Summary
翻译调控在蛋白质丰度控制中起着重要的作用。在这里, 我们描述一个高通量的方法, 定量分析翻译在萌芽酵母酿酒酵母。
Abstract
mRNA 转化为蛋白质是一个复杂的过程, 涉及多个层次的调节。通常认为, mRNA 转录的变化反映了蛋白质合成的变化, 但许多例外情况已经观察到。最近, 一种叫做核糖体剖面 (或 Ribo-Seq) 的技术已经成为一种强有力的方法, 它允许识别, 精确度高, 将 mRNA 的区域转化为蛋白质, 并在全基因组水平上量化翻译。在这里, 我们提出了一个广义的协议的基因组全定量翻译使用 Ribo-Seq 在萌芽酵母。此外, 结合 Ribo 序列数据与 mrna 丰度测量, 使我们能够同时量化的翻译效率数以千计的 mrna 转录在同一样本, 并比较这些参数的变化, 以响应实验操纵或在不同的生理状态。我们描述了一个详细的协议, 生成核糖体足迹使用核酸消化, 分离完整的核糖体足迹复合物通过蔗糖梯度分馏, 并准备 DNA 库的深度测序, 以及适当的确保准确分析体内翻译所需的质量控制。
Introduction
mRNA 翻译是细胞中的基本过程之一, 在蛋白质表达调控中起着重要的作用。因此, mRNA 翻译受到严格控制, 以响应不同的内外生理刺激1,2。然而, 翻译规则的机制仍然理解。在这里, 我们描述了协议的基因组全定量翻译在萌芽酵母核糖体剖面。核糖体剖面技术的总体目标是研究和量化不同细胞条件下的特定基因的翻译。这项技术使用下一代测序来定量分析核糖体在整个基因组中的占有情况, 并允许监测蛋白质合成的速率在体内在单一密码子解析3,4。目前, 这种方法提供了最先进的测量蛋白质翻译水平的手段, 并已证明是一个有用的发现工具提供的信息, 不能透露其他现有的技术, 如微阵列或转换状态数组分析 (TSAA) 5。由于核糖体分析报告的转录水平和翻译输出的组合变化, 它也提供了比其他方法更大的灵敏度。
这种方法是基于核糖体保护的 mRNA 片段3的深度测序。在蛋白质翻译期间, 核糖体保护 ~ 28 nt 部分的 mRNA (称为脚印) 6。通过确定核糖体保护片段的序列, Ribo-Seq 可以映射核糖体在翻译的 mrna 上的位置, 并确定哪些区域的 mrna 可能被积极转化为蛋白质3,7。此外, 我们可以定量测量 mrna 的翻译, 通过计算与给定的 mrna 转录值对齐的脚印数。
为了分离核糖体保护的碎片, 细胞裂解最初处理的翻译抑制剂, 以拖住核糖体后, 核糖核酸消化。虽然游离的 mrna 和部分的翻译基因不受核糖体的保护, 退化的核糖核酸, 核糖体保护的 mrna 片段可以恢复纯化完整的核糖体足迹复合物。然后将这些 mRNA 的足迹转化为 cDNA 文库, 并通过深度测序 (图 1) 进行分析。在核糖体剖面的同时, 完整的 mRNA 从相同的样本中提取并测序。通过比较 Ribo-Seq 和 mrna 丰度测量的翻译水平, 我们可以确定在翻译水平上具体上调或下调的基因, 并在全基因组水平上计算 mrna 的翻译效率。虽然本文中描述的协议是针对酵母的, 但对于那些试图在其他系统中建立 Ribo 的研究人员来说, 它也应该是有用的。
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Protocol
1. 提取制剂
- YPD 板上的单一菌落的冷冻储存的条纹酵母菌株 (1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖和2% 琼脂)。在30° c 下孵育2天。
- 接种酵母从 YPD 板 (使用一个单一的殖民地) 到15毫升的 YPD 培养基 (1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖) 在50毫升圆锥离心管和成长过夜与震动 (200-250 rpm) 在30° c。
- 在2个无菌烧瓶中稀释培养成500毫升的 YPD 培养基, 使 OD600和 #60; 0.1。将酵母细胞在30° c 的震动下生长3-5 小时, 直至 OD600 = 0.5 (mid-log 阶段)。
- 通过使用玻璃支架过滤器组件过滤0.45 μ m 膜过滤器来收集细胞。用刮刀刮出颗粒, 在液氮中闪冻, 在-80 ° c 处贮存。冷冻颗粒的预期尺寸是 ~ 0.2-0.5 克。
注意: 液氮温度极低;穿戴适当的保护。 - 准备一个新的裂解缓冲液 (20 毫米的三 HCl pH 8.0, 140 毫米氯化钾, 5 毫米氯化镁2, 100 微克/毫升放线菌, 0.5 毫米的地面广播, 1% 海卫 X-100) 立即使用前, 保持在冰上。
- 将3镀铬钢珠 (3.2 毫米) 放入1.8 毫升不锈钢管。预冷在液氮和添加冰冻颗粒, 盖上硅橡胶帽。质样品由 cryogrinding 为十年代在4200转每分钟;重复10次。冷却管在液氮至少十年代在每圆之间。
注意: 始终保持样品的冷冻是很重要的。 - 加入1毫升的裂解缓冲液, 拌匀移。转移到一个新的1.5 毫升管。
- 离心机在 2万 x g 为5分钟在4° c。在冰上工作时, 将上清液转化为新的1.5 毫升管。将100μ l 的裂解液转移到新的1.5 毫升试管中, 用于聚 (a) mRNA 的分离。立即进行 RNA 隔离或闪光冻结在液氮中的管。测量剩余的裂解物的外径260 , 这将用于足迹提取, 并在液氮中冻结管的闪光。在-80 ° c 下储存裂解。
2. 足迹提取
- 蔗糖梯度的制备
- 准备50%、40%、30%、20% 和10% 蔗糖在梯度缓冲液中的溶液 (20 毫米三盐酸 pH 8.0, 140 毫米氯化钾, 5 mm 氯化镁2, 100 微克/毫升放线菌, 0.5 毫米的电喷)。
- 吸管2.2 毫升的准备50% 蔗糖缓冲到底部的13.2 毫升薄壁 polyallomer 管和冻结解决方案为10分钟的-80 ° c (图 2)。然后将2.2 毫升的40% 蔗糖缓冲液放在冰冻的50% 蔗糖缓冲液的顶部, 并在-80 ° c 下冷冻10分钟。按照同样的指示, 30% 层, 然后 20%, 最后10% 蔗糖缓冲在彼此之上。避免在分层时制造气泡。将渐变保持在-80 ° c 直到使用。蔗糖梯度应至少在实验前一天准备, 并贮存在-80 ° c。
- 核酸消化
- 在4° c 实验前的晚上解冻蔗糖梯度。
- 在冰上融化细胞裂解 (足迹样本)。将含有 50 OD260单元的细胞裂解物转移到新的1.5 毫升管中, 并将新鲜的裂解缓冲液分到1毫升。将剩余的裂解液储存在-80 ° c。添加10μ l 核糖核酸 I (100 U/μ l), 并在室温下孵育1小时, 在学杂费脚跟旋转上轻轻转动。
- 选)澄清样品在 2万 x g 为5分钟在4° c 和恢复上清入一个新的1.5 毫升管子。
- 离心
- 在10-50% 蔗糖梯度的顶端轻轻地将裂解样品层化。
- Ultracentrifuge 的 polyallomer 管在 21万 x g (3.5万 rpm) 在4° c 为 3 h 使用 SW-41 钛转子。
- 梯度分馏系统设置
- 打开组件, 并允许紫外线显示器预热至少30分钟。
- 如果使用数字记录软件, 请在计算机上启动软件, 将图形的缩放限制设置为-0.01 和1。
- 用大通溶液填充注射器 (20 毫米的三盐酸 pH 8.0, 140 毫米氯化钾, 5 毫米氯化镁2, 60% 蔗糖), 去除注射器和套管内的气泡。
- 安装一个 ultracentrifuge 管充满无核糖核酸水。用导管刺穿管子, 直到看到两个黑色的标记。启动注射器泵在1毫升/分钟。
- 当水流经流动单元时, 在紫外线监测器上按 "自动零" 按钮, 将基线调整到0。将紫外线监测器的灵敏度设置为 "2.0 AU"。在建立了稳定的基线后, 停止注射器泵。恢复追逐解决方案, 并删除 ultracentrifuge 管。
- Monosome 隔离
- 安装和刺穿含有蔗糖梯度的 ultracentrifuge 管。启动注射器泵在1毫升/分钟, 收集1毫升分数监测一个254值。池分数代表 80S monosome 峰值成一个管, 保持在冰 (图 3)。
- 一旦追逐解决方案到达流动细胞, 停止注射器泵。恢复追逐解决方案, 并删除 ultracentrifuge 管。从步骤2.5.1 开始, 对其余样品重复分馏。
注: 完成后, 用至少30毫升的无核糖核酸水清洗分馏系统。用温水彻底冲洗油管、注射器和所有可拆卸部件。 - 过滤分数通过0.5 毫升离心过滤器 (100 kDa 分子) 在 1.2万 x g 为10分钟在4° c 并且摒弃流动, 重复直到容量是和 #60; 100 μ l。添加400μ l 释放缓冲液 (20 毫米三盐酸 pH 7.0, 2 毫米 EDTA, 40 U/毫升核糖核酸抑制剂)。由移混合, 在冰上孵育10分钟, 并将该装置转换成新的收集管。离心机在 1.2万 x g 为10分钟在4° c 和收集流动通过。
- 脚印碎片净化
- 将含有足迹的 RNA 片段转移到新的1.5 毫升管中, 加入20μ l 20% SDS (最终浓度为 1%), 由移混合。
- 添加1量的酸性苯酚: 氯仿 (pH 值 4.5), 涡旋为十年代。
注意: 酸性苯酚: 氯仿是有毒的, 避免接触皮肤和吸入。 - 热在65° c 为5分钟, 在冰上投入1分钟离心样品在 1.2万 x g 为 5 min 在4° c, 转移水相 (上部) 到新的1.5 毫升管子。
- 沉淀足迹 RNA 片段通过增加1/10 容量 NaOAc (pH 5.5), 1/100 容量糖原 (10 毫克/毫升) 和2.5 容量100% 乙醇。
3. 聚 (A) mRNA 提取
- 总 RNA 提取
- 解冻100μ l 分的细胞裂解液 (总 RNA样本) 在冰上, 添加300μ l 20 毫米的三 HCl 的 pH 值7.0 和20μ l 20% SDS (到最后浓度 1%), 混合由移。
- 添加1体积 (400 μ l) 的酸性苯酚: 氯仿 (pH 值 4.5) 和漩涡十年代。
- 热在65° c 为5分钟, 在冰上投入1分钟离心样品在 1.2万 x g 为 5 min 在4° c, 转移水相 (上部) 到新的1.5 毫升管子。
- 进行第二次苯酚提取。加入1的酸性苯酚: 氯仿 (pH 4.5), 涡旋为十年代. 热在65° c 为 5 min, 在冰上放1分钟. 离心样品在 1.2万 x g 为5分钟在4° c, 转移水相到新的1.5 毫升管。
- 沉淀的 RNA。为此增加1/10 容量 3M NaOAc (pH 5.5), 1/100 容量糖原 (10 毫克/毫升) 和2.5 容量100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
- 聚 (A) mRNA 分离
- 离心 RNA 样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下旋转, 除去其余的乙醇与凝胶加载尖端, 空气干燥的颗粒5分钟。
- 从聚 (A) mRNA 分离试剂盒中溶解300μ l 的裂解/结合缓冲液中的颗粒。根据聚 (a) mrna 隔离试剂盒制造商的协议进行聚 (a) mrna 提取。
- 沉淀的 mRNA 样本增加1/10 卷的3米 NaOAc (pH 5.5), 1/100 体积的糖原 (10 毫克/毫升), 2.5 卷的100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
- mRNA 碎片
- 离心的 mRNA 样本在 2万 x g 为30分钟, 在4° c, 除去乙醇。向下旋转30秒, 将其余的乙醇与凝胶加载的尖端和空气干燥的颗粒5分钟。
- 重 mRNA 在18μ l 核糖核酸的水中, 加入2μ l 的 10x RNA 碎片缓冲。在94孵育5分钟。把管子转到冰上
- 沉淀通过增加1/10 容量 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 容量糖原 (10 毫克/毫升) 和2.5 容量100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
4. 磷酸
- 用 T4 核苷酸激酶治疗足迹和分裂的 mRNA 样本。为此, 离心样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下降速, 用凝胶加载尖端除去乙醇的其余部分。空气干燥颗粒5分钟。
- 重7.75 µL 水中的颗粒, 增加1µL 的 10x T4 核苷酸激酶缓冲, 1 µL 的 T4 核苷酸激酶 (1万 u/毫升), 和0.25 µL 的核糖核酸抑制剂 (20 u/µL)。在37° c 下孵育1小时。
- 选)预运行15% 尿素凝胶在180伏, 15 分钟使用1x 缓冲。
- 在每个脚印和 mRNA 样本中添加10µL 2X 尿素样品缓冲液至10µL。准备一个控制样本, 其中包含1µL 的10µM 上大小标记寡核苷酸 (32 nt), 1 µL 10 µM 低尺寸标记寡核苷酸 (28 nt), 8 µL 水, 和10µL 的2x 的尿素样本缓冲区的足迹样本。制备含有1µL 10 µM RNA 标记寡核苷酸 (63 nt), 9 µL 水, 10 µL 2x 的对照样品, 用于 mRNA 样品的尿素样品缓冲。
- 孵育样品和控制3分钟在75° c, 旋转下来, 在冰上放1分钟. 将每个样品装入15% 个尿素凝胶的2井, 分离 RNA 片断由凝胶电泳在 180 V 为 1 h。
- 用核酸凝胶染色 (在水中稀释 10,000x), 将凝胶染色5分钟, 免受光照。
- 使用蓝色光源 transilluminator, 在28和 32 nt 标记之间切割合适的带区, 用于脚印样本 (图 4A) 和 50-70 nt, 用于 mRNA 样本 (图 4B), 使用干净的刀片。冷冻聚丙烯酰胺凝胶件在-80 ° c 至少10分钟。
- 从聚丙烯酰胺凝胶中提取 RNA 如下。将凝胶件在70° c 处加热2分钟, 用一次性颗粒杵研磨凝胶。洗 RNA 与300µL 洗脱缓冲器 (20 毫米三 HCl pH 值 7.0, 2 毫米 EDTA), 增加1µL 核糖核酸抑制剂 (20 U 或µL) 和孵育在37° c 为 3 h。
- 离心样品在 1.2万 x g 为5分钟在4° c, 收集上清, 并且沉淀通过增加1/10 容量 NaOAc (pH 5.5), 1/100 容量糖原 (10 毫克/毫升) 和2.5 容量100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
5. 3 '-适配器结扎
- 离心的足迹和 mRNA 样本在 2万 x g 为30分钟在4° c, 除去乙醇。三十年代在最大转速下降速, 用凝胶加载的尖端除去乙醇的其余部分。空气干燥颗粒10分钟。
- 重4.75 µL 核酸水中的颗粒2µL 50% PEG8000, 1 µL 10X T4 rna 连接缓冲器, 1 µL 3 "-适配器 (100 ng/µL), 0.25 µL 核糖核酸抑制剂 (20 u/µL), 1 µL T4 rna 连接2截断 KQ (20万 u/毫升)。在16° c 的夜间孵育。
- 第二天早上, 通过添加0.5 µL 5 "-deadenylase (10 u/µL) 和0.5 µL 的 Rec J 酶 (10 u/µL) 直接到结扎反应, 消除适配器的过剩。孵育30分钟, 在30° c。
- 沉淀样品。为此, 添加30µL 核酸水, 1 µL 糖原 (10 毫克/毫升), 1/10 体积 NaOAc (pH 5.5), 2.5 卷100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
6. 反向转录
- 离心样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下降速, 用凝胶加载的尖端除去乙醇的其余部分。空气干燥颗粒10分钟。
- 重11.5 µL 核酸水中的颗粒, 加入0.5 µL 8 µM 反转转录底漆 (RT 底漆) 和1µL dNTP 混合 (10 毫米)。孵育5分钟在65° c, 在冰上的地方。
- 添加4µL 的5X 第一股链缓冲, 2 µL 0.1 M 的µL, 0.5 核糖核酸抑制剂 (20 u/µL), 0.5 µL 反转录酶 (200 u/µL)。孵育30分钟, 在48° c, 1 分钟在65° c, 5 分钟在80° c。
- 不沉淀和立即进行的水解 RNA, 增加0.8 µL 的2M 氢氧化钠, 孵化30分钟在98° c。添加0.8 µL 2M HCl, 以中和反应。
- 沉淀样品。
7. Circularization
- 离心样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下旋转, 除去其余的乙醇与凝胶加载尖端, 空气干燥的颗粒10分钟。
- 重16.75 µL 核酸水中的颗粒。添加2µL 的10x 单 DNA (ssDNA) 连接缓冲器, 1 µL 50 mM MnCl2, 0.25 µL ssDNA 连接 (100 U/µL)。孵育1小时, 在60° c, 10 分钟在80° c。不沉淀, 并贮存在-20 ° c 的 ssDNA 结扎反应产物。
8. PCR 文库扩增
- 在冰上工作的时候在 PCR 管中混合如下: 146 µL 核酸水, 2 µL 20 µM 前引物, 2 µL 20 µM 索引反向底漆, 40 µL 5x 高保真 DNA plymerase 缓冲器, 4 µL dNTPs (10 mM), 4 µL ssDNA 结扎反应产物, 2 µL 高保真 DNA 聚合酶。选择一个不同的索引反向底漆为每一个样品, 将多路复用排序。将 pcr 混合物中的50µL 分转化为4新的 pcr 管。
- 使用以下设置来执行 PCR 放大 (8、10、12、14) 不同的周期数:
1分钟 at 98 ° c 初始变性
8到14周期:
十五年代在94° c
5 s 在55° c
十年代在65° c
2分钟在65° c 最后的引伸 - 通过添加1/10 体积的3米 NaOAc (pH 5.5), 1/100 的糖原 (10 毫克/毫升), 和2.5 卷的100% 乙醇沉淀 PCR 产品。孵育在-20 ° c 至少1小时。
- 离心样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下旋转, 除去其余的乙醇与凝胶加载尖端, 空气干燥的颗粒。
- 重8µL 核酸水中的颗粒, 加入2µL 变性5x 核酸样品缓冲液。在1井变性8% 的凝胶中加载样品。用凝胶电泳分离 DNA 产物, 在150伏35分钟。作为一个控制, 准备一个样本, 其中包含0.5 µL 10 bp DNA 阶梯 (1 µg/µL), 7.5 µL 水, 和2µL 的变性5x 核酸样本缓冲区, 并运行在一个单独的通道的凝胶。
- 用核酸凝胶染色 (在水中稀释 10,000x), 将凝胶染色5分钟, 免受光照。使用蓝光 transilluminator, 削减约 150 bp 为足迹样本和大约 180 bp 的 mRNA 样本 (图 6) 与清洁刀片的波段。储存凝胶件在-80 ° c 至少10分钟。
- 将凝胶件在70° c 处加热2分钟, 用一次性颗粒杵研磨凝胶。洗 DNA 与300µL 的20毫米的三盐酸 pH 7.0, 并孵化在37° c 为 3 h。
- 离心样品在 1.2万 x g, 为5分钟在4° c, 收集上清, 并且沉淀通过增加1/10 容量 NaOAc (pH 5.5), 1/100 容量糖原 (10 毫克/毫升) 和2.5 容量100% 乙醇。孵育在-20 ° c 至少1小时。
- 离心样品在 2万 x g 为30分钟在4° c, 去除乙醇。三十年代在最大转速下旋转, 除去其余的乙醇与凝胶加载尖端, 空气干燥的颗粒。最后, 重了20µL 的核酸水库, 并进行了量化、质量控制和排序。
9. 图书馆量化和高通量测序
- 在发送样本进行排序之前, 确定 PCR 扩增库的产量和质量。足迹和 mRNA 排序库的代表性配置文件如图 7所示。PCR 扩增文库的预期规模是 148-152 bp 用于足迹样本, 170-190 bp 用于 mRNA 样本。
- 如果几个不同的条形码样本将被汇集在一起进行排序, 使用 qPCR-based 测序库定量化方法对库进行精确的量化。
- 以摩尔比率汇集图书馆。计算池的总体积为3µL x 总数量的样品要汇集。确定需要添加的每个库的容量, 以便库在摩尔比率中混合, 以达到池的 10 nM 最终浓度。将每个库的计算量添加到一个新的1.5 毫升管, 由移混合。加水以达到计算总容积。在-20 ° c 处存储汇集库。
- 在公司测序平台上运行 50 bp 单测序, 发送一个分的汇集库的排序。我们在一个单一的测序运行中例行地复用12样本, 每测序车道产生 ~ 2亿读数。
注意: 每个样本收集的足迹读数的最终数量取决于输入材料的数量和 rRNA 污染的程度。
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Representative Results
详细的管道的生物分析核糖体的剖析数据已经描述了以前的8,9。此外, 几个研究小组已经开发了生物信息学工具的差异基因表达分析和处理的测序数据, 这是特定的核糖体分析方法10,11,12 ,13,14,15,16,17,18。分析 Ribo Seq 数据的第一步是解并使用 Cutadapt 软件19修剪3的适配器序列 AGATCGGAAGAGCACACGTCT。然后顺序读取与编码 rna (如 rRNA 和 tRNA) 对齐, 使用领结20删除污染序列, 然后将不对齐的读取映射到酵母基因组。然后可以通过 HTseq 计数软件21评估每个基因的读取计数, 并使用 DESeq2 22识别差异表达的基因。
图 8显示了使用我们的协议获得的 hbs1Δ 23、24酵母删除突变体中的翻译定量分析的代表性结果。首先, 我们评估的数量和比例的读数, 对应的编码 RNA (如 rRNAs) 获得后, 序列足迹和 mRNA 库生成的野生型细胞和 hbs1Δ突变体。我们发现, 即使没有任何 rRNA 耗尽步骤 (下面讨论), 我们足迹库中所有顺序读取的50到60% 都对应于核糖体保护的足迹片段 (图 8A)。相比之下, 只有3% 的 rRNA 源片段在 mrna 库中被观察到, 证明聚 (A) mrna 的分离可以有效地消除 rRNA 读取。一起, 我们能够获得超过1000万足迹读取每个足迹样本通过排序2复制。为了评估图书馆生成的变异性和数据的重现性, 我们通常分析每个实验条件下至少两个独立的生物复制。足迹和 mRNA 样本库在匹配的样本 (图 8B) 之间具有皮尔逊相关系数 R ~ 0.99 的良好重现性。
除了评估在全基因组水平的蛋白质翻译水平, 核糖体的轮廓允许测量翻译效率的变化之间的实验条件3。为此, 分细胞裂解酶 (不经核糖核酸) 用于聚 (A) mRNA 的分离和 RNA 序列库的制备。由于足迹库和 rna seq 库都是在相同的受控条件下准备的, 可以追溯到每个单独的复制, Ribo 序列和 rna 序列数据集可以直接比较, 以确定由 mRNA 变化调节的基因转录, 翻译效率, 或由联合作用。为了确定在 hbs1Δ突变体的蛋白质翻译水平上或向下调控的基因, 我们通过将足迹 rpkm 值除以每个基因的 mRNA rpkm 来计算翻译效率的变化 (图 8C)。
图 1: Ribo-Seq 协议概述.整个协议可以在大约11天内执行。显示每个步骤的估计时间。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 蔗糖梯度的制备请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 代表蔗糖梯度剖面.(A)获得控制的蔗糖梯度剖面 (不处理核糖核酸 I) 样品。(B)为了提取核糖体保护的 RNA 片段, 在室温 (RT) 中用核糖核酸 I 处理1小时的细胞裂解。然后收集与 monosomal 峰值对应的分数以进行足迹提取。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: T4 核苷酸激酶治疗后获得的15% 聚丙烯酰胺凝胶的代表性图像.(A)在28和 32 nt 附近的切除凝胶切片的大小显示为脚印样本。(B)将 50-70 nt 的凝胶切片切割为 mRNA 样本。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 反转录后获得的10% 聚丙烯酰胺凝胶的代表性图像.(A)剪切上带 ~ 128 nt, 用于脚印样本, 对应于反转转录产物。(B)为 mRNA 样本 (上部带) 剪切大约 150-170 nt 的频带。较低的波段对应于 RT 底漆。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 聚丙烯酰胺凝胶纯化扩增文库.在8、10、12和14循环的图书馆扩增后, PCR 产物在变性8% 凝胶中得到了解决。全长足迹库的大小是 ~ 150 bp, 而 mRNA 库的大小是 ~ 170-190 bp. 避免不包含插入的下层带。
图 7: Bioanalyzer 分析.(A)有代表性的 Bioanalyzer 配置文件, 用于扩增足迹库。内存占用库的平均大小预计为148到 152 nt. (B)为 mRNA 样本获得的测序库的代表性 Bioanalyzer 剖面。mRNA 库的预期大小为 170-190 nt.请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 代表性结果.(A)野生型样本和 hbs1Δ突变体所获得的 mRNA、足迹和 rRNA 读取数。对野生型细胞和 hbs1Δ突变体进行了两种生物复制序列生成的读出次数的组合。(B)两个复制之间的足迹和 mRNA 丰度测量的重现性。指出皮尔逊相关系数 (R)。(C) hbs1Δ突变体的转录和平移变化。hbs1Δ的显著上调和下调调控基因根据其是否受 mRNA 转录、翻译效率或联合作用的影响而被分组。请单击此处查看此图的较大版本.
| 引 | 序列 | 索引 | ||||
| 3 ' 适配器 (100 ng/µL) | /5 rapp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3 ddc/ | |||||
| RT 底漆 | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| 正向 PCR 底漆 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| 索引入门1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| 索引入门2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| 索引入门3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| 索引入门4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| 索引入门5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| 索引入门6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
表 1: 3 ' 适配器和底漆序列。
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Discussion
Ribo-Seq 方法已成为一个强大的技术, 分析 mRNA 翻译在体内在全基因组的水平3。使用这种方法进行的研究, 允许 single-codon 的分辨率进行监测, 有助于我们理解翻译规则。尽管有其优点, Ribo 还是有几个局限性。核糖体 RNA (rRNA) 片段总是 co-purified 在核糖体保护的足迹的分离, 减少了有用的测序读数, 可以获得在 Ribo-Seq 实验9,25的产量。我们的数据表明, rRNA 的污染可能导致多达40-50% 的所有读取 (图 8)。克服这种限制的方法之一是增加测序深度。在对每个分析的样本进行所需的顺序读取次数之前, 应执行额外的序列排序。使用我们的协议编写的排序库分析表明, 每个足迹库可以获得超过500万的足迹读取, 当12样本在标准的 50 bp 单运行时, 在公司 HiSeq 2000 平台上进行复用。但是, 如果观察到 rRNA 的严重污染, 可以执行可选的 rRNA 删除步骤。
从脚印库中去除 rRNA 污染碎片的策略之一是使用化寡核苷酸的减色杂交, 如前所述8、26、27。另外, rRNA 污染的读取可以通过使用商业上可用的 rRNA 损耗套件来消除。为此, 研究人员可以从步骤5.4 中的纯化 3 "-适配器结扎的脚印碎片上执行 rRNA 损耗.在 rRNA 耗尽后, 足迹样本可以被沉淀并直接用于反向转录 (步骤6), 如协议中所述。
除了利用我们的协议中所描述的蔗糖梯度分馏法纯化 monosomes, 还开发了几种利用列纯化28和离心通过蔗糖坐垫的方法, 8 ,29。虽然这些方法可以加快足迹库的准备过程, 而且与蔗糖梯度分馏相比, 在技术上更不具有挑战性, 但它们不允许对纯化的 monosomes 和核酸的效率进行定性分析。消化步骤。最近, 核酸的选择已被证明对不同物种的核糖体保护 RNA 片段的纯化效率有影响30。当核糖核酸我在酵母细胞裂解有强健的活性时, 它的活性已经被证明对小鼠组织和果蝇中核糖体的完整性有影响。因此, 在对其他物种采用该协议时, 应优化核酸的选择和浓度。
另一个重要的考虑因素是使用翻译抑制剂。大多数核糖体轮廓的协议通常涉及用伸长抑制剂 (如放线菌或尖) 处理细胞, 以防止在细胞采集3过程中核糖体的流失。使用翻译抑制剂的一个限制是药物在细胞中逐渐扩散, 导致核糖体31的渐进抑制。此外, 药物不妨碍翻译的启动或终止。因此, 核糖体在起始密码子上不成比例地堆积, 并在停止子密码8,27,31中耗尽。为了限制这一工件, 我们选择了闪蒸冷冻的细胞在液氮和处理与放线菌在提取时的裂解缓冲区只。
尽管在各种物种中使用 Ribo 的报告数量相对较多, 但缺乏执行 Ribo 分析的标准化协议。因此, 不能直接比较由不同实验室生成的 Ribo Seq 数据。例如, 对已发表的核糖体分析数据集的比较发现, 研究结果中的差异很大32。这在一定程度上是由于该议定书在过去几年中得到了不断的改进。此外, 许多研究人员修改了核糖体分析协议, 以适应其研究或模型系统的特定需要9,25。进一步标准化核糖体分析协议以及数据分析和规范化, 可以防止某些实验偏差, 并确保在体内翻译的准确和可重现的量化。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院的资助, AG040191 和 AG054566 向 VML 提供了支持。这项研究是进行的, 而 VML 是一个遥远的研究赠款接受来自美国老龄研究联合会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
