Summary
변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.
Abstract
단백질으로 mRNA의 번역 규칙의 여러 레이어를 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 그것은 종종 가정 mRNA 녹음 방송에 있는 변화 단백질 합성, 변화를 반영 하지만 많은 예외 관찰 되었습니다. 최근, 리보솜 프로 파일링 (또는 Ribo-Seq) 이라는 기술을 mRNA의 어떤 영역 단백질 및 게놈 넓은 수준에서 번역의 정량화로 번역 된다 높은 정확도 식별, 수 있도록 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 여기, 선물이 신진 효 모에 Ribo-Seq를 사용 하 여 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 일반화 된 프로토콜. 또한, mRNA 풍부 측정 Ribo-Seq 데이터를 결합 수 있습니다 동일한 샘플에서 mRNA 사본의 수천의 번역 효율을 동시에 계량 하 여 비교 실험에 대 한 응답에서 이러한 매개 변수에서 변경 조작 또는 다른 생리 적인 상태에서. 우리는 리보솜 발자국 nuclease 소화, 자당 그라데이션 분류를 통해 그대로 리보솜-풋프린트 단지의 고립과 DNA 라이브러리의 준비를 사용 하 여 적절 한 함께 깊은 시퀀싱에 대 한의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 설명 vivo에서 번역의 정확한 분석을 위해 필요한 품질 제어 합니다.
Introduction
mRNA의 번역 단백질 식의 규칙에 있는 중요 한 역할 셀에 기본적인 프로세스 중 하나입니다. 따라서, mRNA 번역은 밀접 하 게 다른 내부 및 외부 생리 자극 1,2에 대 한 응답 제어 됩니다. 그러나, 변환 규칙의 메커니즘 understudied 남아 있습니다. 여기, 우리는 리보솜 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 리보솜 프로 파일링 기법의 전반적인 목표는 연구 하 고 계량 다른 세포질 조건 하에서 특정 한 mRNAs의 번역입니다. 이 기술은 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 게놈에 걸쳐 리보솜 인 양적 분석을 하며 단백질 합성에서 vivo에서 단일 codon 해상도 3,4속도 모니터링 현재,이 방법은 단백질 번역의 수준을 측정 하는 가장 고급 방법을 이며 다른 현재 사용할 수 있는 기술, 예를 들면 microarrays에 의해 밝혀질 수 없는 정보를 제공 하는 유용한 검색 도구 입증 또는 번역 상태 배열 분석 (TSAA) 5. 성적 수준 및 변환 출력에 결합 된 변화에 대 한 보고서를 프로 파일링 하는 리보솜으로 그것은 또한 다른 방법에 비해 훨씬 더 큰 감도를 제공 합니다.
이 방법은 mRNA 파편 리보솜 보호 3의 깊은 시퀀싱을 기반으로 합니다. 리보솜 단백질 번역 동안 보호 ~ 28 nt 부분의 mRNA (발자국 이라고 함) 6. 리보솜 보호 조각의 순서를 결정 하 여 Ribo-Seq 번역된 mRNA에 리보솜의 위치를 지도 하 고 적극적으로 단백질 3,7로 번역 될 것 mRNA의 어떤 영역을 식별할 수 있습니다. 또한, 우리 양적 발자국을 주어진된 mRNA 사본 수를 계산 하 여 mRNA의 번역을 측정할 수 있습니다.
리보솜 보호 조각을 분리 하기 위하여 세포 lysates 처음 ribonuclease 소화 다음 리보솜에 번역 억제제 처리 됩니다. 반면 무료 mRNA, 리보솜에 의해 보호 되지 않는 번역 된 mRNAs의 일부는 ribonuclease에 의해 타락, 리보솜 보호 mRNA 파편 그대로 리보솜-풋프린트 단지 정화 하 여 복구할 수 있습니다. 이 mRNA 발자국 cDNA 도서관으로 변환 그리고 깊은 시퀀싱 (그림 1)에 의해 분석 됩니다. 리보솜 프로 파일링을 병렬로 그대로 mRNA는 동일한 샘플에서 추출 하 고 시퀀스. MRNA 풍부 측정 Ribo-Seq로 식별 하는 번역의 수준을 비교 하 여 특별히 업 또는 다운-규제 번역의 수준에는 유전자를 식별 하 고 게놈 넓은 수준에서 mRNA의 번역 효율을 계산할 수 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜은 효 모에 대 한 구체적인, 하는 동안 그것은 유용 해야 한다 또한 연구자 다른 시스템에서 Ribo-Seq 프로토콜을 설정 하려고 합니다.
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Protocol
1. 추출 준비
- (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar) YPD 접시에 단일 식민지를 위한 냉동된 주식에서 행진 효 모 변종. 2 일 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어.
- YPD 플레이트 (사용 하나의 식민지)에서 효 모 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 YPD 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당)의 15 mL에 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에 (200-250 rpm)을 떨고와 성장
- 메 마른 플라스 크 2 L에에서 YPD 매체의 500 mL로 문화를 희석 되도록 OD600 < 0.1. OD600 까지 3-5 h 30 ° C에서 흔들어와 효 모 세포 성장 = 0.5 (중간 로그 단계).
- 유리 홀더 필터 어셈블리를 사용 하 여 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 통해 필터링 하 여 세포를 수집 합니다. 주걱, 액체 질소, 플래시 동결와 펠 릿을 긁 고-80 ° c.에 저장 고정 된 펠 릿의 예상된 크기는 ~ 0.2-0.5 g.
주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 신선한 세포의 용 해 버퍼를 준비 (20 mM Tris HCl pH 8.0, 140 m m KCl, 5 mM MgCl2, 100 μ g/mL cycloheximide, 0.5 m m DTT, 1% 트라이 톤 X-100) 사용 직전 얼음에 계속.
- 3 크롬 강철 구슬 (3.2 m m) 1.8 mL 스테인레스 스틸 튜브에 넣어. 액체 질소에 미리 식히십시오 언된 펠 릿을 추가, 실리콘 고무 모자와 함께 커버. 10에 대 한 cryogrinding에 의해 샘플을 균질 4200 rpm; s 10 회 반복 한다. 적어도 10 액체 질소에 튜브를 진정 각 라운드 사이 s.
참고: 그것은 항상 샘플 동결을 유지 하는 것이 중요입니다. - Pipetting으로 잘 혼합, 세포의 용 해 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 새로운 1.5 mL 튜브에 전송 합니다.
- 4 ° c.에서 5 분 20000 x g에서 원심 분리기 얼음에 작업 하는 동안 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 많은 mRNA 격리에 대 한 새로운 1.5 mL 튜브에 lysate의 100 μ를 전송. 진행 즉시 RNA 격리 또는 플래시 동결에 액체 질소에 관. 측정 OD260 , lysate의 나머지의 발자국 추출 하는 데 사용 하 고 플래시는 액체 질소에 튜브를 고정 합니다. -80 ° c.에 lysates 저장
2. 발자국 추출
- 자당 기온 변화도의 준비
- 50%, 40%, 30%, 20%, 그리고 10% 자당 그라데이션 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 8.0, 140 m m KCl, 5 mM MgCl2, 100 μ g/mL cycloheximide, 0.5 m m DTT)에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
- 13.2 mL 얇은 벽 polyallomer 튜브의 하단에 준비 된 50% 자당 버퍼의 2.2 mL를 플라스틱 및 동결-80 ° C (그림 2)에서 10 분에 대 한 솔루션. 레이어 고정된 50% 자당 버퍼, 위에 40% 자당 버퍼의 2.2 mL 그리고-80 ° c.에서 10 분 동안 동결 서로 꼭대기 버퍼링 같은 지침, 레이어 30%, 20%, 그리고 10% 자당. 레이어 링 하는 동안 기포 하는 피하십시오. 사용까지-80 ° C에서 그래디언트를 유지. 자당 기온 변화도 실험 전에 적어도 하루를 준비 하 고-80 ° c.에 저장 한다
- Nuclease 소화
- 자당 기온 변화도 4 ° c.에 실험 전날 밤을 녹여
- 세포 lysate (발자국 샘플) 얼음에 녹여 세포 lysate 새로운 1.5 mL 튜브에 50 OD260 단위를 포함 하는 약 수를 전송 하 고 신선한 세포의 용 해 버퍼를 추가 최대 1 mL. 나머지-80 ° c.에 lysate 저장 추가 10 μ RNase 나 (100 U/μ)와 머리 전면 발뒤꿈치 회전에 부드러운 회전으로 실 온에서 1 h를 품 어.
- (선택 사항) 4 ° C에서 5 분 20000 x g에서 샘플을 명확히 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 복구.
- Ultracentrifugation
- 부드럽게 lysate 샘플 10-50% 자당 기온 변화도의 상단에 레이어.
- Ultracentrifuge는 polyallomer 튜브 SW-41 Ti로 터를 사용 하 여 3 h 4 ° C에서 210000 x g (35000 rpm)에서 합니다.
- 그라데이션 분류 시스템 설정
- 구성 요소를 켜고 30 분 이상 워밍업을 UV 모니터를 허용.
- 디지털 레코더 소프트웨어를 사용 하 여 컴퓨터에 소프트웨어를 시작,-0.01을 1 그래프의 스케일링 한계를 설정.
- 체이스 솔루션 (20 mM Tris HCl pH 8.0, 140 m m KCl, 5 mM MgCl2, 60% 자당) 주사기를 채우십시오, 주사기와 정 맥 내의 모든 기포를 제거 합니다.
- RNase 무료 물으로 채워진 ultracentrifuge 튜브를 설치 합니다. 피어스는 정 맥 튜브 두 검은 자국을 볼 수 있습니다 때까지. 1 mL/min에서 주사기 펌프를 시작 합니다.
- 물 흐름 셀을 통해 전달, 조정 0 기준선 UV 모니터에 "자동 0" 버튼을 누릅니다. UV 모니터의 감도 설정 "2.0 AU". 안정적인 기준선 설정 된 후 주사기 펌프를 중지 합니다. 체이스 솔루션을 복구 하 고 ultracentrifuge 튜브를 제거 합니다.
- Monosome 절연
- 설치 하 고 자당 기온 변화도 포함 하는 ultracentrifuge 튜브 피어스. 1 mL/min에서 주사기 펌프를 시작, 1 mL 분수 모니터링254 값을 수집 합니다. 분수 한 관으로 80 monosome 피크를 나타내는 수영장, 얼음 (그림 3)에서 계속.
- 체이스 솔루션 흐름 셀을 도달 하면, 주사기 펌프를 중지 합니다. 체이스 솔루션을 복구 하 고 ultracentrifuge 튜브를 제거 합니다. 2.5.1 단계에서 시작 하는 샘플의 나머지 부분에 대 한 분류를 반복 합니다.
참고: 끝나면, RNase 무료 물 30 mL 이상으로 분류 시스템을 청소. 철저 하 게 씻어 튜브, 주사기와 따뜻한 물으로 모든 이동식 구성 요소. - 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에 0.5 mL 원심 필터 (100 kDa MWCO)를 통해 분수를 필터링 하 고 통해 흐름, 볼륨은 반복 < 100 μ. 자료 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase 억제제)의 400 μ를 추가 합니다. 믹스, pipetting으로 품 어에 얼음 10 분 하 고 새로운 컬렉션 튜브로 단위를 전송. 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고 흐름 통해 수집 합니다.
- 발자국 조각 정화
- 흐름을 통해 포함 발자국 RNA 조각 새로운 1.5 mL 튜브, 추가 20% (게 1%의 최종 농도), SDS pipetting으로 혼합의 20 μ를 전송 합니다.
- 산의 1 볼륨을 추가-페 놀: 클로 프롬 (pH 4.5), 소용돌이 10 s.
주의: 산-페 놀: 클로 프롬은 독성, 흡입과 피부 접촉을 피하기 위해. - 5 분 동안 65 ° C에서 열, 1 분 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 12000 x g에서 샘플에 대 한 얼음에, 새로운 1.5 mL 튜브에 수성 단계 (위)를 전송 합니다.
- NaOAc (pH 5.5), 1/100 양의 글 리 코겐 (10mg/mL), 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 하 여 발자국 RNA 파편을 침전.
3. 많은 mRNA 추출
- 총 RNA 추출
- 해 동 세포 lysate (총 RNA 샘플) 얼음에의 약 100 μ 수, 20% (게 1%의 최종 농도), SDS pipetting으로 혼합의 20 mM Tris HCl pH 7.0과 20 μ의 300 μ를 추가 합니다.
- 1 볼륨 (400 μ) 산의 추가-페 놀: 클로 프롬 (pH 4.5)와 소용돌이 10 s.
- 5 분 동안 65 ° C에서 열, 1 분 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 12000 x g에서 샘플에 대 한 얼음에, 새로운 1.5 mL 튜브에 수성 단계 (위)를 전송 합니다.
- 두 번째 페 놀 추출을 수행 합니다. 산의 1 볼륨을 추가-페 놀: 클로 프롬 (pH 4.5), 5 분, 65 ° C에서 10 미 열에 대 한 소용돌이 1 분 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 12000 x g에서 샘플에 대 한 얼음에, 새로운 1.5 mL 튜브에 수성 단계를 전송.
- RNA 침전. 이 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 양의 글 리 코겐 (10mg/mL), 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 합니다. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
- 많은 mRNA 격리
- 20000 x g 4 ° C에서 30 분 동안에 RNA 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁, 에탄올의 나머지 부분을 제거 하 고 공기 건조 5 분 펠 릿.
- 많은 mRNA 격리 키트에서 세포/바인딩 버퍼의 300 μ에 펠 릿을 디졸브. 많은 mRNA 격리 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 많은 mRNA 추출을 진행 합니다.
- 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 양의 글 리 코겐 (10mg/mL), 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 하 여 mRNA 샘플을 침전. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
- mRNA 조각화
- 20000 x g 4 ° C에서 30 분 동안에 mRNA 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 초 아래로 회전, 젤 로드 에탄올의 나머지를 제거 팁 및 공기 건조 5 분 펠 릿.
- RNase 무료 물 18 μ에서 mRNA를 resuspend, RNA 조각화 버퍼 x 10의 2 μ를 추가 합니다. 94 ° c.에서 5 분을 품 어 얼음 튜브를 전송 합니다.
- 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 양의 글 리 코겐 (10mg/mL), 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 하 여 침전. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
4입니다. dephosphorylation
- 발자국과 T4 polynucleotide 키와 조각난된 mRNA 샘플 취급. 이 위해, 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에서 샘플 원심, 에탄올을 제거. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 로드 팁 젤 에탄올의 나머지를 제거. 공기 건조 5 분 펠 릿.
- 7.75 µ L의 물에 펠 릿을 resuspend, 10 x T4 polynucleotide 키 버퍼의 1 µ L, 1 µ L의 T4 polynucleotide 키 니 아 제 (10000 U/mL), 및 0.25 µ L RNase 억제제 (20 U / µ L)의 추가. 37 ° c.에 1 시간을 품 어
- (선택 사항) 미리 1 x TBE 버퍼를 사용 하 여 15 분 동안 180 V 15 %TBE 요소 젤을 실행 합니다.
- 각 발자국과 mRNA 샘플의 10 µ L을 X TBE 요소 샘플 버퍼 2의 10 µ L를 추가 합니다. 10 µ M 위 크기 마커 oligonucleotide의 1 µ L을 포함 하는 컨트롤 샘플 준비 (32 nt), 10 µ M 낮은 크기 마커 oligonucleotide의 1 µ L (28 nt), 8 µ L 물, 그리고 발자국 샘플 TBE 요소 샘플 버퍼 x 2의 10 µ L. 10 µ M RNA 마커 oligonucleotide의 1 µ L을 포함 하는 컨트롤 샘플 준비 (63 nt), 9 µ L 물, 그리고 mRNA 샘플 TBE 요소 샘플 버퍼 x 2의 10 µ L.
- 샘플 및 컨트롤 75 ° C에서 3 분 incubate, 스핀 다운, 얼음에 넣어 1 분 2 웰 스 15 %TBE 요소 젤의 180 V 1 h에서 젤 전기 이동 법에 의해 별도 RNA 조각으로 각 샘플을 로드.
- 핵 산 젤 얼룩 (물에 희석 10000 x)으로 5 분 동안 젤 얼룩, 빛 으로부터 보호 합니다.
- 28 그리고 32 nt 마커 발자국 샘플 (그림 4A)와 약 사이 적절 한 밴드를 잘라 블루 빛 transilluminator를 사용 하 여 50-70 nt mRNA에 대 한 깨끗 한 면도날으로 (그림 4B)을 샘플링 합니다. 적어도 10 분 동안-80 ° C에서 polyacrylamide 젤 조각 고정.
- 다음과 같이 polyacrylamide 젤에서 RNA 추출 합니다. 2 분 동안 70 ° C에서 젤 조각 열, 일회용 펠 릿 pestles를 사용 하 여 젤을 갈기. 300 µ L 차입 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.0, 2 mM EDTA)와 RNA elute 1 µ L RNase 억제제 (20 U / µ L), 추가 하 고 37 ° C 3 h에서 품 어.
- 4 ° C에서 5 분 동안 12000 x g에서 샘플 원심, 상쾌한, 수집 하 고 글 리 코겐 (10mg/mL)의 1/100 볼륨 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨 추가 NaOAc (pH 5.5), 양의 1/10에 의해 침전. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
5. 3' 어댑터 결 찰
- 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에 발자국과 mRNA 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁과 에탄올의 나머지를 제거. 공기 건조 10 분 펠 릿.
- Nuclease 무료 물 4.75 µ L에 펠 릿을 resuspend, PEG8000, 10 X T4 RNA 리가 버퍼의 1 µ L, 1 µ L 3' 어댑터 (100 ng / µ L), RNase 억제제 (20 U / µ L), T4 RNA 리가 2의 1 µ L의 0.25 µ L의 50%의 2 µ L 자를 KQ (200000 U/mL). 16 ° c.에서 밤새 품 어
- 다음날 아침, 결 찰 반응에 직접 0.5 µ L의 deadenylase (10 U / µ L)-5' exonuclease Rec J (10 U / µ L)의 0.5 µ L를 추가 하 여 어댑터의 과잉을 제거 합니다. 30 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 샘플을 침전. 이 위해, nuclease 무료 물 30 µ L, 1 µ L glycogen (10mg/mL), NaOAc (pH 5.5)의 1/10 볼륨 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
6. 반전 녹음 방송
- 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에서 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁과 에탄올의 나머지를 제거. 공기 건조 10 분 펠 릿.
- 펠 릿 nuclease 무료 물 11.5 µ L에서 resuspend, 8 µ M 반전 녹음 방송 뇌관 (뇌관 RT)의 0.5 µ L와 dNTP 믹스 (10mm) 1 µ L를 추가 합니다. 65 ° C에서 5 분 동안 incubate, 얼음에.
- 첫 번째 가닥 버퍼, 0.1 m M DTT, RNase 억제제 (20 U / µ L), 역전사 (200 U / µ L)의 0.5 µ L의 0.5 µ L의 2 µ L X 5의 4 µ L를 추가 합니다. 48 ° C, 65 ° C, 80 ° c.에 5 분에서 1 분에서 30 분 동안 품 어
- 하지 침전 및 2 M NaOH의 0.8 µ L을 추가 하 여 RNA의 가수분해에 즉시 진행, 98 ° c.에 30 분을 품 어 0.8 µ 2 M L 추가 중화 반응에 HCl.
- 샘플을 침전.
7입니다. circularization
- 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에서 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁, 에탄올의 나머지 부분을 제거 하 고 공기 건조 10 분 펠 릿.
- 펠 릿 nuclease 무료 물 16.75 µ L에서 resuspend. 단일 가닥 DNA (ssDNA) 리가 버퍼, 1 µ L ssDNA 리가의 50 mM MnCl2, 0.25 µ L의 x 10의 2 µ L 추가 (100 U / µ L). 60 ° C, 80 ° c.에서 10 분에서 1 시간에 품 어 침전, 그리고-20 ° c.에 ssDNA 결 찰 반응 제품 저장
8. PCR 라이브러리 확대
- 동안 얼음에 섞어 PCR 튜브에 다음: 146 µ L nuclease 무료 물, 20 µ M 앞으로 뇌관, 20 µ M 리버스 인덱스 뇌관의 2 µ L, 고 충실도 DNA plymerase 버퍼, dNTPs (10 m m)의 4 µ L, ssDNA 결 찰 반응 제품의 4 µ L x 5의 40 µ L의 2 µ L의 그리고 높은-충실도 DNA 중 합 효소의 2 µ L. 시퀀싱에 대 한 다중화는 각 샘플에 대 한 다른 인덱스 반전 뇌관을 선택 합니다. 4 새로운 PCR 튜브에 PCR 혼합의 50 µ L 약 수를 전송 합니다.
- 다양 한 수 (8, 10, 12, 14) 사이클의 PCR 증폭을 수행 다음 설정을 사용 하 여:
1 분에 98 ° C 초기 변성
8 ~ 14 주기:
15 s 94 ° C에서
5 s 55 ° C에서
10 s 65 ° C에서
65 ° C 최종 확장에서 2 분 - 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 양의 글 리 코겐 (10mg/mL), 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨의 1/10 볼륨을 추가 하 여 PCR 제품을 침전. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
- 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에서 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁, 에탄올의 나머지 부분을 제거 하 고 공기 건조는 펠 릿.
- 펠 릿 nuclease 무료 물 8 µ L에서 resuspend, 비 변성 시키기 5 핵 산 샘플 버퍼 x 2 µ L를 추가 합니다. 1 비 변성 시키기 8 %TBE 젤의 샘플을 로드 합니다. 150 V 35 분에 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 제품을 구분 합니다. 컨트롤, 10 bp DNA 사다리 (1 µ g / µ L), 7.5 µ L 물, 그리고 비 변성 시키기 5 핵 산 샘플 버퍼, x 2 µ L의 0.5 µ L을 포함 하는 샘플을 준비 하 고 젤의 별도 레인에서 실행 합니다.
- 핵 산 젤 얼룩 (물에 희석 10000 x)으로 5 분 동안 젤 얼룩, 빛 으로부터 보호 합니다. 약 150 밴드를 잘라 블루 빛 transilluminator를 사용 하 여 발자국 예제 및 약 180 bp bp를 깨끗 한 면도날으로 mRNA 샘플 (그림 6). 적어도 10 분 동안-80 ° C에서 젤 조각 저장 합니다.
- 2 분 동안 70 ° C에서 젤 조각 열, 일회용 펠 릿 pestles를 사용 하 여 젤을 갈기. 20 mM Tris HCl pH 7.0의 300 µ L와 DNA elute 고 37 ° C 3 h에서 품 어.
- 12000 x g, 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심, 상쾌한, 수집 하 고 글 리 코겐 (10mg/mL)의 1/100 볼륨 및 100% 에탄올의 2.5 볼륨 추가 NaOAc (pH 5.5), 양의 1/10에 의해 침전. 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 품 어.
- 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g에서 샘플 원심, 에탄올을 제거 합니다. 30 아래로 회전 최대 속도로 s 젤 로드 팁, 에탄올의 나머지 부분을 제거 하 고 공기 건조는 펠 릿. 마지막으로, nuclease 무료 물 20 µ L에서 라이브러리를 resuspend 그리고 정량화, 품질 관리 및 시퀀싱을 진행.
9. 라이브러리 정량화 및 높 처리량 연속
- 시퀀싱에 대 한 샘플을 보내기 전에 PCR 증폭 라이브러리의 품질과 수확량을 결정 합니다. 발자국 및 mRNA 시퀀싱 라이브러리에 대 한 대표적인 프로 파일은 그림 7에 표시 됩니다. PCR 증폭 라이브러리의 예상된 크기는 발자국 샘플, 148-152 혈압 및 mRNA 샘플 170-190 혈압.
- 바코드는 다른 경우와 여러 샘플 시퀀싱 풀링됩니다, 정량 기반 시퀀싱 라이브러리 정량화 분석 결과 사용 하 여 라이브러리의 정확한 정량화를 수행 합니다.
- 아데닌 비율에 라이브러리를 풀. 3 µ L x 풀링할 샘플의 총 수로 수영장의 전체 볼륨을 계산 합니다. 라이브러리는 풀의 10 nM 최종 농도 달성 하기 위해 아데닌 비율에 혼합을 추가 하는 각 라이브러리의 볼륨을 결정 합니다. 새로운 1.5 mL 튜브에 각 라이브러리의 계산 된 볼륨을 추가, pipetting으로. 계산 된 전체 볼륨을 달성 하기 위해 물을 추가 합니다. -20 ° c.에 풀링된 라이브러리를 저장
- 50 bp 싱글-엔드 시퀀싱 Illumina 시퀀싱 플랫폼에서 실행을 사용 하 여 시퀀싱 할 풀링된 라이브러리의 약 수를 보냅니다. 우리는 정기적으로 실행, 어떤 수익률 단일 연속 12 샘플 다중화 ~ 200 백만 시퀀싱 레인 당 읽습니다.
참고: 각 샘플 당 수집 발자국 읽기의 마지막 번호 입력된 자료의 수량 및 rRNA 오염 수준에 따라 달라 집니다.
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Representative Results
데이터를 프로 파일링 하는 리보솜의 bioinformatic 분석에 대 한 자세한 파이프라인 되었습니다 8,9위에서 설명한. 또한, 여러 연구 그룹 차동 유전자 표정 분석 및 시퀀싱 데이터를 프로 파일링 방법 10,11,12 리보솜에 대 한 특정의 처리를 위한 생물 정보학 도구 개발 ,13,14,15,,1617,18. Ribo-Seq 데이터의 분석의 첫 번째 단계는 디 멀티플렉싱 하 고 3' 어댑터 시퀀스 AGATCGGAAGAGCACACGTCT Cutadapt 소프트웨어 19를 사용 하 여 트리밍. 다음 시퀀싱 읽기 비 코딩 RNAs, rRNA와 tRNA, Bowtie 20 을 사용 하 여 오염 시퀀스를 제거 하는 것에 대 한 정렬 되 고 정렬 되지 읽기 다음 효 모 게놈에 매핑됩니다. 유전자 당 수 다음 HTseq 수 소프트웨어 21에 의해 평가 될 수 있다 및 차동 표현한 유전자 DESeq2 22를 사용 하 여 식별 됩니다.
그림 8 hbs1Δ 23,24 효 모 삭제 돌연변이 우리의 프로토콜을 사용 하 여 가져온 그의 번역의 정량 분석의 대표적인 결과 보여줍니다. 첫째, 우리는 수 및 비 코딩 RNA (예: rRNAs) 얻은 시퀀싱 발자국과 mRNA 라이브러리 야생-타입 세포와 hbs1Δ 돌연변이 생성 후에 해당 하는 읽기의 비율 평가. 우리는 심지어 rRNA 고갈 단계 없이 (아래에 설명), 50에서 우리의 발자국 발자국 리보솜 보호 조각 (그림 8A)에 해당 하는 라이브러리에서에서 모든 시퀀스 읽기의 60%,을 발견. 반면, rRNA 파생 된 파편의 3%만 보여주는 많은 mRNA 격리 rRNA 읽기의 효과적인 제거를 허용 하는 mRNA 라이브러리에서 관찰 되었다. 함께, 우리 발자국 샘플의 각각에 대 한 이상의 10 백만 발자국 읽기를 얻을 수 있었다 의해 시퀀싱 2 복제. 라이브러리 생성의 변화는 데이터의 재현성을 평가, 우리는 일반적으로 각 실험 조건 당 적어도 2 개의 독립적인 생물 복제를 분석 합니다. 발자국과 mRNA 샘플 라이브러리 표시 피어슨 상관 계수 R와 좋은 재현성 ~ 0.99 사이의 일치 샘플 (그림 8B).
게놈 넓은 수준에서 단백질 번역 수준을 평가, 이외에 리보솜 프로 파일링 실험 조건 3사이 번역 효율 변화를 측정 수 있습니다. 이 위해, (ribonuclease 치료 하지 않을) 세포 lysate의 한 약 수 많은 mRNA 고립과 RNA-Seq 라이브러리의 준비에 사용 됩니다. 발자국 라이브러리와 RNA-Seq 라이브러리 같은 제어 조건 하에서 준비 하 고 각 개별 복제에 추적 될 수 있다, 때문에 Ribo-Seq와 RNA-Seq 데이터 집합 비교 될 수 있다 직접 변화 mRNA에 의해 통제 되는 유전자를 식별 전사, 번역 효율, 또는 결합 된 효과. 업 또는 다운-통제 hbs1Δ 돌연변이에서 단백질 번역의 수준에서 구체적으로 유전자를 식별 하려면 우리 유전자 (그림 8C)의 각각에 대 한 mRNA rpkm에 의해 발자국 rpkm 값을 나누어 번역 효율에서 변경 계산 합니다.
그림 1: Ribo-Seq 프로토콜의 개요. 약 11 일에서 전체 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 각 단계에 대 한 예상된 시간이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 자당 기온 변화도의 준비 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 자당 그라데이션 프로필. (A) 자당 그라데이션 프로필 획득 제어 (치료 하지 않을 RNase 나) 샘플. (B) 보호 하는 리보솜 RNA 파편을 추출 하기 위해 세포 lysates 처리 됩니다 RNase와 실 온 (RT)에서 1 시간을 위한 나. Monosomal 피크에 해당 하는 분수 다음 발자국 추출 수집 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: T4 polynucleotide 키 니 아 제 치료 후 얻은 15 %polyacrylamide 젤의 대표 이미지. (A) 28 32 nt 주위 삭제 젤 조각의 크기 발자국 샘플에 대 한 표시 됩니다. (B) 에 대 한 젤 조각을 잘라 50-70 nt mRNA 샘플에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 10 %polyacrylamide 젤의 대표 이미지 반전 녹음 방송 후 얻은. (A) 위 밴드를 잘라 ~ 128 반전 녹음 방송의 제품에 해당 하는 발자국 샘플에 대 한 nt. (B) 주위에 밴드를 잘라 mRNA 샘플 (위 밴드) 150-170 nt. 낮은 밴드 RT 뇌관에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: PCR 증폭 라이브러리의 Polyacrylamide 젤 정화. PCR 제품 라이브러리 증폭의 8, 10, 12, 및 14 주기 후 얻은 해결 했다 비 변성 시키기 8 %TBE 젤에.전체 길이 발자국 라이브러리의 크기는 ~ 150 bp, mRNA 라이브러리의 크기는 ~ 170-190 bp. 않도록 삽입을 포함 하지 않는 낮은 밴드.
그림 7: Bioanalyzer 분석. PCR 증폭 발자국 라이브러리의 (A) 대표 Bioanalyzer 프로필. 발자국 라이브러리의 평균 크기 152 148에서 될 것으로 예상 된다 nt. (B) 대표 Bioanalyzer 프로필 시퀀싱 라이브러리의 mRNA 샘플에 대 한 취득. MRNA 라이브러리의 예상된 크기는 170-190 nt. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 대표적인 결과. 야생-타입 샘플 및 hbs1Δ 돌연변이 획득 하는 mRNA, 발자국, 그리고 rRNA 읽기의 (A) 수입니다. 읽기 2 생물 복제 시퀀싱에 의해 생성 된 결합된 수 야생-타입 세포와 hbs1Δ 돌연변이 대 한 표시 됩니다. (B) 2 사이 발자국과 mRNA 풍부 측정의 재현성을 복제합니다. 피어슨 상관 관계 계수 (R) 표시 됩니다. (C) Transcriptional와 hbs1Δ 돌연변이에서 변환 변경. 크게 hbs1Δ에서 위로 및 아래로 유전자 여부 그들은 영향을 받는 변화 mRNA 전사, 번역 효율에에서 의해 또는 결합 된 효과 따라에서 그룹화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 | 시퀀스 | 인덱스 | ||||
| 3' 어댑터 (100 ng / µ L) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| RT 뇌관 | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| 앞으로 PCR 뇌관 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| 인덱스 뇌관 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| 인덱스 뇌관 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| 인덱스 뇌관 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| 인덱스 뇌관 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| 인덱스 뇌관 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| 인덱스 뇌관 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
표 1: 3 ' 어댑터 및 뇌관 시퀀스.
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Discussion
Ribo-Seq 접근 mRNA 번역에서 vivo에서 게놈 넓은 레벨 3에서 분석을 위한 강력한 기술로 떠오르고 있다. 연구 모니터링 단일 codon 해상도 번역에서는이 방법을 사용 하는 변환 규칙에 대 한 우리의 이해에 기여 했다. 자사의 장점에도 불구 하 고 Ribo-Seq는 몇 가지 제한이 있습니다. 리보솜 RNA (rRNA) 조각 리보솜 보호 발자국 Ribo-Seq 실험 9,25에서 얻을 수 있는 유용한 연속 읽기의 수확량 감소의 격리 중 공동 순화 항상 있습니다. 우리의 데이터 rRNA 오염 모든 읽기 (그림 8)의 40-50%에 기여할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 이 한계를 극복 하는 방법 중 하나는 시퀀싱 깊이 증가 하는. 시퀀싱의 추가 라운드 분석된 샘플의 각 연속 읽기의 필요한 수를 얻을 때까지 수행 되어야 한다. 우리의 프로토콜을 사용 하 여 준비 하는 시퀀싱 라이브러리의 분석 때 12 샘플 표준 50 bp 싱글-엔드 Illumina HiSeq 2000 플랫폼에서 실행 함께 다중화는 5 백만 이상의 발자국 읽기 각 발자국 라이브러리를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 그러나, rRNA와 중요 한 오염 관찰 되는 경우 옵션 rRNA 제거 단계를 수행할 수 있습니다.
RRNA 오염 발자국 라이브러리에서 파편을 제거 하는 전략 중 하나는 앞에서 설명한 8,26,27biotinylated oligonucleotides와 마이너스 교 잡을 사용 하는. 또는, rRNA 읽기 오염 상용 rRNA 고갈 키트를 사용 하 여 제거할 수 있습니다. 이 위해, 연구원은 단계에서 정화 3'-어댑터-출혈 발자국 조각에 rRNA 고갈 수행할 수 있습니다 5.4. 다음 rRNA 고갈, 발자국 샘플 시 켰 던 고 프로토콜에 설명 된 대로 반전 녹음 방송 ( 6단계)에 대 한 직접 사용 될 수 있습니다.
우리의 프로토콜에서 설명 하는 자당 그라데이션 분류를 사용 하 여 monosomes의 정화, 이외에 여러 가지 방법이 개발 되었습니다 열 기반 정화 28 및 자당 쿠션 8 통해 ultracentrifugation를 활용 하는 ,29. 동안 이러한 메서드 발자국 라이브러리 준비의 과정을 가속화할 수 있다 보다 적게 기술적으로 도전적인 자당 그라데이션 분별 법에 비해, 그들은 허용 하지 않습니다 정화 monosomes의 질적 분석과 nuclease의 효율성 소화 단계입니다. 최근, nuclease 선택 종 30에 RNA 조각 리보솜 보호의 정화 효율에 영향을 보여줘 왔다. 동안 RNase 나 효 모 세포 lysates, 그것의 활동에서에서 강력한 활동에는 과일 파리에서 뿐만 아니라 마우스 조직에 리보솜의 무결성에 영향을 보여줘 왔다. 따라서, 선택과 nuclease의 농도 최적화 되어야 합니다 다른 종에이 프로토콜을 채택 하는 때.
또 다른 중요 한 고려 사항은 번역 억제제의 사용 이다. 리보솜 프로 파일링에 대 한 대부분의 프로토콜은 일반적으로 셀 3수확 중 리보솜의 실행을 방지 하기 위하여 신장 억제제와, cycloheximide 또는 harringtonine, 같은 세포를 치료 포함 됩니다. 번역 억제제의 사용의 제한 사항 중 하나는 마약 확산 점차적으로 셀에 리보솜 31의 진보적인 억제 유도입니다. 또한, 번역 개시 또는 종료 마약 억제 하지 않습니다. 결과적으로, 리보솜은 어울리지 않게 시작 codon에 축적 하 고 정지 codon 8,,2731고갈. 이 유물을 제한 하기 위하여 우리는 플래시 하기로 액체 질소에 세포를 동결 하 고 세포의 용 해 버퍼만 추출 시 cycloheximide와 치료.
다양 한 종에서 Ribo-Seq를 활용 하는 보고서의 비교적 큰 숫자에도 불구 하 고 Ribo-Seq 분석을 수행 하기 위한 표준화 된 프로토콜은 부족 합니다. 결과적으로, 다른 실험실에 의해 생성 된 Ribo-Seq 데이터는 직접 비교 될 수 없다. 예를 들어 데이터 집합을 프로 파일링 하는 게시 된 리보솜의 비교 연구 32사이의 결과에 상당한 차이가 나타났다. 이 부분에 지속적인 향상 되었습니다 지난 몇 년 동안 진화 하는 프로토콜로 예정 이다. 또한, 많은 연구원은 그들의 연구 또는 모델 시스템 9,25의 특정 요구에 그것을 채택 하는 프로토콜을 프로 파일링 하는 리보솜 수정. 더 프로 파일링 프로토콜 뿐만 리보솜 표준화 데이터 분석 및 표준화, 것 허용 일부 실험 편견을 방지 하 고 vivo에서 번역의 정확 하 고 재현성 정량화를 보장.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 AG040191 및 AG054566 VML에 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 이 연구는 VML 노화 연구를 위한 미국 연맹에서 멀리 연구 보조금 받는 동안 실시 됐다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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