor afdeling (væv vender nedad) med autoklave tape på enten kanten af dias (tillægs figur 2).
- Der afpipetteres 600 µL af en opløsning med en 1:1 v/v blanding af 100% acetonitril og 50 mM ammoniumbicarbonat omhyggeligt på trækpapir finger i den nederste del af petriskålen indtil fingeren synes at være jævnt våd.
- Placer den øverste halvdel af vapor afdeling på bunden halvdelen at sikre papir finger og prøve slide justeres perfekt, og forsegle kammeret omkring dens ækvator med paraffin film.
- Lad prøven natten over i et 37 ° C inkubator tillade komplet fordøjelsen.
5. matrix belægning via sublimering
- Når fordøjet, veje eksempeldias på et 5-cifret microanalytical balance.
- Mount diaset på køling fingeren til sublimation apparatet og Fastgør det med kobber tape, på samme måde som beskrevet for vapor afdeling (supplerende figur 3).
Bemærk: For at sørge for at diasset er kontaktet jævnt af den afkøling finger, et lag af kobber tape er placeret i bunden af den afkøling finger at udjævne overfladen. Dette sikrer, at diaset jævnt er afkølet, hvilket fører til selv aflejring af matrix. - Placere 300 mg af α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) matrix i et glas petriskål nederst i salen og spredes jævnt til at oprette et tyndt lag af matrix krystaller.
- Samle sublimator og sikre de to halvdele med hestesko klemme. Suspendere den forsamlede enhed 15-20 cm over en sand bad, forvarmes ved 220 ° C, ved at placere det i en metalring, der er tilsluttet en retorten stå.
- Tilsluttes vakuumkilde salen, engagere sig i vakuum, og gør det muligt at stabilisere ned til ~ 25 mTorr i 5 min.
- Pak den svalende finger til toppen med is og tilsættes 50 mL vand. Tillad apparatet til at nøjes med en yderligere 5 min før du fortsætter.
- Lavere kammer på overfladen af sand, sikring af sandet helt kontakter i bunden af kammeret, og overlade det til 45 min til at oprette en ideel belægning af 0,22 mg/cm2
Forsigtig: Bør udvises forsigtighed ved håndtering af glas på høj vakuum, som skader på apparatet, mens evakueret, kan resultere i katastrofale svigt af glas kammer. - Efter 45 min, fjerne salen fra sand badet ved at hæve metal ringen og afløb for sal.
Bemærk: Når kammeret har været udluftning, diaset skal fjernes meget hurtigt som vand i luften vil begynde at kondensere på indefrysning finger og prøve diaset. - Fjern diasset og vejer den for at sikre den ønskede belægning er opnået.
Bemærk: Hvis ikke tilstrækkelig belægning er opnået, blot gentage sublimation proces slide indtil den ønskede lag tykkelse er opnået.
6. omkrystallisering
- Når sublimeret, montere eksempeldias inde i top for tidligere beregnede vapor afdeling, som beskrevet tidligere (væv vender nedad).
- Der afpipetteres 600 µL af en opløsning med en 1:1 (v/v) blanding af 100% acetonitril og 0,1% v/v trifluoreddikesyre i vand omhyggeligt på trækpapir i den nederste del af petriskål til at sikre en endnu belægning.
- Samle salen, sikre papir under fanen og mikroskop slide justeres perfekt, og forlader i et 37 ° C inkubator for 1 h.
Forsigtig: Ikke forsegle salen.
Bemærk: Når recrystallized, normalt gul nuance af matrixen skal ændres til hvid, ser mindre skinnende og vises meget selv. Dette indikerer, at omkrystallisering er udført korrekt. - Prøven er nu klar til analyse.
7. instrumentering
- Scanne dias i en flatbed-scanner til at oprette et digitalt billede.
- Læg prøven i den massespektrometer og derefter analysere ved hjælp af passende softwareplatform.
- Analysere prøverne i positiv ion reflectron tilstand med en massiv vifte af 750-3500 Da, med spot-opløsning, der gælder for det ønskede resultat. I de fleste tilfælde 20-50 µm raster bredde er tilstrækkelig, men så lidt som 10 µm kan være brugt15.
Forsigtig: MALDI UV lasere er en kilde til ioniserende stråling og skal ikke ses direkte. Sikre, at laseren er indeholdt i instrument afskærmning før operation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis fulgt korrekt, producerer denne protokol billeder, der tydeligt repræsenterer brutto morfologi af væv uden nogen ridser eller andre deformationer (figur 1). Den ideelle validering for et korrekt udført prøveforberedelse, er evnen til at skelne mellem forskellige fysiske strukturer ved at ændre det molekyle, der har set på (figur 2).
En god guide til at bestemme hvis prøver har udarbejdet forkert er at kontrollere, om tilstedeværelsen af virksomhedsflytninger eller matrix sammenlægning; peptid underskrifter, der strækker sig ud over den fysiske væv grænser er perfekt indikatorer, at molekyler har flyttet under forberedelse af prøver. Dette er forklaret i detaljer i O'Rourke og Padula (2017)15.
Producerede peptid spektrum bør indeholde en høj overflod af diskrete molekyler, som er godt fordelt på tværs af de valgte masseinterval1,23 (dette er i vid udstrækning prøve afhængige, men det er ikke usædvanligt at se mere end 50 diskrete peptid underskrifter fra FFPE væv) (figur 3)18.
Figur 1 : En korrekt forbehandlede prøve af FFF menneskelige hjernevæv. Forarbejdede tissue modellen har været afbildet på 50 µm og viser god makro struktur og en tydelig forskel mellem hvide substans (WM) og grå materie (GM). Med held rede prøver vil vise klar differentiering af forskellige væv steder. Her er der en klar region i up-regulering af peptid (repræsenteret af masse til ladning forhold, M/Z) 1085 i regionen WM i panelet A. differentiering fremgår yderligere af manglen på definerede figuren i panelet B efterfulgt af sin tilbagevenden i panelet C. Af boltpistoler fordelingen af tre forskellige molekyler på afsnittet samme væv og viser, at nogle er ensartet fordelt, mens andre er begrænset til diskrete fysiske lokationer, kan vi se, at prøveforberedelsen er udført korrekt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : En forkert rede del af FFF menneskelige hjernevæv. Dette eksemplar har været afbildet på 50 µm, men viser et omfattende virksomhedsflytninger. Mønstre af de nuværende på tværs af paneler 1, 2 og 3 molekyler klart viser, at i modsætning til figur 1, der er ingen klar definition mellem biologiske regioner eller forskelle i overflod af molekylerne vises. Da billederne er de samme, uanset de molekyler, der er valgt til visning, kan vi konkludere, at det har været delocalized på grund af forberedes forkert. Da dette er hjernevæv, gør dette resultat ikke logisk, biologisk forstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Den globale masse spektrum af et billede, vises i Figur 1. Spektret indeholder et væld af peptid signaturer i hele den nedre ende af masseinterval med adskillige høje masse peptid toppe nuværende så godt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1 : Skematisk for skæring trækpapir bruges i vapor afdeling. Tyk trækpapir er skåret i en cirkulær form med en diameter på 94 mm. En rektangulær fane er også skåret ud til at svare på størrelse med en standard glas objektglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2 : Samling skematisk af vapor afdeling. Dette diagram viser, hvordan vapor afdeling skal samles med specifikke note af hvordan prøven dias, trækpapir og selvklæbende tape svarer med hinanden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3 : Skematisk af sublimering kammer forsamling: Denne figur viser, hvordan eksempeldias, sublimator og opvarmning apparater er arrangeret at tillade reproducerbare sublimation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol blev designet til at maksimere generation af ionizable molekylære arter samtidig fjerne delokaliseringen af analysander. Nøglefaktorerne inddrage ved hjælp af den samme overordnede princip, når du anvender matrix, fordøje prøven, eller recrystallizing efter sublimering24; nemlig, at en selv aflejring af dampe, matrix eller andet, der skal oprettes og vedligeholdes. Pipettering opløsningsmiddel vasker for omkrystallisering og fordøjelse, jævnt under prøven, forhindrer enhver individuel området modtager mere solvente vapor end noget andet sted. Dette er vigtigt for at forhindre dannelsen af synlige kondens og samlede hæmmer delokaliseringen af overflade molekyler samt sikre, at prøven er jævnt fordøjet og recrystallized. Det er bydende nødvendigt at opnå en selv aflejring af matrix, som for lidt vil vise en relativt lav intensitet og mangfoldighed af arter, og for meget vil undertrykke ioner fra prøven, også sænke intensiteten og mangfoldighed af arter25. For at opnå en selv aflejring af matrix, sikre at en selv, tynde lag af matrix krystaller af en homogen størrelse, er placeret direkte under fodaftryk af de suspenderede objektglas. Hvis laget er ujævn eller for tynd, så sublimering af matrix vil fortsætte for langsomt eller bliver ujævn26. Muligheden problemer med manuel påføring af opløsningsmiddel og enzym kommer ned til den individuelle oplevelse for brugeren. Vis grad af "praksis" er nødvendig for at sikre en gentagelig resultat, og der kan være nogle indledende utilsigtet forkert forberedelse. Men hvis pleje er taget til at sikre, at det endelige billede er i overensstemmelse med egenskaberne for den "gode" prøve vi har givet, så enhver forkert rede prøver ikke vil føre til falske biologiske konklusioner.
For at effektivt fordøje en vævsprøve, bevaret i formaldehyd (FFPE eller FFF), er det vigtigt at fjerne så mange af methylen krydsbindinger som muligt før trypsin deposition16. Dette opnås nemt ved at opvarme prøven i en trykkoger på > 100 ° C, for en kort varighed, uden faktisk forårsager bobler, der mekanisk kan tage prøven. Væv kan let gå tabt, når behandlet på en sådan måde, så for at bekæmpe dette, NC dias er ansat. Mens ikke kritisk, sikrer den prøven, når de udsættes for varme, tryk og organisk opløsningsmiddel fysiske integritet. Fordøjelsen af prøven er derefter opnås ved at anvende enzymet i en tilstand, der forhindrer dens aktivering og derefter at lade det tørre, dvs suspenderet i ultra-rene vand. Vapor afdeling derefter følger samme princip som omkrystallisering, giver nok et fugtigt miljø til at muliggøre lokaliserede enzym til at støde og kløver protein rygraden, men ikke nok "væde" at tillade de resulterende peptider til at glide væsentligt fra deres oprindelige placering26. Pipettering direkte på diaset vil ikke delocalize nogen overflade analysander, på grund af virkningerne af resterende crosslinking og den generelle kan store proteiner i vand.
Selv om vi har fokuseret på anvendelsen af denne metode til peptider, kan det lige så nemt anvendes til arbejdsprocesser til analyse af metabolitter, lipider og intakt proteiner. Nogle trin vil være nødvendigt at blive fjernet eller augmented; intakt protein imaging kræver ikke nogen proteolytiske kavalergang trin, men den grundlæggende workflow af prøven skæring og montering efterfulgt af matrix sublimering, omkrystallisering og analyse kan anvendes til næsten enhver prøvetypen. Vores hensigt for at udvikle denne protokol og sikre dets pålidelighed og robusthed gennem omfattende empiriske undersøgelser, var at skabe en metode, der kræver lidt eller ingen ændring, der bruger billig udstyr, og er åbne over for en bred Fællesskabet med varierende grader af instrumentering og biokemiske færdighed. Vi håber, at dette åbner nye veje til undersøgelse af laboratorier, der ville have ellers afvist denne teknik som alt for kompliceret eller dyrt. Vi er også overbeviste om, at vi har givet den første endelige prøve forberedelse metode for peptid MSI. Samtidig med at skrive har de fleste metoder været stort set instrumentation-baseret, med særlig vægt på brugervenlighed af robot sprøjtning baseret metoder27,28,29. Der har også været lidt i vejen for pålidelig methylen hydrolyse metoder med formodninger om den korrekte procedure og apparater skal anvendes.
Afslutningsvis mener vi, at anvendelsen af den ovenfor metode til FFPE og FFF væv, vil resultere i større tillid til effektiviteten af MSI til analyse af peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt eller kommercielle interesse at videregive
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den Sydney Medical School Foundation og Blues og fundament til finansiering af en del af dette arbejde gennem deres ph.d.-stipendium program for Alzheimers sygdom forskning og en ARC Discovery tilskud (DP160102063) tildeles ULRIKS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- O'Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
