استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية
Summary
هذه المخطوطة تعرض طريقة مفصلة لتوليد X-تحقيقات ذراع الكروموسوم والمنفذ fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) فحص حالة الأخت التماسك تشروماتيد في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت المورفولوجية بويضات. هذا البروتوكول مناسبة لتحديد ما إذا كان الذراع هو التماسك سليمة أو تعطل في الأنماط الجينية المختلفة.
Abstract
في البشر، وأخطاء العزل الصبغي في بويضات مسؤولة عن معظم حالات الإجهاض والتشوهات الخلقية. وعلاوة على ذلك، كسن المرأة، يعرف خطر الحمل جنين أنيوبلويد تزداد بشكل مفاجىء وهذه الظاهرة تأثير عمر الأمهات. شرط واحد للعزل الصبغي دقيقة أثناء الشعب هو هو الحفاظ على أخت التماسك تشروماتيد خلال فترة ممتدة من الطور الأول تجربة بويضات. وتوحي الأدلة الخلوية في كل من البشر والكائنات نموذج أن التماسك هو تتدهور خلال عملية الشيخوخة. وبالإضافة إلى ذلك، أخطاء العزل في بويضات بشرية الأكثر انتشارا خلال الانقسام الاختزالي الأول، اتساقا مع فقدان التماسك الذراع سابق لأوانه. استخدام نموذج الكائنات أمر بالغ الأهمية لكشف الآليات التي تكمن وراء فقدان التماسك تعتمد على العمر. Melanogaster المورفولوجية يوفر العديد من المزايا لدراسة تنظيم هو التماسك في بويضات. ومع ذلك، حتى وقت قريب، فقط الاختبارات الوراثية متاحة للاعتداء لفقدان التماسك الذراع في بويضات الأنماط الجينية المختلفة أو في إطار ظروف تجريبية مختلفة. هنا، بروتوكول مفصل شرط للأسفار في الموقع باستخدام التهجين (الأسماك) لمباشرة تصور العيوب في الذراع التماسك في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت بويضات المورفولوجية . توليد تحقيق أسماك التي هيبريديزيس على ذراع الكروموسوم X القاصي وجمع [كنفوكل] ض المكدسات، باحث يمكن تصور عدد إشارات الأسماك الفردية في الأبعاد الثلاثة وتحديد ما إذا كانت الشقيقة الأسلحة تشروماتيد فصل. الإجراء المبين يجعل من الممكن تحديد مقدار الذراع التماسك العيوب في مئات بويضات المورفولوجية . على هذا النحو، يوفر هذا الأسلوب أداة هامة للتحقيق في الآليات التي تسهم في الحفاظ على التماسك، فضلا عن العوامل التي تؤدي إلى زوال خلال عملية الشيخوخة.
Introduction
الفصل السليم بين الكروموسومات أثناء الانقسام والانقسام الاختزالي يتطلب أن الأخت التماسك chromatid تكون المنشأة، الحفاظ على، وصدر في أزياء منسقة1،2. التماسك أنشئت خلال المرحلة S وهو توسط كوسين المعقدة، التي تشكل الروابط المادية التي تحمل الأخت شقاً الصبغي معا. في الانقسام الاختزالي، التماسك القاصي إلى روس يعمل أيضا لعقد homologs المؤتلف معا وهذه الرابطة المادية تساعد على ضمان التوجه السليم لموعدا على الطورية وأنا المغزل (الشكل 1)3،4، 5. إطلاق سراح الذراع التماسك في طور الصعود أنا يسمح هومولوجس فصل لعكس محور دوران القطبين. بيد إذا التماسك الذراع فقدت قبل الأوان، homologs المؤتلف سوف تفقد الاتصال الجسدي بهم وفصل عشوائياً، الذي يمكن أن ينتج الأمشاج أنيوبلويد (الشكل 1).
في بويضات بشرية، أخطاء في العزل كروموسوم هي السبب الرئيسي لحالات الإجهاض والعيوب الخلقية، مثل متلازمة داون6، وحدوث ما يزيد أضعافاً مضاعفة مع الأمهات من سن7. تشروماتيد أخت التماسك في بويضات الأجنة وممارسو هو اكتمال قبل الولادة. بويضات ثم إلقاء القبض في منتصف الطور الأول أنا حتى التبويض وأثناء عملية الاعتقال هذه، ورابطة homologs المؤتلف الجسدي المستمر يعتمد على أخت chromatid التماسك. ولذلك، يتطلب فصل دقيقة أثناء الانقسام الاختزالي ونتائج الحمل العادي أن التماسك تظل على حالها لمدة تصل إلى خمسة عقود.
قد اقترح سابقا لأوانه فقدان التماسك أثناء التوقيف هو المطول من بويضات بشرية للمساهمة في تأثير عمر الأمهات وأسطر متعددة من أدلة تدعم هذه الفرضية8،9. ومع ذلك، نظراً للتحديات من الدراسة هو التماسك في بويضات بشرية، الكثير من فهمنا لهذه الظاهرة يعتمد على استخدام نموذج الكائنات الحية5،10،،من1112، 13،،من1415.
بويضات melanogaster المورفولوجية توفر مزايا عديدة لدراسة الفصل هو تماسك وصبغي. يسمح فحص الوراثي بسيطة واحدة لاسترداد ذرية من الأمشاج أنيوبلويد وقياس الدقة العاشر-العزل الصبغي في16،1711،واسعة نطاق. وعلاوة على ذلك، واحد قد يحدد أيضا ما إذا كانت أخطاء العزل الصبغي تنشأ بسبب homologs المؤتلف ميسيجريجاتي خلال الانقسام الاختزالي الأول، النمط الظاهري الذي يتسق مع فقدان سابق لأوانه للذراع التماسك11،18، 19-توجيه الملاحظة للدولة هو التلاحم في بويضات المورفولوجية من الممكن أيضا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك). استخدمت رغم النوكليوتيد الفلورية التي هجن إلى تسلسل الساتلية المتكررة لأكثر من عشر سنوات لرصد التماسك بيريسينتروميريك في النضج المورفولوجية بويضات4،20، تحليل للذراع وكان التلاحم تحديا أكبر بكثير. تصور حالة التماسك الذراع يتطلب تسلسل تحقيق يمتد على منطقة كبيرة من نسخة واحدة وهو مشرق بما فيه الكفاية ليؤدي إلى إشارات مرئية للأخت الفردية شقاً الصبغي عند التماسك الذراع غائب. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تيسير شروط التثبيت البويضات وحجم المعينة المسمى اختراق21 إلى البويضيه المورفولوجية ناضجة كبيرة (200 ميكرومتر واسعة من 500 ميكرومتر طويلة). في الآونة الأخيرة، كان ذراع مسبار بنجاح المستخدمة لتصور المورفولوجية البويضيه شقاً الصبغي خلال طور الصعود لي، ولكن المؤلفين ذكر أنهم لا يمكن اكتشاف إشارة في بروميتافاسي أو الطورية اعتقلت بويضات22. هنا نقدم بروتوكول مفصل للجيل العاشر-ذراع الكروموسوم يسبر الأسماك وشروط إعداد البويضات التي سمحت لنا بالاعتداء للخسارة المبكرة للأخت التماسك تشروماتيد في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات. هذه التقنيات، والتي مكنتنا من التعرف على منتجات الجينات المطلوبة للحفاظ على التماسك هو، سيتم السماح للآخرين بالاعتداء على شقيقة التماسك chromatid العيوب في بويضات المورفولوجية ناضجة من الأنماط الجينية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الأسماك يسبر لتقييم حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه أنا المورفولوجية بويضات تقدما هاما في المجال الانقسام الاختزالي المورفولوجية . تاريخيا، كانت محدودة للاختبارات الجينية لاستنتاج سابق لأوانه فقدان التماسك الذراع في بويضات ناضجة11،،<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل GM59354 منحة “المعاهد الوطنية للصحة” منح شارون بيكيل هاء. ونشكر هوي Q. نغوين للمساعدة في وضع بروتوكول لتوليد المسابير الذراع الفلورسنت، لافانواي Ann للحصول على مساعدة مع [كنفوكل] مجهرية، وياء إميليانو ريد للمساعدة التقنية. ونشكر أيضا العديد من الزملاء في المجتمع المورفولوجية لإجراء مناقشات مفيدة والمشورة.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
