Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberkulose i mus med Reporter enzym fluorescens

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56801
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver den optiske billeddannelse af mus inficeret med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberkulose) ved hjælp af reporter enzym fluorescens (REF). Denne protokol letter følsom og specifik påvisning af M. tuberkulose i prækliniske dyremodeller for patogenesen, therapeutics og vaccine forskning.

Abstract

Reporter enzym fluorescens (REF) udnytter substrater, der er specifikke for enzymer til stede i målorganismer af interesse for imaging eller afsløring af fluorescens eller bioluminescens. Vi udnytte BlaC, en enzym udtrykt constitutively af alle M. tuberkulose stammer. REF giver mulighed for hurtig kvantificering af bakterier i lungerne af inficerede mus. Den samme gruppe af mus kan være afbildet på mange tidspunkter, høj grad at reducere omkostningerne, optæller bakterier hurtigere, tillader roman observationer i vært-patogen interaktioner og øge statistiske effekt, da flere dyr pr. gruppe er let vedligeholdes . REF er ekstremt følsomme på grund af BlaC enzymatisk reporter katalytisk karakter og specifikke på grund af den brugerdefinerede flourescence resonans energioverførsel (FRET) eller fluorogenic substrater anvendes. REF kræver ikke rekombinant stammer, sikre normale vært-patogen interaktioner. Vi beskriver billeddannelse af M. tuberkulose -infektion ved hjælp af en FRET substrat med maksimal emission på 800 nm. Bølgelængden af underlaget tillader følsomme dybe væv imaging i pattedyr. Vi vil skitsere aerosol infektion af mus med M. tuberkulose, anæstesi i mus, administration af REF substrat, og optiske billeddannelse. Denne metode har været anvendt med succes til evaluering af vært-patogen interaktioner og effekten af antibiotika målrette M. tuberkulose.

Introduction

Den langsomme vækst i M. tuberkulose er en stor vejspærring i hurtig diagnose af tuberkulose1,2,3. Mens kultur baseret diagnosticering tager uger til at producere resultater, har syrefaste smøre diagnostisk begrænsninger4 børn5 og patienter co-inficerede med human immundefekt virus6,7. Optisk tænkelig teknologier er for nylig blevet anerkendt som et alternativ til traditionelle diagnostiske metoder for tuberkulose8,9. Fluorescens og bioluminescens kan bruges til optisk billede M. tuberkulose med levende dyr i real-time10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optiske billeddannelse har fordel af en hurtig og specifik vurdering af en infektion med M. tuberkulose20,21,22.

Vi skitsere detaljer for optiske billeddannelse af M. tuberkulose i levende mus bruger REF. Denne metode er meget specifikke og følsomme23,24 , og i lighed med andre optiske metoder, er mindre dyre end andre metoder af tuberkulose (TB) imaging25, herunder computertomografi (CT)26, magnetisk resonans imaging (MR)27, og F-fluorodeoxyglucose positronemissionstomografi/CT (F-FDG PET/CT)28. REF benytter brugerdefinerede fluorescerende eller en bioluminescerende substrater, der ved spaltning af en bakteriel enzym, producerer en fluorescerende produkt8,29. Derfor, det har fordelen, der ikke kræver en rekombinant mykobakterielle reporter stamme30,31. FRET substrat beskrevet består af en fluorokrom og en quencher forbundet ved et β-lactam-ring, der er hydrolyseret af BlaC (β-lactamase), naturligt constitutively udtrykt ved tuberkulose-kompleks Mycobacterium8, 32. bakterierne direkte generere signal på grund af REF katalytisk aktivitet, der giver mulighed for forstærkning af mange størrelsesordener og følsomme påvisning af M. tuberkulose.

REF substrat anvendes i denne undersøgelse har fremragende væv penetration i levende dyr og reduceret baggrund på grund af dens lang bølgelængde. Med denne lang bølgelængde substrat er det muligt at opnå en tærskel på registrering af M. tuberkulose på næsten 100 kolonidannende enheder (CFU) in vitro- og < 1000 CFU i lungerne på mus i vivo (hele dyr)8, 33. REF kan bruges som et diagnostisk redskab for sputum, kliniske materialer og endda direkte hos patienter med mikro endoskopiske systemer16,32,33,34 høj følsomhed og specificitet. REF kan anvendes på enhver tuberkulose kliniske stamme, fordi det bruger en naturligt producerede bakteriel enzym, BlaC, til registrering i alle stammer. Disse egenskaber gør REF imaging et værdifuldt værktøj i prækliniske tuberkulose forskning generelt for at lette terapeutiske samt vaccine evaluering og analyse af patogenese, men kan også i sidste ende anvendes til diagnose i tuberkulose patienter.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og forskrifter fastsat af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Texas A & M University. Gennemgang og godkendelse fra et biologisk sikkerhed officer eller Udvalget på din institution kan være påkrævet.

Advarsel: Alle procedurer kræver BSL3 indeslutning. Ansatte er forpligtet til at bære personlige værnemidler til enhver tid. Alle manipulationer udføres inde i biosikkerhed kabinet (BSC) og alle skarpe bortskaffes i klid containere. Arbejde overflader og BSC rengøres med buffered phenol og 70% ethanol, før indlede arbejdet og efter arbejde. Procedurer vil normalt ske på biosikkerhed niveau 3 med Mycobacterium tuberculosis, men til illustration og filme formål, forfatterne viser disse procedurer biosikkerhed på niveau 2 med mindre virulente bakterier.

1. stammer og kultur betingelser

Bemærk: M. tuberkulose stamme CDC1551 er anvendt i denne undersøgelse, men nogen M. tuberkulose stamme kan bruges på samme måde.

  1. Vokse bakterier i M-OADC-TW (7H 9 bouillon suppleret med 0,5% glycerol, 10% oliesyre dextrose kompleks uden katalase og 0,05% Tween-80) medium stående ved 37 ° C til en OD600 af 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).
  2. Fortynd kulturen i M-OADC-TW (række 1:10 fortyndinger af bakterier). Plade fortyndinger af bakterier (105, 106107108) i tre eksemplarer på selektiv 7 H 11 plader tillade bestemmelse af CFU.
  3. Inkuber pladerne i fire uger ved 37 ° C, eller indtil kolonier kan tælles præcist.
  4. Der centrifugeres den bakterielle inokulum på 8,534 x g for 5 min at få en pellet. Vaske pellet engang med 10 mL saltvand (0,9% NaCl) og genopslæmmes pellet i 15 mL saltvand (0,9% NaCl).

2. aerosol infektion af mus ved hjælp af en Madison kammer

  1. Tillad mus til at acclimate til de nye omgivelser i en uge.
  2. Veje mus forud for lastning dem ind i kammeret.
  3. Tilsluttes strømskinne tre ledninger: det vigtigste kammer magt, vakuumpumpe og luftkompressor, i nævnte rækkefølge.
  4. Omhyggeligt Skru glaskrukke. Bring glaskrukke til biosikkerhed kabinet og tilføje udfordring inokulum suspenderet i 15 mL saltvand (0,9% NaCl) at opnå ~ 104 - 106 CFU af bakterier i lungerne.
  5. Luk låget af glaskrukke i biosikkerhed kabinet. Tillægger nebulizer enhed krukken og justere den lodrette rustfrit stålrør, så den nederste (indtagelse) ende er omkring en fjerdedel af en tomme under niveauet for væske i krukken.
  6. Indlæse alle de dyr, der er nødvendige for eksperimentet (kammeret kan rumme op til 90 mus) ind i kammeret og lukke alle låse på døren.
  7. Tjek main (værelse) air flow meter. Sikre, at midten af float (bolden) kører omkring 50 L/min. målt på skala til venstre.
  8. Tryk på Start-knappen på kontrolpanelet for sal. Indstil luftstrømmen hastighed gennem kompressor air flow meter (mindre måleren i venstre) som 4 L/min på skalaen. Kontroller visuelt for at sikre, at udfordring inokulat er ved at blive forstøvet.
  9. Efter 15 min, når det røde lys på forsiden af kontrolpanelet vises og en akustisk signal angiver slutningen af flugt, tryk på Reset-knappen i nederste højre hjørne af Kontrolpanel for at nulstille tællerne.
  10. Hold den lille røde knap på døren til kammeret til at frigive vakuum.
  11. Åbn kammer-dør og fjerne dyrene. Placere mus tilbage i deres bure.
  12. Fjerne nebulizer glaskrukke og anbringes i en forseglet, spildfri transport container. Anbring beholderen inde i bio-sikkerhed kabinettet og kassér udfordring suspension i en udpegede spildbakken.
  13. Placer brugte nebulizer krukken inde en biohazard taske og Forsegl posen for transport til autoklave.
  14. I slutningen af proceduren infektion, spray inde i kammeret med buffered phenol og 70% ethanol og tillade kammer til at sidde i 10 min.
  15. Derefter tørre ned alle tilgængelige indvendige overflader meget grundigt. Bortskaf alle forurenede papirhåndklæder mv. i biohazard papirkurven. Autoklave papirkurven, affaldscontainer og brugt nebulizer krukker.
  16. Placere dyr tilbage i indeslutning værelse indtil den billeddiagnostiske tidspunkt.
  17. På dagen for billedbehandling, overføre dyr i en sekundær beholder til billedbehandling rummet.

3. dyrs anæstesi

  1. Bedøver musene med isofluran ved hjælp af et tilpassede gas anæstesi system.
  2. Veje hver af to trækul filter beholderen ligger på toppen af enhedens anæstesi.
  3. Udskift med en ny dunk, hvis vægten er 50 g ovenfor den oprindelige vægt.
  4. Kontrollere vaporizer enhed for at sikre tilstrækkelig isofluran under proceduren.
  5. Placer næsen kegle indehaveren inde den billeddiagnostiske afdeling. Placer antallet af næse kegler for proceduren og forsegle de resterende åbninger med næsen kegle-blokkere.
  6. Tænd iltforsyning fra højtryks cylinderen og sæt den på 55 psi.
  7. Drej på evakuering pumpen placeret foran anæstesi enhed og sæt den til 8 L/min.
  8. Drej på ilt toggle beliggende foran anæstesi enhed.
  9. Tænde gasstrømmen anæstesi induktion herhen for at modregne strømmen af gas på 1,5 L/min. vende gasstrømmen.
  10. Tænde gasstrømmen imaging herhen for at modregne strømmen af gas på 0,25 L/min. vende gasstrømmen.
  11. Tænd isofluran vaporizer og sæt den på 2-2,5%. Justere isofluran antallet og vægten af dyr bliver brugt til eksperimentet ved at dreje på drejeknappen på isofluran vaporizer (2-2,5% for en mus vejer ~ 20 g, 4% for et marsvin vejer 300 g).
  12. Placere mus i anæstesi kammer og luk låget. Tænde gasstrømmen til anæstesi induktion kammer.
  13. Forlade mus i anæstesi induktion kammer for 5-10 min indtil helt bedøvede.
  14. Når musene er bedøvede, gælde en optisk salve øjnene at beskytte dem mens billeddannelse.
  15. Placere mus i ventrale eller brystbenet recumbency, således at deres næser er placeret i næsen kegle at lette anæstesi af mus under proceduren billeddannelse.

4. reporter enzym fluorescens (REF) imaging

  1. Injicere substrat (20 µM, 2,5 µL/g vægt) af intraperitoneal injektion i den inficerede samt kontrol mus. Musene er under anæstesi inde den billeddiagnostiske afdeling for mindre end 1 min.
  2. Start imaging systemet.
  3. Initialisere systemet ved at klikke på Initialiser. Vent, indtil temperaturen bar vender sig til grøn.
    Bemærk: Den billeddiagnostiske afdeling består af et opvarmet platform til at opretholde kropstemperaturen dyrets mens billeddannelse.
  4. Imaging erhvervelse indstilling, skal du vælge fluorescerende | Trans-belysning til hele dyret eller Epi-belysning til lungevæv, struktur og Overlay i erhvervelse Kontrolpanel.
  5. Angive Field of view til B for enkelt mus og lampe niveau til høj.
  6. Indstillet eksponeringstid til auto, medium binning, 2-3 for f/stop og excitation filter på 745 nm og emission filtre fra 780 nm til 840 nm.
  7. For sekvens opsætning, klik på sekvens Setup, skal du vælge 9-12 Trans-belysning point i området lunge.
  8. Klik på erhverve for image erhvervelse.
  9. Placer musen tilbage i buret efter billeddannelse.
  10. Overvåge mus indtil fuldt tilbagebetalt eller ofre for kvantificering CFU, hvis imaging på et tidspunkt af eksperimentet. Udføre en modificeret Karnofsky score for at overvåge mus post imaging trivsel.

5. analyse af REF imaging

  1. Åbn den billedbehandlingsprogrammer.
  2. Indlæse billedfiler ved at klikke på Gennemse ikon.
  3. Spektral urtåge, klik på spektral Unmixing i værktøjskassen og klikke på spektrene kræves til unmix. Klik på start urtåge.
  4. Optisk overflade genopbygning, klik på overflade topografi.
  5. Vælg papirretning til rygfinne, underlagt pels musen, og klik på Generer overflade.
  6. Tegne Beskµr billede og placere tærskel billed for en region af interesse. Klik på udført.
  7. For orgel registrering, gå til fanen registrering i 3D optisk værktøjer dropdown menu.
  8. Registrere organer af interesse i et orgel atlas.
  9. Justere orgel størrelse eller placering til den genererede overflade topografi ved hjælp af transformering, værktøj tænd/sluk beliggende på værktøjerne panel-registrering.
  10. Gå til fluorescerende tomografi (flagre) 3D rekonstruktion, og vælg analyser tab. Vælg billeder skal medtages for analyse, billede type til normaliseret overførsel fluorescens (NTF) effektivitet, klik på Start.
  11. Tjek på Vælg alle og rekonstruere i Data Preview fanen.
  12. Fluorescens kvantificering, gå til Region af interesse (ROI) værktøjer, tilføje ROI kube til orgel af interesse og justere cube størrelse for at dække orgel af interesse. Klik på måle 3D ROIs.
  13. I vinduet ROI målinger gå til 3D ROI målinger, vælge datatypen til kildeenheden voxels og målinger til pmolM-1cm-1.
  14. Gemme og/eller eksportere resultatet af flagre 3D rekonstruktion analyse til en figur eller fil.

6. kvantificering af bakterier ved CFU

  1. Aflive mus ved intraperitoneal injektion af 0,1 mL pentobarbital natrium (390 mg/mL).
  2. Check for pedal refleks ved at klemme puder af fødderne af mus til at sikre, at der er ingen refleks reaktion.
  3. Explant lungevæv fra mus ved hjælp af steril pincet og saks. Homogeniseres lungevæv i 1 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  4. Gøre 10-fold serielle fortyndinger af lunge homogenatet i sterilt 1 x PBS.
  5. Plating, spot tre delprøver af 20 µL af den respektive fortynding på agar plade.
  6. Inkuber plader i en inkubator ved 37 ° C og monitor for bakterievækst.
  7. Antal kolonier i hver plet efter inkubationstiden og express som CFU / mL ved at korrigere for volumen og fortynding ved hjælp af følgende ligning:
    CFU / mL = (C/V) x M
    Hvor C = koloni tæller pr. spot, V = volumen af prøven podes på hver plade (mL), og M = multiplikationsfaktoren (reciprokke af den anvendte fortynding).
    Bemærk: Hvis 11 kolonier tælles på ét sted for en sample volumen af 0.002 mL på en prøve fortynding af 10-4, ved hjælp af ligningen for kimtal beregnes som
    (11/0,02) x 104 = 5,5 x 106 CFU / mL

Representative Results

REF billeddannelse af mus inficeret med M. tuberkulose sammen med ikke-inficerede kontrol mus er vist i figur 1A. De inficerede mus produceret et betydeligt (P = 0.0057) højere fluorescens signal fra lungerne på 6 uger efter infektionen i forhold til kontrol over substrat administration. Et typisk tidsforløb til at studere den terapeutiske virkning mod M. tuberkulose bruge REF kunne imaging på ugen, 1, 2, 4, 6, 15, 24 efter infektionen. Fluorescens intensitet kvantificeres ved hjælp af epi-belysning til lungevæv (figur 1B). Konsekvent stigende signal fra uge 2-uge 6 i lungerne af inficerede mus tyder på, at REF er med held stand til at opdage M. tuberkulose in vivo. Et fald i baggrunden signal kontrol mus på et senere tidspunkt (figur 1B) kunne tilskrives stigningen i organ masse og volumen af mus over en periode på 6 uger hvorved excitation bølgelængde penetration. 3D flagre rekonstruktion af fluorescens kilder i mus inficeret med M. tuberkulose er repræsenteret i figur 2A. Billedsekvenser er erhvervet på flere trans-belysning point i mus med samme excitation og række emission filtre. Disse billedsekvenser bruges derefter til 3D flagre genopbygning for fluorescerende kilde fordeling inden for den animalske emne. Figur 2 A-D viser de forskellige retninger (koronale, sagittal og transaxial) af musen tomografi med lunge orgel registrering. NTF effektivitet kort for at kontrollere genopbygning kvalitet er repræsenteret i figur 2E. NTF kan fratrække baggrunden lys lækage fra trans-belysning billeder gennem et ekstra billede taget med filter med neutral tæthed. Billedet taget med den specifikke excitation filter (figur 2E-målt) er normaliseret til transmission billedet målt med den samme emission filter og en åben excitation filter (figur 2E - simuleret) at give signalet produceret af substratet alene. Den lignende målt og simuleret NTF effektivitet profil i både vandret (figur 2F) og lodrette (fig. 2G) profiler med næsten 0% procent fejl (figur 2E-% fejl) giver dokumentation for en god kvalitet 3D rekonstruktion med reduceret artefakter og forbedret signal lokalisering og følsomhed.

Figure 1
Figur 1 . Imaging M. tuberkulose med REF. (A) i vivo billeddannelse af mus inficerede og inficeret med M. tuberkulose på 2, 4 og 6 uger efter infektionen. Farvelinjen repræsenterer intensiteten af de fluorescerende signal i fotoner pr. sekund pr. cm2 fra lav (gul) til høj (rød). B kvantificering af fluorescens intensitet fra mus inficeret med M. tuberkulose. Fluorescens værdier for både kontrol (sort) og inficerede (rød) er repræsenteret sammen med standardfejl for hvert tidspunkt. Betydningen af resultater var bestemt af studerende t-test, p værdier i < 0,05 ansås for betydelig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . 3D flagre rekonstruktion af fluorescens kilder i mus inficeret med M. tuberkulose. Musen tomografi repræsenteret i forskellige retninger; A) koronale, B) sagittal, og C) transaxial med D) lunge orgel registrering. Den 3D region af interesse (ROI) er repræsenteret som en røde terning i lunge kilde målinger. (E) NTF effektivitet kort af den målte og simulerede for at kontrollere genopbygning kvaliteten. Den målte og simulerede NTF effektivitet profil blev sammenlignet, at levere god kvalitet af 3D rekonstruktion (lignende målte og simulerede NTF effektivitet). F) vandret og G) lodret signal profiler repræsenterende målte (blå) og simuleret (rød) NTF effektivitet kurve. De vandrette og lodrette røde bjælker angiver kilde position. Farvelinjen repræsenterer intensiteten af de fluorescerende signal i fotoner pr. sekund pr. cm2 fra lav (blå) til høj (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Når ved hjælp af Billeddannende teknikker, såsom REF, er der centrale strategier, der tillader generation af solide og sammenhængende data. Optiske billeddannelse producerer spredt lys i væv, som kan påvirke dybde af penetration, da det er svært at fange lys udsendes i alle retninger. Brug af en i nærheden af infra-røde fluorophore (NIR) substrat for REF imaging har en excitations- og bølgelængde i Querange af 700-900 nm letter minimal absorption af fluorescerende signal af mammale væv. Den brugerdefinerede designet substrat blev bygget ved at sammenkæde en NIR fluorophore, IRDye 800Cw med en quencher IRDye QC-1, af en laktamringe tillader fluorescens resonans energi transfer-baseret dæmper. IRDye har fremragende væv penetration og lys spredning karakteristika og ikke har nogen indlysende skadelige virkning på pattedyr36, bliver ryddet fra blod og organer af 24 h. fluorescens signal betydeligt øger begynder 4 h efter substrat administration, at nå maksimal niveauer 6 timer efter indgift.

Bakteriel infektiøse dosis, tilstand af administration af infektiøse dosis og substrat samt tidspunkter af imaging efter infektion ved at udføre Pilotundersøgelserne skal være standardiseret før man indlader sig på store, komplekse, eksperimenter. Pilotundersøgelserne kan reducerer tid og omkostninger Når imaging et stort antal dyr, fordi en standard procedure kan optimeres forud for at gøre den centrale eksperiment. Bakteriel belastninger bør fastlægges i organer/væv af interesse efter hele kroppen imaging ved hjælp af trans-belysning og ex vivo lunge billeddannelse ved epi-belysning til at validere kilde af signalet og bestemme kvaliteten af korrelation med bakteriel numre nuværende8. Pilotundersøgelser vil give indsigt i tærsklen til påvisning, dynamikområde af teknik og bestemmelse af de optimale eksperimentelle betingelser for billeddannelse.

De primære fordele ved at bruge REF imaging som i forhold til andre fluorescerende og en bioluminescerende strategier er dens høje følsomhed og evne til at billede naturlige M. tuberkulose stammer. REF imaging udnytter katalytisk robust enzymet BlaC der er bevaret i alle M. tuberkulose kliniske isolater og tuberkulose-komplekset stammer. Den store følsomhed af REF imaging er på grund af den hurtige katalytiske sats af BlaC i kombination med fastholdelse af cellen vært kløvet fluorescerende vare. Signal løbende stigninger, så længe substratet er til rådighed, hvilket resulterer i næsten ubegrænsede ophobning af signal i de inficerede celler og væv. Denne øget følsomhed af REF imaging i forhold til alternative tilgange Imaging giver specifik påvisning af M. tuberkulose både in vitro- og i vivo8,23,24, 29.

REF imaging kan bruges til registrering af bakteriel uden genetiske modifikationer gør det muligt for dens direkte anvendelse på enhver infektion model, enten laboratorium dyr8,37 eller humane kliniske materialer29,38 . REF kan bruges til at registrere og image en bred vifte af patogener39,40, da fluorogenic substrater kan udvikles for talrige enzymatisk mål end BlaC såsom proteaser, kinaser, ureases og β-galactosidases. Men forsigtig, man bør overveje at målet for at sikre det viser optimale egenskaber for billeddannelse. BlaC udgør en god model enzym for karakteristika, der vil sikre en vellykket anvendelse af denne strategi. REF imaging giver en øjeblikkelig udlæsning på bakteriemængde stede i lungerne under infektioner, hvilket stærkt øger fremskridt i undersøgelsen af tuberkulose patogenese, da bestemmelsen af bakteriel numre kræver normalt tre til seks uger, men selv i mere hurtig-voksende organismer denne tilgang vil spare meget tid. REF kunne også bruges til at diskriminere karcinomer fra tuberkulose, et centralt problem i diagnosticering af nodulær læsioner i patienter41,42. REF fungerer som en roman værktøj til at fremskynde translationel tuberkulose imaging og kan endda anvendes på mennesker, potentielt giver mulighed for hurtig forudsigelse af terapeutiske resultater.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane VETONE 501027
CNIR800 Custom synthesized
Fatal Plus solution Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth BD 271310
OADC Middlebrook enrichment BD 212351
Sporcidin RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar BD 212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262
XGI-8-gas Anesthesia System Perkin Elmer
Living Imaging software Perkin Elmer
Transparent nose cones Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551 ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Tags

Immunologi sag 132 pulmonal optisk lactamase vacciner dyremodeller therapeutics patogenese
Imaging <em>Mycobacterium tuberkulose</em> i mus med Reporter enzym fluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P.,… More

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J. Vis. Exp. (132), e56801, doi:10.3791/56801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter