Summary
Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.
Abstract
Het gebruik van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie, Spectrometrie van de massa (MALDI MSI) imaging is snel uitgebreid, aangezien deze techniek een schare van biomoleculen van drugs en lipiden aan N-glycanen analyseert. Hoewel verschillende monster voorbereiding technieken bestaan, blijft opsporen van peptiden van formaldehyde weefsels bewaard een van de moeilijkste uitdagingen voor dit soort massaspectrometrische analyse. Om deze reden hebben we gemaakt en geoptimaliseerd een robuuste methodologie, die de ruimtelijke gegevens die deel uitmaakt van het monster, terwijl het opwekken van het grootste aantal ioniseerbare peptiden behouden blijven. We hebben er ook op gericht om dit te bereiken in een voordelige en eenvoudige manier, zodat er geen potentiële bias of het preparaat fout, die zich voordoen kan wanneer met behulp van instrumentatie geautomatiseerde. Het eindresultaat is een reproduceerbare en goedkope protocol.
Introduction
Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI MSI) heeft gewerkt als een beeld gebaseerde techniek voor twee decennia1,2, analyseren van een aantal biomoleculen inclusief: lipiden3, peptiden2 ,4, eiwitten2,5, metabolieten6,7, N-glycanen8en synthetische moleculen zoals therapeutische drugs9,10. Het aantal publicaties aan te tonen het nut van deze techniek zijn de afgelopen tien jaar6,11,12,13aanzienlijk toegenomen. Bepaalde moleculen, zoals lipiden, zijn relatief eenvoudig te analyseren via MALDI MSI, zoals zij gemakkelijk te als gevolg van de chemische aard ioniseren en dus weinig voorafgaande voorbereiding3 vereisen. Voor moeilijker doelen zoals peptiden zijn de stappen die nodig zijn om effectief deze moleculen ioniseren echter uitgebreid en over het algemeen ingewikkeld14. Momenteel zijn er weinig publicaties die gericht zijn op adres of aantonen van reproduceerbaarheid in de methodologieën die werkzaam zijn voor te bereiden op weefsel deze unieke visuele techniek15. Om deze reden hebben we samengesteld van opmerkingen en geïmplementeerd optimalisaties in één eenvoudig te implementeren, methodologie die weinig tot geen wijziging, voor de analyse van peptides van een formaldehyde moet kruiselings gekoppelde weefsel bron14.
In dit manuscript, hebben we een gevalideerde, low-cost reproduceerbare methodologie voor de detectie en ruimtelijke toewijzing van peptides, gegenereerd op basis van formaline-vaste bevroren (FFF) en formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties beschreven. Deze methodologie niet vereisen of vertrouwen op een gespecialiseerde instrumentatie-3. Specifiek, ingaan we op de vele aspecten van gespecialiseerde monstervoorbereiding noodzakelijk om te analyseren van peptiden; stappen zoals antigeen ophalen16 en matrix coating. Ons protocol maakt ook gebruik van goedkope apparatuur en reagentia, waardoor deze methode toegankelijk te maken voor een bredere gemeenschap die anders zouden kunnen veroorloven de alternatieve robotic apparaat17.
De redenering achter de ontwikkeling van een handmatige monster voorbereiding methode was tweeledig: ten eerste, het gebruik van een sublimator maakt een coherente en homogene deklaag van kristallen van de matrix die ~ 1 µm in lengte18, iets niet haalbaar met de gemeenschappelijkere spuiten technieken. Ten tweede, de relatief kleine set-up kosten: de totale kosten van de aangepaste apparatuur was <$ 1500 AUD. Wij stellen vast, in termen van kosteneffectiviteit, dat de prijs per monster is veel goedkoper als er geen robotachtige machines betrokken. Het gebruik van sublimatie is gemeld eerder, echter tot de beste van onze kennis, stapsgewijze methodologieën die dit proces beschrijven en proef de voorbereiding hebben niet gemeld noch in de literatuur beschreven.
Dit protocol is bedoeld om te helpen van onderzoekers die beschikken over een MALDI-massaspectrometer en wie zijn bedoeling op het genereren van ruimtelijke informatie met betrekking tot een bio-molecule van belang19. In wezen, is MALDI MSI een vorm van histologische screening die niet afhankelijk is van antilichamen of vlekken2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Alle toepasselijke veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het uitvoeren van deze procedure, met inbegrip van het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (bijvoorbeeld Labjassen, nitril handschoenen, veiligheidsbril, enz.)
1. bereiding van reagentia en apparatuur
-
Bereiding van de oplossingen
- Ter voorbereiding Carnoy van fluid 500 mL, meng 100% ethanol (EtOH), chloroform en ijsazijn in een 6:3:1 v/v/v-verhouding in een schone fles Schott.
- Los te maken van vloeibare nitrocellulose (NC), NC membraan (gewoonlijk gebruikt in het westelijke bevlekken) in nette aceton, door zachte agitatie, om een eindconcentratie van 40 mg/mL.
-
Voorbereiding van NC bedekt dia 's
- Gebruik een soortgelijk aan die wordt gebruikt voor de bereiding van bloed techniek uitstrijkjes voor histopathologisch onderzoek20 te bereiden NC bedekt dia's.
- Pipetteer 40 µL van vloeibare NC op een van de randen van een geleidende indium tin oxide (ITO) microscoopglaasje. Met behulp van een regelmatige glasplaatje Microscoop, Sleep de NC onder oppervlaktespanning over de dia maken een gelijkmatige, dunne film-coating.
- Laat de NC te drogen bij kamertemperatuur voor 20 s en vervolgens winkel totdat het nodig is bij kamertemperatuur. Opslag van de monsters onder deze omstandigheden kan onbeperkt zijn, mits de weefsels worden onderhouden en vrij van stof.
Opmerking: Deze methode van voorbereiding is beter bekend als "thin film" en een uniforme coating die is afhankelijk van de viscositeit van de NC, evenals haar gebrek aan oppervlaktespanning tot zelf niveau op de dia zal produceren. De enige zorg die moet worden gehouden bij het voorbereiden van de dia's is niet bewegen te snel, die tot strepen van NC in plaats van een volledige dekking leiden zal.
Let op: Zoals vloeibare NC zeer snel droogt, is het essentieel om te snel te werken om te voorkomen dat de oplossing drogen voordat het goed verspreid. Bij behandeling van NC in zijn vloeibare toestand, als het is een zeer energieke verbinding en moet geen contact op met een bron van ontsteking om te voorkomen dat brandbommen explosie moet ook zorg worden gehouden. NC ondergaat ook endotherme overgangen wanneer drogen en koude brandwonden veroorzaken kan als toegestaan om in langdurig contact met de huid of gehandschoende handen te komen. Te minimaliseren alle bijbehorende risico's, alleen kleine hoeveelheden moeten worden voorbereid op elk tijdstip (< 1 mL wordt aanbevolen). Eenmaal droog is het stabiel bij kamertemperatuur. NC kan blijven echter Ontploffingsgevaar bij in grote hoeveelheden aanwezig.
-
Creatie van aangepaste damp kamers
- Knip een stukje van dikke vloeipapier met een schaar groot genoeg voor de onderste helft van een standaard plastic petrischaal (94 mm in diameter en 3 mm dik).
- Snijdt u het papier, verlaten van een rechthoekig strip in het midden, dezelfde grootte als een microscoopglaasje, genoeg overtollige verlaten zodat het papier haar positie in de petrischaal (aanvullende figuur 1 blijft).
2. voorbereiding van weefselsecties
-
FFPE weefsel21.
- Selecteer de gewenste weefsel blok en de sectie op 12 µm-dikte in een standaard Bank gemonteerde microtoom en float mount op de NC vooraf gecoat ITO dia's.
- Onderdompelen van de dia's in verse xyleen te verwijderen van de resterende paraffine gedurende 2 minuten, en herhaal de handeling een tweede keer.
Opmerking: Als het blok van paraffine vooral alomtegenwoordig is of het weefsel relatief klein vergeleken met het blok van paraffine is, de monsters kunnen worden verwarmd bij 60 ° C te smelten weg de meerderheid vóór wassen in xyleen. - Wassen van de deparaffinized monsters door dompelen de dia's in een gesorteerde reeks van oplosmiddel: 70% v/v EtOH/water, 100% EtOH, Carnoy van vloeistof, 100% EtOH, ultra pure water en 100% EtOH. De duur van elke onderdompeling moet 30 s, met uitzondering van Carnoy van vloeistof, die 2 min duren moet.
Let op: Carnoy van vloeistof en xyleen moeten worden opgeslagen en gebruikt in een zuurkast, zoals ze zeer giftig zijn inademing.
-
Formaline-vaste bevroren (FFF) weefsel
Opmerking: Monsters moeten reeds worden bevroren, op de juiste wijze afhankelijk van het type van de steekproef.- Het blok van de weefsel op de bedrijfstemperatuur van de microtoom voor 20 min22equilibreer.
Opmerking: Evenwichtsinstelling temperatuur is afhankelijk van het soort weefsel. - Sectie het weefsel gebruikend microtome op 12 µm en dooi mount de secties op een vooraf bereid NC gecoat ITO schuif.
- De dia's opslaan in een vacuüm exsiccator op de Bank in het donker.
Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen voor enkele weken onder deze omstandigheden. - Wassen van de monsters in een gesorteerde reeks van oplosmiddelen zoals voor FFPE weefsel (2.1.3).
Opmerking: Er is geen behoefte een xyleen deparaffinisation stap als het monster is niet ingesloten.
- Het blok van de weefsel op de bedrijfstemperatuur van de microtoom voor 20 min22equilibreer.
3. methyleen dwarslijn hydrolyse
- Laad de voorbeelddia's (FFF of FFPE) in een plastic dia doos die naar de top is gevuld met 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Verzegel de doos en plaats deze in een waterbad, met 500 mL water, waardoor het vak aan de onderkant raken. Verwarm het vervolgens gedurende 15 minuten op 120 ° C in een snelkookpan die een bedrijfsdruk van 70 kPa bereiken kan.
- De dia's te verwijderen, laten afkoelen en laat ze drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
4. de weefsels spijsvertering
- Zodra gehydrolyseerd, jas van de monsters met 10 µL van trypsine oplossing (1 mg/mL) in ultra pure water, door pipetting 10 µL van de oplossing op de rand van de weefselsectie, gebruik van de dezelfde Pipetteer tip, en sleep vervolgens de druppel over het hele oppervlak van het weefsel onder oppervlakte spanning.
Opmerking: Vermijd krassen op het oppervlak van het weefsel met de pipet tip en over de verspreiding van het enzym buiten de grenzen van de randen van het weefsel. - Toestaan dat de monsters te drogen bij kamertemperatuur.
- Eenmaal droog, mount de monsters binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer (weefsel naar beneden) met autoclaaf tape op een rand van de dia (aanvullende figuur 2).
- Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 v/v van 100% acetonitril en 50 mM Ammoniumbicarbonaat zorgvuldig op het vloeipapier vinger in het onderste gedeelte van de petrischaal totdat de vinger lijkt te zijn gelijkmatig natte.
- Plaats de bovenste helft van de zaal van de damp op de onderste helft, zorgen voor de papier-vinger en monster-dia perfect uitgelijnd, en verzegel de kamer rond de evenaar met paraffine film.
- Laat het monster 's nachts in een incubator 37 ° C om volledige spijsvertering.
5. matrix Coating via sublimatie
- Zodra de verteerde, wegen de voorbeelddia op een 5-cijferige microanalytical evenwicht.
- Monteren van de dia op de koeling vinger van de sublimatie apparatuur en veilig met koperen tape, op dezelfde manier als beschreven voor de damp kamer (aanvullende figuur 3).
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de dia gelijkmatig is benaderd door de koeling vinger, een laag van koper tape is geplaatst op de bodem van de koeling vinger naar het niveau van het oppervlak. Dit zorgt ervoor dat de dia wordt gelijkmatig gekoeld die leidt tot zelfs afzetting van matrix. - 300 mg van α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) matrix in een glazen petrischaaltje aan de onderkant van de kamer en verspreiding gelijkmatig voor een dunne laag van matrix kristallen plaatsen.
- Monteren van de sublimator en het veiligstellen van de twee helften met de hoefijzer klem. Opschorten van de geassembleerde unit 15-20 cm boven een zand bad, voorverwarmd op 220 ° C, door deze te plaatsen in een metalen ring verbonden met de stand van een retort.
- De zaal verbinden met de vacuüm bron, gaan het vacuüm, en laat ze stabiliseren tot ~ 25 mTorr voor 5 min.
- Pak de koeling vinger naar de top met ijs en voeg 50 mL water. Laat het apparaat te regelen voor een verdere 5 min voordat u verdergaat.
- Verlagen van de kamer op het oppervlak van het zand, ervoor te zorgen dat het zand volledig contact met de bodem van de kamer, en laat het gedurende 45 minuten te creëren een ideale coating voor 0,22 mg/cm2
Let op: Zorg moet worden gehouden wanneer de behandeling van glaswerk op hoog vacuüm, zoals schade aan het apparaat, terwijl geëvacueerd, in katastrofisch mislukking van de glazen kamer resulteren kan. - Na 45 min, verwijder de zaal uit het zand bad door het verhogen van de metalen ring en luchten van de kamer.
Opmerking: Zodra de zaal heeft zijn geventileerd, de dia moet worden verwijderd zeer snel als water in de lucht beginnen zal te condenseren op de bevriezing vinger en monster dia. - Verwijderen van de dia en wegen ervoor te zorgen dat de gewenste coating is bereikt.
Opmerking: Als onvoldoende coating is bereikt, gewoon herhalen de sublimatie proces voor de dia totdat de gewenste laagdikte is bereikt.
6. herkristallisatie
- Zodra gesublimeerd, mount de voorbeelddia binnen de bovenkant van de eerder gebouwde damp kamer, als beschreven eerdere (weefsel naar beneden).
- Pipetteer 600 µL van een oplossing met een mengeling van 1:1 (v/v) van 100% acetonitril en 0,1% v/v trifluorazijnzuur in water zorgvuldig op het vloeipapier in het onderste gedeelte van de petrischaal om een gelijke deklaag.
- Monteren van de zaal, ervoor te zorgen de papier tabblad en Microscoop dia perfect uitgelijnd, en laat in een incubator 37 ° C gedurende 1 uur.
Let op: Niet het zegel van de kamer.
Opmerking: Zodra recrystallized, de normaal gesproken gele tint van de matrix moet wijzigen in wit, kijken minder glanzend en zeer zelfs verschijnen. Dit geeft aan dat herkristallisatie correct is uitgevoerd. - Het monster is nu klaar voor analyse.
7. instrumentation
- Scan de dia in een flatbed-scanner om te maken van een digitaal beeld.
- Het monster in de massaspectrometer laden en vervolgens analyseren met behulp van de juiste softwareplatform.
- Analyseer de monsters in de positieve ion reflectron modus met een massale aantal 750-3500 Da, met een plek resolutie die geldt voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen, 20-50 µm raster breedte is voldoende, maar zo weinig als 10 µm kunnen gebruikte15.
Let op: MALDI UV lasers zijn een bron van ioniserende straling en niet direct moeten worden beschouwd. Zorg ervoor dat de laser uitmaakt instrument afscherming vóór bewerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als correct gevolgd, produceert dit protocol beelden die duidelijk de bruto morfologie van het weefsel zonder krassen of andere vervormingen (Figuur 1 vertegenwoordigen). De ideale validatie voor een correct uitgevoerde monstervoorbereiding, is de mogelijkheid om het onderscheid maken tussen verschillende fysieke structuren door het veranderen van het molecuul wordt bekeken (Figuur 2).
Een goede gids om te bepalen of de monsters zijn niet goed voorbereid is om te controleren op de aanwezigheid van verplaatsing of matrix aggregatie; Peptide handtekeningen die verder reiken dan de grenzen van de fysieke weefsel zijn perfecte indicatoren die moleculen tijdens de bereiding verplaatst. Dit wordt uitgelegd in detail in O'Rourke en Padula (2017)15.
Het geproduceerde peptide spectrum moet bevatten een hoge overvloed van afzonderlijke moleculen die goed verspreid zijn over de gekozen massa bereik1,23 (dit is grotendeels afhankelijk proeven, het is echter niet ongebruikelijk om te zien hoe meer dan 50 discrete peptide handtekeningen van FFPE weefsel) (Figuur 3)18.
Figuur 1 : Een goed voorbereide monster van FFF menselijk hersenweefsel. Dit exemplaar van de verwerkte weefsel heeft zijn beeld op 50 µm en toont goede macro structuur en een duidelijk verschil tussen witte stof (WM) en grijze stof (GM). Succesvol bereid monsters zal tonen duidelijke differentiatie van verschillende weefsel locaties. Hier, is er een duidelijke regio van up-regulatie van de peptide (vertegenwoordigd door massa-naar-charge verhouding, M/Z) 1085 WM regio van paneel A. differentiatie wordt verder aangetoond door de afwezigheid van die gedefinieerde vorm in deelvenster B gevolgd door haar terugkeer in deelvenster C. Door het analyseren van de verdeling van de drie verschillende moleculen op de dezelfde weefselsectie en waaruit blijkt dat sommige gelijkmatig verdeeld, terwijl anderen beperkt tot afzonderlijke fysieke locaties zijn, kunnen we zien dat monstervoorbereiding correct is uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Een onjuist bereid sectie van FFF menselijk hersenweefsel. Dit exemplaar heeft zijn beeld op 50 µm, maar toont een grootschalige niveau van bedrijfsverplaatsingen. De patronen van de moleculen aanwezig over panelen 1, 2 en 3 tonen duidelijk aan dat, in tegenstelling tot Figuur 1, er geen duidelijke definitie tussen biologische regio's of verschillen in de overvloed van de moleculen weergegeven is. Aangezien de beelden hetzelfde, ongeacht de moleculen geselecteerd voor weergave zijn, kunnen we concluderen dat het gedelokaliseerd heeft geweest als gevolg van onjuist voorbereid. Aangezien dit hersenweefsel, is dit resultaat maakt niet logische, biologische zin. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : De globale massaspectrum van de afbeelding weergegeven Figuur 1. Het spectrum bevat een overvloed aan peptide handtekeningen alsmede over de onderkant van het massale bereik, met diverse hoge massa peptide toppen aanwezig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1 : Schematische voor snijden Vloeipapier gebruikt in damp zaal. Dikke Vloeipapier wordt gesneden in een ronde vorm met een diameter van 94 mm. Een rechthoekige tabblad is ook geknipt om te corresponderen met de grootte van een standaard glas microscoopglaasje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2 : Vergadering schema van damp kamer. Dit schema toont hoe de damp kamer moet worden gecombineerd met specifieke kennis van hoe de voorbeelddia's, vloeipapier en plakband komen met elkaar overeen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 3 : Schematische van sublimatie kamer vergadering: Deze afbeelding ziet u hoe de voorbeelddia, sublimator en verwarming toestellen worden gerangschikt om reproduceerbare sublimatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol werd ontworpen om te maximaliseren van de generatie van ioniseerbare moleculaire soorten terwijl het elimineren van de verplaatsing van de analyten. De belangrijkste factoren betrekken met behulp van hetzelfde overkoepelende principe bij de toepassing van de matrix, het verteren van het monster, of recrystallizing na sublimatie24; namelijk, dat een zelfs afzetting van damp, matrix of anders moet worden gemaakt en onderhouden. Pipetteren oplosmiddel wast voor herkristallisatie en spijsvertering, gelijkmatig onder het monster, voorkomt u dat elke individuele area ontvangen meer oplosmiddel damp dan ergens anders. Dit is belangrijk voor het voorkomen van de vorming van zichtbare condensatie en algemeen remt verplaatsing van de oppervlakte moleculen, alsmede het waarborgen dat de steekproef is gelijkmatig verteerd en recrystallized. Het is absoluut noodzakelijk om een zelfs afzetting van matrix, zoals te weinig een relatief laag intensiteitsniveau en de diversiteit van de soorten blijken zal, en teveel zal onderdrukken de ionen van het monster, ook verlaging van intensiteit en de diversiteit van de soorten25. Om te bereiken een zelfs afzetting van matrix, zorg er ook voor dat een zelfs, dunne laag van matrix kristallen van een homogene grootte, direct onder de voetafdruk van de geschorste microscoopglaasje. Als de laag oneffen of te dun is, dan sublimatie van de matrix te langzaam gaan of ongelijke26zal worden. De mogelijke problemen met handmatige toepassing van oplosmiddel en enzym komt neer op de individuele ervaring van de gebruiker. Zekere mate van "wording" met het oog op een herhaalbare resultaat nodig is, en er wellicht enige eerste toevallige onjuiste voorbereiding. Echter, als de zorg is genomen om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke beeld is in overeenstemming met de eigenschappen van het "goede" monster die wij hebben verstrekt, dan ten onrechte bereid monsters niet zal leiden tot valse biologische conclusies.
Om effectief verteren een weefsel monster bewaard in formaldehyde (FFPE of FFF), is het essentieel om te verwijderen als veel van de methyleen crosslinks mogelijk vóór trypsine afzetting16. Dit wordt gemakkelijk bereikt door verwarming van het monster in een snelkookpan op > 100 ° C, voor een korte duur, eigenlijk zonder bubbels die mechanisch van het monster distantiëren kunnen. Weefsel kan gemakkelijk worden verloren wanneer behandeld op zodanige wijze, dus ter bestrijding van dit, NC dia's werkzaam zijn. Hoewel niet kritisch zijn, garandeert het de lichamelijke integriteit van het monster wanneer onderworpen aan warmte, druk en organisch oplosmiddel. Spijsvertering van het monster wordt vervolgens bereikt door toepassing van het enzym in een staat die voorkomt de activering dat en dan het toestaan van het drogen, d.w.z. geschorst in ultra zuiver water. De damp kamer volgt dan hetzelfde principe als herkristallisatie, bieden genoeg van een vochtige omgeving voor gelokaliseerde verkeer van het enzym tegenkomen en klieven van de ruggengraat van eiwit, maar niet genoeg "nattigheid" te staan van de resulterende peptiden op drift aanzienlijk uit hun oorspronkelijke locatie26. Pipetteren rechtstreeks op de dia zal niet iedereen elke oppervlakte analyten, als gevolg van de effecten van residuele crosslinking en de algemene oplosbaarheid van grote proteïnen in water.
Hoewel we hebben gericht op de toepassing van deze methode op peptiden, kan het net zo gemakkelijk worden toegepast op werkstromen voor de analyse van de metabolieten, lipiden en eiwitten intact. Enkele stappen zou moeten worden verwijderd of aangevuld; intact eiwit imaging vereist geen Proteolytische decollete stappen, maar de fundamentele workflow van monster afdelen en montage gevolgd door matrix sublimatie, herkristallisatie en analyse kan worden toegepast op vrijwel elk type monster. Onze bedoeling voor het ontwikkelen van dit protocol en de betrouwbaarheid en robuustheid via uitgebreide empirisch onderzoek, was een methode waarvoor weinig of geen wijzigingen moeten worden aangebracht, maakt gebruik van goedkope apparatuur, en is vatbaar voor een breed maken Gemeenschap met wisselend instrumentatie en biochemische vaardigheid. Wij hopen dat dit opent nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar laboratoria die zou hebben anders verwierp deze techniek als te ingewikkeld of duur. Ook zijn wij ervan overtuigd dat wij de eerste methode van de voorbereiding van de definitieve monster voor peptide MSI hebben verstrekt. Op het moment van schrijven, zijn de meeste methoden grotendeels op basis van instrumentatie, met een bijzondere nadruk op het gebruiksgemak van robotic spuiten gebaseerd methodologieën27,28,29. Er is ook weinig betrouwbare methyleen hydrolyse methodologieën met het vermoeden dat de juiste procedure en apparaten worden gebruikt.
Kortom, vinden wij dat de toepassing van de bovenstaande methode op FFPE en FFF weefsels, zal leiden tot meer vertrouwen in de doeltreffendheid van MSI voor de analyse van peptides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict of commercieel belang vrij te geven
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de Sydney Medical School Foundation en de Blues en de Stichting voor financiering deel van dit werk door middel van hun PhD scholarship programma voor onderzoek van de ziekte van Alzheimer en een ARC Discovery subsidie (DP160102063) tot PKW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O'Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- O'Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, Sect Trop Dis Parasitol 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium - application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
