Summary

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Published: December 21, 2017
doi:

Summary

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Abstract

MRNA tercüme proteinler düzenleme birkaç kat içeren karmaşık bir işlemdir. Bu kez değişiklikleri protein sentezi mRNA transkripsiyon değişiklikleri yansıtmak, ama pek çok özel durumlar gözlenmiştir varsayılır. Son zamanlarda, ribozom profil oluşturma (Ribo Seq) adında bir teknik veya kimlik, mRNA hangi bölgelerinde protein ve miktar çeviri genom geneli düzeyinde çevriliyor yüksek doğrulukla sağlar güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Burada, genom çapında miktar Ribo Seq mayası içinde kullanarak çeviri için Genelleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, mRNA bereket ölçümleri ile Ribo Seq veri birleştirerek aynı anda mRNA transkript aynı örnek içinde binlerce çeviri verimliliğini ölçmek ve bu parametreler deneysel cevaben değişiklikleri karşılaştırmak için bize izin verir işlemler veya farklı fizyolojik devletler. Biz üretimi ile birlikte uygun derin sıralama için nükleaz sindirim, bozulmamış ribozom-ayak izi kompleksleri Sükroz degrade ayırma ile yalıtım ve hazırlık DNA kütüphanelerinin kullanarak ribozom ayak izi için detaylı bir protokol tarif Kalite denetimleri doğru analiz vivo içinde çeviri sağlamak için gerekli.

Introduction

Hücredeki protein ifade yönetmelikte önemli bir rol oynayan temel işlemlerden biri mRNA çevrilmiştir. Bu nedenle, mRNA çeviri sıkı farklı iç ve dış fizyolojik uyaranlar 1,2yanıt olarak kontrol edilir. Ancak, translasyonel düzenleme mekanizmaları çöküşünde kalır. Burada, biz genom çapında miktar mayası çeviri için protokol ribozom profil oluşturma açıklanmaktadır. Ribozom profil çıkarma tekniği genel amacı çalışma ve çeşitli hücresel koşullarda belirli mRNA’ların çeviri ölçmek etmektir. Bu teknik ribozom doluluk genom boyunca kantitatif analiz için yeni nesil sıralama kullanır ve protein sentezi vivo içinde tek kodon çözünürlük 3,4oranı izleme sağlar. Şu anda, bu yöntem protein çeviri düzeyde ölçmenin en gelişmiş araçlar sağlar ve mevcut diğer tekniklerle, örneğin microarrays ortaya bilgi veren yararlı keşif aracı olduğu ispatlanmıştır veya Çeviri Durumu dizi analizi (TSAA) 5. Transkript düzeyleri ve çevirim çıkış birleştirilmiş değişiklikleri ile ilgili raporlar profil oluşturma ribozom da diğer yöntemlerine göre çok daha fazla hassasiyet sağlar.

Bu yaklaşım mRNA parçaları 3ribozom korumalı derin sıralama üzerinde temel alır. Ribozomlarda protein çeviri sırasında korumak ~ 28 nt bölümlerini (ayak izleri olarak adlandırılır) mRNA 6. Ribozom tarafından korunan parçaları dizisi belirleyerek, Ribo Seq ribozomlara çevrilmiş mRNA üzerinde konumunu harita ve mRNA hangi bölgelerinde aktif protein 3,7olarak tercüme edilebilir muhtemeldir tanımlamak. Buna ek olarak, biz kantitatif mRNA tercümesi verilen bir mRNA transkript hizalamak ayak izleri sayısını sayarak ölçebilirsiniz.

Ribozom tarafından korunan parçaları ayırmak için hücre lysates başlangıçta ribonükleaz sindirim tarafından takip ribozomlara oyalamak için bir çeviri önleyici ile tedavi edilir. Ücretsiz mRNA ve ribozomlar tarafından korunmamasına çevrilmiş mRNA’ların bölümlerini ribonükleaz tarafından bozulmuş ise, ribozom korumalı mRNA parçaları sağlam ribozom-ayak izi kompleksleri arındırıcı tarafından elde edilebilir. Bu mRNA ayak sonra cDNA kitaplığa dönüştürülür ve derin sıralama (şekil 1) tarafından analiz. Ribozom profil oluşturma için paralel olarak sağlam mRNA aynı örneğinden ayıklanmış ve sıralı. MRNA bereket ölçümleri ile Ribo-Seq tarafından tanımlanan çeviri düzeyini karşılaştırarak, biz özellikle up – veya aşağı-düzenlenmiş çeviri düzeyde olan genlerin tanımlamak ve mRNA genom geneli düzeyinde verimliliğini çeviri hesaplamak. Bu makalede açıklanan protokol için Maya belirli olmakla birlikte, aynı zamanda diğer sistemlerde Ribo Seq Protokolü kurmaya çalışacağız araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

Protocol

1. hazırlık ayıklamak YPD plakaları (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz ve %2 agar) çizgi Maya suşları tek kolonileri için dondurulmuş hisse senedi üzerinden. Tabak 30 ° C’de 2 gün kuluçkaya. YPD orta (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz) 50 mL konik santrifüj tüpü 15 mL içine Maya YPD plaka (kullanım bir koloni) aşılamak ve gecede 30 ° C’de (200-250 devir/dakika) sallayarak ile büyümek Kültür YPD ortamda bir 2 L steril şişe 500 mL içine oranında s…

Representative Results

Veri profil oluşturma ribozom bioinformatic çözümlenmesi için detaylı boru hatları-si olmak be daha önce açıklanan 8,9. Buna ek olarak, birçok araştırma grupları farklı gen ifade analizi ve ribozom yöntemi 10,11,12 profil oluşturma için özel sıralama veri işleme için Biyoinformatik araçlarını geliştirdik ,<…

Discussion

Ribo Seq yaklaşım mRNA çeviri vivo içinde genom çapında düzey 3analizi için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Çeviri ile tek-kodonu kararlılık izleme sağlar, bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar translasyonel yönetmelik anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Avantajları rağmen Ribo Seq bazı sınırlamaları vardır. Ribozomal RNA (rRNA) her zaman sırasında yalıtım Ribo Seq deneyler 9,25

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser sağlık hibe AG040191 ve AG054566 için VML Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. VML yaşlanma araştırma Amerikan Federasyonu AFAR araştırma bursu alıcıdan iken bu araştırma yapılmıştır.

Materials

0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
10X TBE buffer Invitrogen AM9863
10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
Cryogrinder Biospec product 3110BX
Cycloheximide RPI C81040-5.0
Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
Glycogen Invitrogen AM9510
Gradient fractionation system Brandel BR-184X
High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
RNA fragmentation buffer NEB E6186A
RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
Sucrose RPI S24060-5000.0
SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
Thermal cycler Bio-Rad 1851148
Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
UV monitor Bio-Rad 7318160
Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
  3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
  5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
  8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
  10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
  11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
  12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
  13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
  14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
  15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
  16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
  17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
  18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
  24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
  28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
  29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
  30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
  31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
  32. O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

Play Video

Cite This Article
Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

View Video