Summary
Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traduction de l’ARNm en protéines est un processus complexe impliquant plusieurs couches du règlement. Il est souvent supposé que les modifications dans la transcription de l’ARNm reflètent les changements dans la synthèse des protéines, mais beaucoup d’exceptions ont été observés. Récemment, une technique appelée ribosome profilage (ou Ribo-Seq) est devenue une méthode puissante qui permet d’identifier, avec précision, quelles régions de l’ARNm sont traduites en protéines et la quantification de la traduction à l’échelle du génome. Nous présentons ici un protocole généralisé pour la quantification de tout le génome de la traduction à l’aide de Ribo-Seq dans la levure de bière. En outre, combinant les données de Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm permet simultanément de quantifier l’efficacité traduction de milliers de transcriptions d’ARNm dans le même échantillon et comparer les variations de ces paramètres en réponse à l’expérimental manipulations ou dans différents États physiologiques. Les auteurs décrivent un protocole détaillé de génération d’empreintes de pas de ribosome à l’aide la digestion nucléasique, isolement des complexes ribosome intact-empreinte par fractionnement de gradients de sucrose et préparation des bibliothèques d’ADN pour le séquençage en profondeur ainsi qu’il est approprié contrôles de qualité nécessaires pour une analyse précise de la traduction de in vivo .
Introduction
traduction de l’ARNm est un processus fondamentales dans la cellule, qui joue un rôle important dans la régulation de l’expression de la protéine. Par conséquent, la traduction de l’ARNm est étroitement contrôlée en réponse à différents stimuli physiologiques internes et externes 1,2. Cependant, les mécanismes de régulation traductionnelle demeurent peu étudiées. Nous décrivons ici le protocole pour la quantification du génome entier de traduction dans la levure de bière par profilage du ribosome. L’objectif global de la technique de profilage de ribosome est d’étudier et de quantifier la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires différentes. Cette technique utilise le séquençage de la prochaine génération d’analyser quantitativement occupation ribosome dans tout le génome et permet de contrôler le taux de protéine synthèse in vivo au codon unique résolution 3,4. Actuellement, cette méthode fournit les moyens de mesurer les niveaux de la traduction des protéines les plus avancées et s’est avéré pour être un outil de découverte utiles fournissant des informations qui ne peuvent être révélées par d’autres techniques actuellement disponibles, p. ex. puces ou traduction état Tableau analyse (TSAA) 5. Ribosome profilage des rapports sur l’évolution combinée des niveaux de transcription et sortie translationnelle, il apporte aussi beaucoup plus grande sensibilité par rapport aux autres méthodes.
Cette approche est basée sur le séquençage en profondeur du ribosome-protégé de fragments de mRNA 3. Au cours de la traduction des protéines, protègent les ribosomes ~ 28 portions de nt de l' ARNm (appelé empreintes) 6. En déterminant la séquence des fragments protégé par ribosome, Ribo-Seq peut carte la position des ribosomes sur l’ARNm traduits et identifier quelles régions de l’ARNm sont susceptibles d’être activement traduit en protéine 3,7. En outre, nous pouvons mesurer quantitativement la traduction des ARNm en comptant le nombre d’empreintes de pas qui s’harmonisent à une transcription ARNm donnée.
Afin d’isoler les fragments protégé par ribosome, lysats cellulaires sont initialement traités avec un inhibiteur de la traduction à caler les ribosomes suivies par digestion de ribonucléase. Considérant que la libre ARNm et les portions des ARNm traduit ne pas protégés par les ribosomes sont dégradées par la ribonucléase, les fragments d’ADN messagère ribosome protégé peuvent être récupérés par purifiant complexes ribosome intact-empreinte. Ces empreintes d’ARNm sont ensuite convertis en ADNc et analysés par séquençage en profondeur (Figure 1). En parallèle aux ribosomes de profilage, ARNm intacte est extraite à partir du même échantillon et séquencé. En comparant le volume de traduction identifiée par Ribo-Seq avec les mesures d’abondance ARNm, nous pouvons identifier les gènes qui sont spécifiquement ou down-régulation au niveau de la traduction et calculer l’efficacité de la traduction de l’ARNm à l’échelle du génome. Alors que le protocole décrit dans cet article est spécifique pour la levure, il devrait être aussi utile pour les chercheurs qui vont tenter d’établir le protocole de Ribo-Seq dans d’autres systèmes.
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Protocol
1. extraire la préparation
- Souches de levures de strie de stocks congelés pour les colonies individuelles sur des plaques de la DPJ (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose et 2 % d’agar). Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2 jours.
- Ensemencer la levure d’une plaque de la DPJ (utiliser une seule colonie) dans 15 mL de milieu YPD (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose) dans un tube à centrifuger conique 50 mL et pousser du jour au lendemain avec agitation (200-250 tr/min) à 30 ° C.
- Diluer la culture dans 500 mL de milieu YPD dans un flacon stérile de 2 L, afin que l' OD600 < 0,1. La croissance de cellules de levure avec agitation à 30 ° C pendant 3 à 5 h jusqu'à OD600 = 0,5 (phase logarithmique).
- Prélever des cellules de filtrage par le biais de 0,45 μm membranes filtrantes à l’aide d’un ensemble de filtre de porte de verre. Racler le culot avec une spatule, flash congélation dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C. La taille attendue de l’extrait concentré congelé est ~ 0,2 - 0,5 g.
ATTENTION : L’azote liquide est extrêmement basse température ; porter une protection appropriée. - Préparer un tampon de lyse fraîches (20 millimètres Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 cycloheximide μg/mL, 0,5 mM TNT, 1 % X-100 Triton) immédiatement avant son utilisation, rester sur la glace.
- Mettre 3 perles en acier chromé (3,2 mm) dans un tube d’acier inoxydable de 1,8 mL. Avant de se détendre dans l’azote liquide et ajouter les boulettes congelées, couvrir avec un bouchon en caoutchouc de silicone. Homogénéiser l’échantillon par cryobroyage de 10 s à 4200 tr/min ; répéter 10 fois. Refroidir le tube dans l’azote liquide pendant au moins 10 s entre chaque tour.
Remarque : Il est important de toujours garder l’échantillon congelé. - Ajouter 1 mL de tampon de lyse, mélanger bien en pipettant également. Transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Centrifuger à 20 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Alors qu’il travaillait sur la glace, transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Transférer 100 μL de lysat dans un nouveau tube de 1,5 mL pour l’isolement des ARNm poly (a). Procéder immédiatement à l’isolement d’ARN ou congélation flash le tube dans l’azote liquide. Mesure OD260 du reste du lysat, qui sera utilisé pour l’extraction de l’empreinte et flash geler les tubes dans l’azote liquide. Stocker les lysats à-80 ° C.
2. Extraction d’empreinte
- Préparation des gradients de sucrose
- Préparer des solutions pour 50 %, 40 %, 30 %, 20 % et 10 % de saccharose en Gradient tampon (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM de KCl, 5 mM MgCl2, 100 cycloheximide μg/mL, 0,5 mM DTT).
- Pipetter 2,2 mL du tampon saccharose 50 % prêts au fond du tube à paroi fine polyallomère mL 13,2 et congeler la solution pendant 10 min à-80 ° C (Figure 2). Puis couche de 2,2 mL de tampon de saccharose de 40 % sur le dessus du tampon de saccharose 50 % congelé et geler pendant 10 min à-80 ° C. Suivant les mêmes instructions, le saccharose couche 30 %, puis 20 % et enfin 10 % pour les tampons au sommet de l’autre. Éviter de faire des bulles d’air tout en superposition. Garder les gradients à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Les gradients de sucrose doivent être préparés au moins un jour avant l’expérience et conservés à-80 ° C.
- Digestion nucléasique
- Décongeler les gradients de sucrose, la veille de l’expériences à 4 ° C.
- Décongeler le lysat (empreinte échantillon cellulaire) sur la glace. Une prise aliquote de cellule lysat contenant 50 OD260 unités dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter le tampon de lyse fraîches à 1 mL. Stocker les autres lysat à-80 ° C. Ajouter 10 μL de RNase I (100 U/μl) et incuber 1 h à température ambiante avec légère rotation sur une coiffe de tête-plus-talons.
- (Facultatif) Clarifier les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et récupérer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Ultracentrifugation
- Doucement la couche lysats échantillons vers le haut d’un gradient de saccharose de 10 à 50 %.
- Ultracentrifugeuse le polyallomère tubes à 210 000 x g (35 000 tr/min) à 4 ° C pendant 3 h à l’aide de rotor SW-41 Ti.
- Paramétrage du système fractionnement dégradé
- Allumez les composants et permettent au moniteur de UV de warm-up pendant au moins 30 min.
- Si en utilisant un logiciel d’enregistreur numérique, démarrez le logiciel sur l’ordinateur, définir les limites d’échelle du graphe à -0,01 et 1.
- Remplir la seringue avec une Solution de Chase (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM de KCl, 5 mM MgCl2, 60 % de saccharose), éliminez les bulles d’air à l’intérieur de la seringue et la canule.
- Installez un ultracentrifugeuse tube rempli d’eau exempte de RNase. Percer le tube avec la canule jusqu'à ce que deux marques noires sont visibles. Démarrer la pompe seringue de 1 mL/min.
- Comme l’eau traverse la cellule d’écoulement, appuyez sur le bouton « Auto zéro » sur le moniteur d’UV pour ajuster le niveau de référence à 0. Régler la sensibilité de l’écran UV à « 2.0 AU ». Après qu’une ligne de base stable a été mis en place, arrêter la pompe de seringue. Récupérer la Solution Chase et retirez le tube ultracentrifugeuse.
- Isolement monosome
- Installer et percer le tube ultracentrifugeuse contenant le gradient de saccharose. Démarrer la pompe seringue de 1 mL/min, recueillir des fractions de 1 mL suivi d’une valeur de254 . Fractions représentant le pic de monosome des années 80 dans un tube de billard, rester sur la glace (Figure 3).
- Une fois la Solution Chase atteint les cellules de la circulation, arrêter la pompe de seringue. Récupérer Chase Solution et retirez le tube ultracentrifugeuse. Répétez le fractionnement pour le reste des échantillons commençant à l’étape 2.5.1.
Remarque : Lorsque vous avez terminé, nettoyez le système de fractionnement avec au moins 30 mL d’eau exempte de RNase. Laver soigneusement le tube, la seringue et toutes les pièces amovibles avec eau chaude. - Filtrer les fractions sur filtres centrifuges 0,5 mL (100 kDa MWCO) à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C et jeter le cheminement, répétez jusqu'à ce que le volume est < 100 μL. Ajouter 400 μL de tampon de sortie (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 inhibiteur de RNase U/mL). Mix de pipetage, incuber 10 min de glace et l’unité de transfert dans un nouveau tube de prélèvement. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C et recueillir le cheminement.
- Purification de fragment de l’empreinte
- Transférer les cheminement contenant empreinte fragments d’ARN à un nouveau 1,5 mL tube, ajouter 20 μL de SDS (à une concentration finale de 1 %), la composition de pipetage de 20 %.
- Ajouter 1 volume d’acide-phénol : chloroforme (pH 4,5), Vortexer pendant 10 s.
ATTENTION : L’acide-phénol : chloroforme est toxique, éviter tout contact avec la peau et inhalation. - Chauffer à 65 ° C pendant 5 min, mettre sur la glace pendant 1 min. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, transférer la phase aqueuse (en haut) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Précipiter les fragments d’ARN empreinte en ajoutant 1/10 volume de NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %.
3. Extraction d’ARNm poly (a)
- Extraction de l’ARN totale
- Décongeler une portion de 100 μL de lysat cellulaire (échantillond’ARN Total ) sur la glace, ajouter 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 et 20 μL de SDS (à une concentration finale de 1 %), la composition de pipetage de 20 %.
- Ajouter 1 volume (400 ml) d’acide-phénol : chloroforme (pH 4,5) et vortexer pendant 10 s.
- Chauffer à 65 ° C pendant 5 min, mettre sur la glace pendant 1 min. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, transférer la phase aqueuse (en haut) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Effectuer une deuxième extraction de phénol. Ajouter 1 volume d’acide-phénol : chloroforme (pH 4,5), Vortexer pendant 10 s. chaleur à 65 ° C pendant 5 min, mettre sur la glace pendant 1 min. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Précipiter l’ARN. Pour cela, ajouter 1/10 volume de 3 M AcONa (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
- Isolement d’ARNm poly (a)
- Centrifuger les échantillons d’ARN à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement et sécher à l’air le granule pendant 5 min.
- Dissoudre le culot dans 300 μl de tampon de lyse/liaison de la trousse d’isolement ARNm poly (a). Procédez à l’extraction d’ARNm poly (a) selon le protocole poly ARNm isolation kit par le fabricant.
- Précipiter les échantillons d’ADN messagère en ajoutant 1/10 volume de 3 M AcONa (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
- fragmentation de l’ADN messagère
- Centrifuger les échantillons d’ADN messagère à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas 30sec, retirez le reste de l’éthanol avec un gel-chargement pointe et air sec le granule pendant 5 min.
- Remettre en suspension les ARNm dans 18 μL d’eau exempte de RNase, ajouter 2 μL de RNA fragmentation mémoire tampon 10 x. Incuber 5 min à 94° C. Transférer le tube à la glace.
- Précipiter en ajoutant 1/10 volume de 3 M AcONa (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
4. la déphosphorylation
- Traiter l’empreinte et des échantillons d’ARNm fragmentée avec T4 polynucléotide kinase. Pour ce faire, centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec un gel de chargement de pointe. Sécher à l’air le granule pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans 7,75 µL d’eau, ajouter 1 µL de 10 x T4 polynucléotide kinase tampon 1 µL de T4 polynucléotide kinase (10 000 U/mL) et 0,25 µL d’inhibiteur de RNase (20 U/µL). Incuber 1 h à 37 ° C.
- (Facultatif) Courir avant un gel TBE-urée de 15 % à 180 V pendant 15 min à l’aide de 1 x TBE tampon.
- Ajouter 10 µL de 2 X tampon TBE-urée à 10 µL de chaque échantillon d’empreinte et de l’ARNm. Préparer un échantillon de contrôle contenant 1 µL d’oligonucléotide de marqueur 10 µM taille supérieure (32 nt), 1 µL de 10 µM basse taille marqueur d’oligonucléotide (28 nt), l’eau 8 µL et 10 µL de 2 x tampon TBE-urée pour les échantillons de l’empreinte. Préparer un échantillon de contrôle contenant 1 µL d’oligonucléotide de marqueur 10 µM RNA (63 nt), 9 d’eau µL et 10 µL de 2 x tampon TBE-urée pour les échantillons d’ADN messagère.
- Incuber les échantillons et les contrôles 3 min à 75 ° C, tournez en bas, mettre sur la glace pour 1 min. charger chaque échantillon dans 2 puits du gel 15 % TBE-urée, fragments d’ARN séparées par électrophorèse sur gel à 180 V pendant 1 h.
- Souillez le gel pendant 5 min avec une tache de gel d’acide nucléique (x 10 000 dilué dans l’eau), protéger de la lumière.
- À l’aide d’un Transilluminateur de lumière bleu, couper la bande appropriée entre 28 et 32 marqueurs de nt pour empreinte échantillons (Figure 4 a) et environ 50-70 nt pour l’ARNm échantillons (Figure 4 b) avec une lame de rasoir propre. Congeler les morceaux de gel de polyacrylamide à-80 ° C pendant au moins 10 min.
- Extrait RNA le gel de polyacrylamide comme suit. Faites chauffer les morceaux de gel à 70 ° C pendant 2 min, moudre le gel à l’aide de pilons pellet jetables. Éluer l’ARN avec 300 µL de tampon d’élution (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 millimètres EDTA), ajouter 1 µL inhibiteur de RNase (20 U/µL) et incuber à 37 ° C pendant 3 h.
- Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, de recueillir le liquide surnageant et précipiter en ajoutant 1/10 volume de NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
5. ligature de l’adaptateur-3'
- Centrifuger les échantillons de l’ARNm et empreinte à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement. Sécher à l’air le granule pendant 10 min.
- Resuspendre le culot dans 4,75 µL d’eau exempte de nucléase, 2 µL de 50 % PEG8000, 1 µL de tampon de ligase ARN T4 X 10, 1 µL de 3'-adaptateur (100 ng/µL), 0,25 µL d’inhibiteur de RNase (20 U/µL), 1 µL de ligase d’ARN T4 2 tronqué KQ (200 000 U/mL). Incuber une nuit à 16 ° C.
- Le lendemain matin, enlever l’excès de l’adaptateur en ajoutant 0,5 µL de 5'-deadenylase (10 U/µL) et 0,5 µL d’exonucléase Rec J (10 U/µL) directement à la réaction de ligature. Incuber 30 min à 30 ° C.
- Précipiter les échantillons. Pour ce faire, ajoutez 30 µL d’eau exempte de nucléase, de 1 µL glycogène (10 mg/mL), 1/10 volume de NaOAc (pH 5,5) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
6. Transcription inverse
- Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement. Sécher à l’air le granule pendant 10 min.
- Resuspendre le culot dans 11,5 µL d’eau exempte de nucléase, ajouter 0,5 µL d’apprêt de transcription inverse 8 µM (amorce de RT) et 1 µL du mélange dNTP (10 mM). Incuber 5 min à 65 ° C, placer sur la glace.
- Ajouter 4 µL de 5 X premier tampon strand, 2 µL de 0,1 M DTT, 0,5 µL d’inhibiteur de RNase (20 U/µL), 0,5 µL de la transcriptase inverse (200 U/µL). Incuber 30 min à 48 ° C, 1 min à 65 ° C, 5 min à 80 ° C.
- Ne pas précipiter et procéder immédiatement à l’hydrolyse de l’ARN, en ajoutant 0,8 µL de 2 M de NaOH, incuber 30 min à 98 ° C. Ajouter 0,8 µL 2M HCl à neutraliser la réaction.
- Précipiter les échantillons.
7. circularization
- Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement et sécher à l’air le granule pendant 10 min.
- Resuspendre le culot dans 16,75 µL d’eau exempte de nucléase. Ajouter 2 µL de simple brin ADN (ADN simple brin) ligase mémoire tampon, 1 µL 50 mM MnCl2, 0,25 µL d’ADNsb Ligase 10 x (100 U/µL). Incuber pendant 1 heure à 60 ° C, 10 min à 80 ° C. Ne pas précipiter et stocker le produit de la réaction de ligature d’ADNsb à-20 ° C.
8. l’Amplification de la bibliothèque
- Alors que le travail sur la glace, mélanger ce qui suit dans un tube PCR : 146 µL d’eau exempte de nucléase, 2 µL d’apprêt avant de 20 µM, 2 µL de l’apprêt indexé Reverse 20 µM, 40 µL de 5 x tampon de plymerase ADN haute-fidélité, 4 µL des dNTPs (10 mM), 4 µL du produit de réaction de ligature ssDNA et 2 µL de haute fidélité ADN polymérase. Choisissez un apprêt indexé inverser différent pour chaque échantillon qui va être multiplexée pour le séquençage. Transférer une quantité de 50 µL du mélange PCR dans 4 nouveaux tubes PCR.
- Effectuer l’amplification PCR avec un nombre variable de cycles (8, 10, 12, 14) en utilisant les paramètres suivants :
1 min à 98 ° C dénaturation initiale
8 à 14 cycles :
15 s à 94 ° C
5 s à 55 ° C
10 s à 65 ° C
2 min à 65 ° C extension finale - Précipiter le produit PCR en ajoutant 1/10 volume de 3 M AcONa (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
- Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement et sécher à l’air le culot.
- Resuspendre le culot dans 8 µL d’eau exempte de nucléase, ajouter 2 µL de non-dénaturisation 5 x tampon acide nucléique. Charger l’échantillon sur 1 bien d’un gel non dénaturant de TBE de 8 %. Séparer les produits d’ADN par électrophorèse sur gel à 150 V pour 35 min. Comme contrôle, préparer un échantillon contenant 0,5 µL d’échelle d’ADN de 10 PB (1 µg/µL), 7,5 µL d’eau et 2 µL de non-dénaturisation 5 x tampon acide nucléique et courir sur un couloir séparé du gel.
- Souillez le gel pendant 5 min avec une tache de gel d’acide nucléique (x 10 000 dilué dans l’eau), protéger de la lumière. À l’aide d’un lumière bleu Transilluminateur, couper la bande environ 150 bp à l’empreinte et environ 180 bp pour les échantillons d’ADN messagère (Figure 6) avec une lame de rasoir propre. Rangez les morceaux de gel à-80 ° C pendant au moins 10 min.
- Faites chauffer les morceaux de gel à 70 ° C pendant 2 min, moudre le gel à l’aide de pilons pellet jetables. Éluer ADN avec 300 µL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 et incuber à 37 ° C pendant 3 h.
- Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, de recueillir le liquide surnageant et précipiter en ajoutant 1/10 volume de NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 de glycogène (10 mg/mL) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber à-20 ° C pendant au moins 1 h.
- Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, retirez l’éthanol. Tournez en bas de 30 s à vitesse max, retirez le reste de l’éthanol avec une pointe de gel-chargement et sécher à l’air le culot. Enfin, remettre en suspension les bibliothèques dans 20 µL d’eau exempte de nucléase et procéder à la quantification, de contrôle de la qualité et de séquençage.
9. Bibliothèque Quantification et séquençage haut débit
- Avant d’envoyer les échantillons pour le séquençage, déterminer le rendement et la qualité des bibliothèques amplifié par PCR. Profils représentatifs pour empreinte et bibliothèques de séquençage d’ADN messagère sont indiquées à la Figure 7. La taille attendue de la bibliothèque amplifié par PCR est 148-152 pour les échantillons de l’empreinte et 170-190 PB pour les échantillons d’ADN messagère.
- Si plusieurs échantillons avec différents codes à barres vont être mis en commun pour le séquençage, réaliser une quantification précise des bibliothèques à un dosage de quantification de bibliothèque de qPCR basée sur le séquençage.
- Mettre en commun les bibliothèques dans les proportions équimolaires. Calcule le volume total de la piscine comme 3 µL x nombre total d’échantillons à mettre en commun. Déterminer le volume de chaque bibliothèque qui doit être ajouté pour que les bibliothèques sont mélangés dans les proportions équimolaires pour atteindre la concentration finale de 10 nM de la piscine. Ajouter les volumes calculés de chaque bibliothèque dans un nouveau tube de 1,5 mL, mélanger en pipettant également. Ajouter de l’eau pour obtenir le volume total calculé. Stocker des bibliothèques regroupées à-20 ° C.
- Envoyer une partie aliquote de la bibliothèque regroupée à séquencer 50 bp single-end séquençage sur une plateforme de séquençage Illumina. Nous avons systématiquement multiplex 12 échantillons en une séquence unique exécuter, quels rendements ~ 200 millions lit par voie de séquençage.
Remarque : Le nombre définitif d’empreinte lectures recueillies par chaque échantillon dépend de la quantité de la matière d’entrée et le niveau de contamination de l’ARNr.
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Representative Results
Détaillée des pipelines pour l’analyse bioinformatique des données de profilage de ribosomes ont été décrits précédemment 8,9. En outre, plusieurs groupes de recherche ont mis au point des outils bioinformatiques pour l’analyse de l’expression différentielle des gènes et de traitement des données de séquençage, qui sont spécifiques pour ribosome profilage méthode 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. La première étape de l’analyse des données de Ribo-Seq est démultiplexage et tailler la séquence d’adaptateur 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT à l’aide de logiciels de Cutadapt 19. Puis les lectures de séquençage sont alignés contre non-codage RNAs, tels que les ARNr et les ARNt, utilisant noeud papillon 20 pour supprimer les séquences contaminantes, et lectures qui ne sont pas alignent sont alors mappées sur le génome de la levure. Lu comte par gène peut ensuite être évaluée par HTseq-comte logiciel 21et gènes différentiellement exprimés sont identifiés à l’aide de DESeq2 22.
La figure 8 montre des résultats représentatifs de l’analyse quantitative de la traduction en hbs1Δ 23,24 levure mutant de délétion qui ont été obtenues à l’aide de notre protocole. Tout d’abord, nous avons évalué le nombre et la proportion des lectures qui correspondent à l’ARN non codants (p. ex. rRNA) obtenue après le séquençage des bibliothèques ARNm et empreinte générées pour les cellules de type sauvage et le mutant hbs1Δ. Nous avons constaté que, même en l’absence des ARNr appauvrissement mesures (voir ci-dessous), de 50 à 60 % de toutes les lectures séquencées dans notre empreinte bibliothèques correspondent à des fragments d’empreinte protégé par ribosome (Figure 8 a). En revanche, seulement 3 % des fragments dérivés ARNr ont été observés dans les bibliothèques de l’ARNm démontrant que l’isolement ARNm poly (a) permet à l’élimination effective des ARNr lectures. Ensemble, nous avons réussi à obtenir plus de 10 millions empreinte lectures pour chacun des échantillons empreinte par séquençage 2 répétitions. Pour évaluer la variabilité de la génération de la bibliothèque et de la reproductibilité des données, nous analysons habituellement au moins deux réplicats biologiques indépendantes par chaque condition expérimentale. Bibliothèques d’échantillons empreinte tant ARNm montrent bonne reproductibilité avec Pearson coefficient de corrélation R ~ 0.99 entre échantillons appariés (Figure 8 b).
En plus d’évaluer le niveau de traduction des protéines à l’échelle du génome, ribosome profilage permet de mesurer les changements dans l’efficacité de la traduction entre les conditions expérimentales 3. Pour ce faire, une partie aliquote du lysat cellulaire (non traitée avec ribonucléase) est utilisée pour l’isolement des ARNm poly (a) et la préparation d’une bibliothèque de RNA-Seq. Parce que l’empreinte Bibliothèque et bibliothèque de RNA-Seq sont préparés dans les mêmes conditions contrôlées et peuvent être retracées à chaque réplicat individuel, Ribo-Seq et RNA-Seq ensembles de données peuvent être directement comparés pour identifier les gènes qui sont réglementés par les changements dans l’ARNm transcription, l’efficacité de la traduction, ou par un effet combiné. Pour identifier les gènes qui sont haut - ou diminuées spécifiquement au niveau de la traduction des protéines chez le mutant hbs1Δ, nous avons calculé les changements dans l’efficacité de la traduction en divisant les valeurs rpkm empreinte par ARNm rpkm pour chacun des gènes (Figure 8).
Figure 1 : vue d’ensemble du protocole Ribo-Seq. L’ensemble du protocole peut être effectué en environ 11 jours. Durée estimée pour chaque étape est illustrée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : préparation des gradients de sucrose S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : profils gradient de saccharose représentatif. (A) profil gradient de Sucrose obtenue pour des contrôles (pas traitées avec de la RNase I) échantillon. (B) afin d’extraire les fragments d’ARN protégés par ribosome, lysats cellulaires sont traités avec de la RNase I pour 1 h à température ambiante (RT). Fractions correspondant au pic de monosomal sont ensuite recueillies pour l’extraction de l’empreinte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : les images représentant les 15 % des gels de polyacrylamide obtient après traitement de T4 polynucléotide kinase. (A) la taille de la tranche de gel excisés autour de 28 et 32 nt est montrée pour les échantillons de l’empreinte. (B) couper la tranche de gel environ 50-70 nt pour les échantillons d’ADN messagère. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : des images représentatives des gels de polyacrylamide 10 % obtient après transcription inverse. (A) couper la bande supérieure ~ 128 nt pour les échantillons de l’empreinte, correspondant au produit de la transcription inverse. (B) coupe la bande autour de 150-170 nt pour les échantillons d’ADN messagère (bande supérieure). Les bandes inférieures correspondent à l’amorce de la RT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : purification sur gel de Polyacrylamide de bibliothèques amplifié par PCR. Produits PCR obtenus après 8, 10, 12 et 14 cycles d’amplification de la bibliothèque ont été résolus sur un gel non dénaturant de TBE de 8 %.La taille des bibliothèques empreinte pleine longueur est ~ 150 bp, alors que la taille des bibliothèques de l’ARNm est ~ 170-190 BP. éviter la bande inférieure qui ne contient-elle pas d’insert.
Figure 7 : analyse de Bioanalyzer. (A) les profils de Bioanalyzer représentant de la bibliothèque de l’empreinte amplifié par PCR. La taille moyenne de la bibliothèque de l’empreinte est censée être de 148 à 152 nt. B Bioanalyzer représentant les profils de la bibliothèque de séquençage obtient pour des échantillons d’ADN messagère. La taille attendue de la bibliothèque de l’ARNm est 170-190 nt. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : résultats représentatifs. (A) nombre de lectures d’ARNm et ARNr empreinte obtenue pour l’échantillon de type sauvage et le mutant hbs1Δ. Nombre cumulé de lectures générée par séquençage biologique deux réplicats est indiqué pour les cellules de type sauvage et le mutant hbs1Δ. (B) reproductibilité des mesures de l’empreinte et l’ARNm-abondance entre deux répétitions. Coefficients de corrélation de Pearson (R) sont indiqués. (C) transcription et translationnelles changements chez le mutant hbs1Δ. Significativement, gènes régulée et diminuées dans hbs1Δ sont regroupés conformément à la question de savoir si elles sont affectées par un changement dans la transcription de l’ARNm, efficacité de la traduction, ou par un effet combiné. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Amorces | Séquence | Index | ||||
| 3' adaptateur (100 ng/µL) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| Apprêt de RT | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Amorce PCR avant | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Amorce de l’index 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Index ABC 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Index ABC 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Index ABC 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Index ABC 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Index ABC 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tableau 1 : 3' adaptateur et apprêt des séquences.
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Discussion
L’approche de Ribo-Seq est devenue une technologie puissante pour l’analyse de l’ARNm traduction in vivo à l’échelle du génome niveau 3. Des études utilisant cette approche, qui permet de contrôler la traduction avec une résolution unique-codon, a contribué à notre compréhension de la régulation traductionnelle. Malgré ses avantages, Ribo-Seq présente plusieurs limites. Fragments d’ARN ribosomal (ARNr) sont toujours co purifiés lors de l’isolation des empreintes protégé par ribosome diminue le rendement des lectures de séquençage utiles qui peuvent être obtenus dans les expériences de Ribo-Seq 9,25. Nos résultats démontrent que la contamination de l’ARNr peut contribuer à jusqu'à 40-50 % de toutes les lectures (Figure 8). Une des façons de contourner cette limitation est d’augmenter la profondeur de séquençage. Des tours supplémentaires du séquençage doivent être effectuées jusqu'à ce que le nombre requis de séquençage lectures est obtenu pour chacun des échantillons analysés. Analyse des bibliothèques séquençage préparés en utilisant notre protocole montre que plus de 5 millions de lectures empreinte peuvent être obtenues pour chaque librairie empreinte, quand 12 échantillons sont multiplexés ensemble un standard 50-bp single-end sur plateforme Illumina HiSeq 2000. Cependant, si on observe une contamination importante avec l’ARNr, une étape facultative de suppression des ARNr est possible.
Une des stratégies pour éliminer les ARNr contaminer des fragments de bibliothèques de l’empreinte est d’utiliser l’hybridation soustractive avec les oligonucléotides biotinylés comme décrit plus haut 8,26,27. Alternativement, ARNr contaminer lectures peut être enlevé à l’aide de kits de déplétion ARNr disponibles dans le commerce. Pour ce faire, chercheurs peuvent effectuer l’appauvrissement ARNr sur des fragments d’empreinte de 3'-adaptateur-ligaturé purifiée de l’étape 5.4. Suivant l’appauvrissement ARNr, empreinte des échantillons peuvent être précipités et utilisés directement pour la transcription inverse (étape 6), comme décrit dans le protocole.
En plus de la purification des monosomes à l’aide de fractionnement gradient de saccharose décrit dans notre protocole, plusieurs méthodes ont été développées qui utilisent une purification basée sur les colonnes 28 et ultracentrifugation grâce à un coussin de saccharose 8 ,,29. Bien que ces méthodes peuvent accélérer le processus de préparation de bibliothèque empreinte et sont moins techniquement difficiles par rapport au fractionnement de gradients de sucrose, ils ne permettent pas une analyse qualitative des monosomes purifiées et l’efficacité de la nucléase étape de la digestion. Récemment, le choix de la nucléase a démontré d’influer sur l’efficacité de la purification du ribosome protégé des fragments d’ARN dans différentes espèces de 30. Alors que la RNase I a activité robuste dans les lysats de cellules de levure, son activité s’est avéré de compromettre l’intégrité des ribosomes dans les tissus de souris ainsi que les mouches des fruits. Par conséquent, le choix et la concentration de la nucléase doivent être optimisés lors de l’adoption de ce protocole à d’autres espèces.
Une autre considération importante est l’utilisation des inhibiteurs de la traduction. La plupart des protocoles pour profiler le ribosome impliquent généralement des traitement de cellules avec des inhibiteurs de l’élongation, tels que la cycloheximide ou harringtonine, afin d’éviter que le ruissellement des ribosomes pendant cellule récolte 3. Une des limitations de l’utilisation des inhibiteurs de la traduction est que les médicaments diffusent progressivement dans la cellule, induisant une inhibition progressive des ribosomes 31. En outre, les médicaments n’inhibent pas initiation de la traduction ou de la résiliation. En conséquence, les ribosomes disproportionnée s’accumulent dans le codon de démarrage et sont épuisés à l’arrêt codon 8,27,31. Afin de limiter cet artefact, nous avons choisi de flash geler les cellules dans l’azote liquide et de traiter avec le cycloheximide au moment de l’extraction dans le tampon de lyse uniquement.
Malgré un nombre relativement élevé de rapports qui ont utilisé la Ribo-Seq chez diverses espèces, des protocoles standardisés pour effectuer des analyses de Ribo-Seq font défaut. En conséquence, Ribo-Seq données générées par les différents laboratoires ne peuvent pas être directement comparées. Par exemple, la comparaison des ribosomes publiées ensembles de données de profilage révèle des différences significatives dans les résultats entre les études 32. Cela est en partie dû à des améliorations continues qui ont été faites comme le protocole évolué au cours des dernières années. En outre, de nombreux chercheurs modifié le ribosome profilage de protocole pour l’adopter aux besoins spécifiques de leur étude ou modèle système 9,25. Outre normaliser le ribosome profilage protocole ainsi comme l’analyse des données et la normalisation, accueillerais empêchant certains d'entre les biais expérimentaux et assurer la quantification précise et reproductible de in vivo traduction.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions AG040191 et AG054566 à VML. Cette recherche a été menée alors que VML est un bénéficiaire d’une subvention de recherche AFAR de l’American Federation for Aging Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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