Summary

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Published: December 21, 2017
doi:

Summary

Переводческая регулирование играет важную роль в элементе белка изобилия. Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для количественного анализа перевода в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Перевод мРНК на белки — сложный процесс, с участием нескольких слоев регулирования. Часто предполагается, что изменения в мРНК транскрипции отражают изменения в синтезе белка, но было отмечено много исключений. Недавно называемый рибосома профилирования (или Рибо-Seq) возник как мощный метод, который позволяет идентифицировать, с высокой точностью, какие регионы мРНК переводятся на белки и количественная оценка перевода на уровне генома всей. Здесь мы представляем обобщенных протокол для количественного определения генома общесистемной перевода с помощью Рибо-Seq в многообещающий дрожжей. Кроме того сочетая Рибо-Seq данных с мРНК изобилие измерений позволяет нам одновременно количественную оценку эффективности перевода тысяч мРНК стенограммы в том же образце и сравнить изменения этих параметров в ответ на экспериментальной манипуляции или в различных физиологических состояниях. Мы описываем подробный протокол для поколения рибосома контуры с помощью нуклеиназы пищеварение, изоляции нетронутыми рибосомы след комплексов через сахарозы градиента фракционирования и подготовки ДНК библиотек для глубокой последовательности вместе с соответствующей контроль качества, необходимые для обеспечения точного анализа в естественных условиях перевода.

Introduction

мРНК перевод – один из основных процессов в клетке, которая играет важную роль в регуляции экспрессии белков. Таким образом перевод мРНК жестко контролируется в ответ на различные внутренние и внешние физиологические стимулы 1,2. Однако механизмы регуляции поступательные остаются изученными. Здесь мы описываем протокол для количественного определения генома общесистемной перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования. Общая цель метода профилирования рибосома является изучение и количественно перевод конкретные мРНК условиях различных клеточных. Этот метод использует секвенирование нового поколения для количественного анализа рибосома размещение на протяжении всего генома и позволяет контролировать уровень белка синтеза в естественных условиях на один кодон резолюции 3,4. В настоящее время, этот метод обеспечивает наиболее передовые средства измерения уровня белка перевода и оказался полезным открытием инструментом предоставления информации, которые не могут быть выявлены путем других имеющихся в настоящее время методов, например microarrays или перевод состояния массива анализ (TSAA) 5. Как рибосомы, отчеты о комбинированных изменения в уровнях Стенограмма и трансляционная вывода профилирования она также обеспечивает намного большую чувствительность, по сравнению с другими методами.

Этот подход основан на глубокой sequencing рибосомы защищенные мРНК фрагменты 3. В процессе перевода протеина, защищать рибосомы ~ 28 части nt мРНК (так называемый следы) 6. Определяя последовательность фрагментов рибосомы защищенный, Рибо-Seq можно сопоставить положение на переведенные мРНК рибосомы и определить, какие регионы мРНК, вероятно, активно воплощаться в протеин 3,7. Кроме того мы можем количественно измерить перевод мРНК, подсчитывая количество следов, которые присоединяются к стенограмме заданный мРНК.

Для того, чтобы изолировать фрагменты защищенных рибосомы, lysates клетки первоначально рассматриваются с ингибитор перевода в стойло рибосомы, следуют рибонуклеазы пищеварение. В то время как свободные мРНК и часть переведенных мРНК не защищены рибосомы деградировали, рибонуклеаза, фрагменты мРНК рибосомы защитой могут быть восстановлены очищая нетронутыми рибосомы след комплексов. Эти следы мРНК затем преобразуется в библиотеку cDNA и анализируемой глубокую последовательности (рис. 1). Параллельно для профилирования рибосомы нетронутыми мРНК извлекается из того же образца и виртуализации. Сравнивая уровень перевода определенных Рибо-Seq с мРНК изобилие измерения, мы можем выявить гены, которые специально вверх или вниз регулируемой на уровне перевода и рассчитать эффективность перевода мРНК на уровне генома всей. В то время как протокол, описанные в этой статье является специфичным для дрожжей, она должна быть также полезной для исследователей, которые будут пытаться установить протокол Рибо-Seq в других системах.

Protocol

1. извлечь подготовка Полоска штаммов дрожжей из замороженных запасов для одной колоний на YPD пластины (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% раствор глюкозы и 2% агар). Инкубируйте пластины при 30 ° C в течение 2 дней. Прививок дрожжей от YPD пластины (использование одного колония) в 15 мл Y…

Representative Results

Подробные трубопроводов для анализа bioinformatic рибосомы, Профилирование данных были описаны ранее 8,9. Кроме того несколько исследовательских групп разработали Биоинформатика инструменты для дифференциальной ген выражение анализа и обра…

Discussion

Рибо-Seq подход стал мощной технологии для анализа мРНК перевод в естественных условиях в геноме общесистемного уровня 3. Исследования с использованием этого подхода, который позволяет следить за перевод с одного кодон резолюции, способствовала нашего понимания транс?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов AG040191 и AG054566 в VML. Это исследование было проведено в то время как VML — Кавалер Афар исследовательский грант от американской Федерации за старение научных исследований.

Materials

0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
10X TBE buffer Invitrogen AM9863
10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
Cryogrinder Biospec product 3110BX
Cycloheximide RPI C81040-5.0
Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
Glycogen Invitrogen AM9510
Gradient fractionation system Brandel BR-184X
High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
RNA fragmentation buffer NEB E6186A
RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
Sucrose RPI S24060-5000.0
SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
Thermal cycler Bio-Rad 1851148
Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
UV monitor Bio-Rad 7318160
Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
  3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
  5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
  8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
  10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
  11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
  12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
  13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
  14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
  15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
  16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
  17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
  18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
  24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
  28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
  29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
  30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
  31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
  32. O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

Play Video

Cite This Article
Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

View Video