Summary
Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traduzione di mRNA in proteine è un processo complesso che coinvolge diversi strati di regolamento. Spesso si presume che cambiamenti nella trascrizione del mRNA riflettono cambiamenti nella sintesi proteica, ma sono state osservate molte eccezioni. Recentemente, una tecnica chiamata ribosoma profilatura (o Ribo-Seq) è emerso come un potente metodo che permette l'identificazione, con alta precisione, quali regioni di mRNA vengono tradotti in proteine e quantificazione della traduzione a livello di genoma. Qui, presentiamo un protocollo generalizzato per la quantificazione del genoma di traduzione utilizzando Ribo-Seq in lievito. Inoltre, combinando Ribo-Seq dati con misure di abbondanza del mRNA permette di quantificare contemporaneamente l'efficienza della traduzione di migliaia di trascrizioni del mRNA nello stesso campione e confrontare le modifiche a questi parametri in risposta a sperimentale manipolazioni o in diversi stati fisiologici. Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione delle orme di ribosoma tramite digestione nucleasi, isolamento dei complessi intatti ribosoma-impronta tramite frazionamento gradiente di saccarosio e la preparazione delle librerie di DNA per sequenziamento profondo insieme appropriato controlli di qualità necessari per garantire l'accurata analisi della traduzione in vivo .
Introduction
traduzione del mRNA è uno dei processi fondamentali nella cellula, che svolge un ruolo importante nella regolazione dell'espressione della proteina. Di conseguenza, la traduzione degli mRNA è strettamente controllato in risposta a diversi stimoli fisiologici interni ed esterni 1,2. Tuttavia, i meccanismi di regolazione traduzionale rimangono Zito. Qui, descriviamo il protocollo per la quantificazione del genoma della traduzione nel lievito gemmante dal ribosoma profilatura. L'obiettivo generale della tecnica di profilatura del ribosoma è studiare e quantificare la traduzione di specifici mRNA sotto diverse condizioni cellulari. Questa tecnica utilizza sequenziamento di nuova generazione per analizzare quantitativamente l'occupazione del ribosoma in tutto il genoma e permette di monitorare il tasso di proteine sintesi in vivo al singolo codone risoluzione 3,4. Attualmente, questo metodo fornisce i mezzi più avanzati di misurare i livelli di traduzione di proteine e ha dimostrato di essere uno strumento di scoperta utile fornire informazioni che non possono essere rivelati da altre tecniche attualmente disponibili, ad esempio microarrays o Traduzione stato matrice analisi (TSAA) 5. Come ribosoma profilatura report sui cambiamenti combinati nei livelli della trascrizione e uscita traslazionale, fornisce anche sensibilità molto maggiore rispetto ad altri metodi.
Questo approccio si basa sul sequenziamento profondo del ribosoma-protetto mRNA frammenti 3. Durante la traduzione di proteine, i ribosomi proteggono ~ 28 porzioni di nt del mRNA (chiamato tracce) 6. Determinando la sequenza dei frammenti ribosoma-protetto, Ribo-Seq può mappa la posizione dei ribosomi su mRNA tradotta e identificare quali regioni del mRNA sono probabili essere attivamente tradotto in proteina 3,7. Inoltre, possiamo misurare quantitativamente la traduzione di mRNA contando il numero di impronte che si allineano a una determinata trascrizione di mRNA.
Al fine di isolare i frammenti ribosoma-protetto, lisati cellulari sono inizialmente trattati con un inibitore di traduzione di stallo i ribosomi seguiti da digestione di ribonucleasi. Considerando che libero mRNA e porzioni dei mRNAs tradotta non protetti dai ribosomi sono degradate da ribonucleasi, i frammenti di mRNA ribosoma-protetti possono essere recuperati da purificare complessi intatti ribosoma-impronta. Queste impronte di mRNA sono quindi convertite in cDNA biblioteca e analizzate mediante sequenziamento profondo (Figura 1). In parallelo alla profilatura del ribosoma, mRNA intatto viene estratta dallo stesso campione e sequenziato. Confrontando il livello di traduzione identificato da Ribo-Seq con misure di abbondanza del mRNA, possiamo identificare i geni che sono specificamente up - o down-regolato a livello della traduzione e calcolare l'efficienza della traduzione del mRNA a livello del genoma. Mentre il protocollo descritto in questo articolo è specifico per il lievito, dovrebbe essere anche utile per i ricercatori che cercano di stabilire il protocollo di Ribo-Seq in altri sistemi.
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Protocol
1. Estrarre la preparazione
- Ceppi di lievito di striscia dagli stock congelati per singole colonie su piastre YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, glucosio di 2% e 2% agar). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 giorni.
- Inoculare il lievito da una piastra YPD (uso una singola Colonia) in 15 mL di terreno YPD (Estratto di lievito 1%, 2% di peptone, 2% di glucosio) in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e crescere durante la notte con agitazione (200-250 giri/min) a 30 ° C.
- Diluire cultura in 500 mL di mezzo YPD in una beuta sterile 2L, di modo che il OD600 < 0.1. Crescere le cellule di lievito con agitazione a 30 ° C per 3-5 h fino al OD600 = 0.5 (Mid-registro fase).
- Raccogliere le cellule filtrando attraverso filtri a membrana 0,45 μm utilizzando un sistema filtrante di vetro titolare. Raschiare il pellet con una spatola, freeze flash in azoto liquido e conservare a-80 ° C. La dimensione prevista del pellet congelato è ~ 0,2 - 0,5 g.
Attenzione: L'azoto liquido è estremamente bassa temperatura; indossare una protezione appropriata. - Preparare un tampone di lisi fresco (20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloesimmide di 100 μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) immediatamente prima dell'uso, tenere il ghiaccio.
- Messi 3 Perline in acciaio al cromo (3,2 mm) in un tubo di acciaio inox di 1,8 mL. Pre-raffreddare in azoto liquido e aggiungere pellet congelati, coprire con un tappo di gomma in silicone. Omogeneizzare il campione di cryogrinding per 10 s a 4200 giri/min; ripetere 10 volte. Raffreddare il tubo in azoto liquido per almeno 10 s tra ogni round.
Nota: È importante mantenere sempre il campione congelato. - Aggiungere 1 mL di tampone di Lisi, miscelare bene pipettando. Trasferire in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Centrifuga a 20.000 x g per 5 min a 4 ° C. Mentre si lavora sul ghiaccio, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. Trasferire 100 µ l di lisato una nuova provetta da 1,5 mL per l'isolamento di mRNA di poli (a). Procedere immediatamente all'isolamento del RNA o congelamento flash il tubo in azoto liquido. Misura OD260 del resto del lisato, che verrà utilizzato per l'estrazione di impronta e flash congelare i tubi in azoto liquido. Memorizzare i lisati a-80 ° C.
2. impronta estrazione
- Preparazione delle pendenze del saccarosio
- Preparare le soluzioni per il 50%, 40%, 30%, 20% e 10% di saccarosio in gradienti tampone (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloesimmide di 100 μg/mL, 0,5 mM DTT).
- Pipettare 2,2 mL di preparato 50% saccarosio tampone alla parte inferiore del tubo polyallomer 13,2 mL a parete sottile e congelare la soluzione per 10 min a-80 ° C (Figura 2). Poi strato 2,2 mL di tampone di saccarosio di 40% in cima il buffer di saccarosio 50% congelati e congelare per 10 min a-80 ° C. Seguendo le stesse istruzioni, strato 30%, poi il 20% e 10% saccarosio buffer in cima di ogni altro. Evitare di fare bolle d'aria durante la stratificazione. Mantenere le pendenze a-80 ° C fino all'utilizzo. Le pendenze del saccarosio devono essere preparate con almeno un giorno prima dell'esperimento e conservate a-80 ° C.
- Digestione di nucleasi
- Scongelare i gradienti di saccarosio la notte prima di esperimenti a 4 ° C.
- Scongelare il lisato (impronta campione cellulare) sul ghiaccio. Trasferire un'aliquota di cella lysata contenente 50 OD260 unità per una nuova provetta da 1,5 mL e aggiungere Buffer di lisi di fresco fino a 1 mL. Conservare il restante lisato a-80 ° C. Aggiungere 10 μL di RNAsi ho (100 U/μL) e Incubare 1h a temperatura ambiente con delicata rotazione su un rotore di testa-sopra-tacchi.
- (Opzionale) Chiarire i campioni a 20.000 x g per 5 min a 4 ° C e recuperare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Ultracentrifugazione
- Delicatamente strato lisati campioni alla parte superiore di un gradiente di saccarosio di 10-50%.
- Ultracentrifuga il polyallomer tubi a 210.000 x g (35.000 giri/min) a 4 ° C per 3 h utilizzando SW-41 Ti rotore.
- Confi gurazione di sistema gradiente frazionamento
- Attivare i componenti e consentire al monitor di UV di warm-up per almeno 30 min.
- Se utilizzando un registratore digitale software, avviare il software sul computer, è possibile impostare limiti di scala del grafico a -0,01 e 1.
- Riempire la siringa con la soluzione di Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% di saccarosio), rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno della siringa e la cannula.
- Installare un tubo di ultracentrifuga riempito con acqua RNAsi-libera. Forare il tubo con la cannula fino a due segni neri possono essere visto. Avviare la pompa a siringa a 1 mL/min.
- Come l'acqua passa attraverso la cella di flusso, premere il pulsante di "Azzeramento automatico" sul monitor UV per regolare la linea di base a 0. Impostare la sensibilità del monitor UV per "2.0 AU". Dopo una linea di base stabile è stato istituito, arrestare la pompa a siringa. Recuperare la soluzione di Chase e rimuovere il tubo ultracentrifuga.
- Isolamento monosome
- Installare e forare il tubo ultracentrifuga contenente il gradiente di saccarosio. Avviare la pompa a siringa a 1 mL/min, raccogliere le frazioni di 1 mL monitoraggio un valori di254 . Piscina frazioni rappresenta l'apice di monosome anni ' 80 in una provetta, tenere il ghiaccio (Figura 3).
- Una volta che Chase soluzione raggiunge la cella di flusso, fermare la pompa a siringa. Recuperare Chase soluzione e rimuovere il tubo ultracentrifuga. Ripetere il frazionamento per il resto dei campioni partendo dal punto 2.5.1.
Nota: Al termine dell'operazione, pulire il sistema di frazionamento con almeno 30 mL di acqua RNAsi-libera. Lavare accuratamente la tubazione, la siringa e tutti i componenti rimovibili con acqua calda. - Filtrare le frazioni attraverso filtri centrifughi di 0,5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e scartare il flusso continuo, ripetere fino a quando il volume è < 100 μL. Aggiungere 400 μL di tampone a rilascio (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, inibitore di 40 U/mL RNasi). Mix di pipettaggio, Incubare in ghiaccio 10 min e l'unità di trasferimento in una nuova provetta di raccolta. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e raccogliere il flusso continuo.
- Purificazione del frammento di impronta
- Trasferire i flusso-attraverso contenente impronta RNA frammenti di tubo un nuovo 1,5 mL, aggiungere 20 μL di 20% SDS (a una concentrazione finale dell'1%), Miscelare pipettando.
- Aggiungere 1 volume di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5), vortex per 10 s.
Attenzione: L'acido-fenolo: cloroformio è tossico, evitare il contatto con la pelle e per inalazione. - Scaldare a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, trasferire la fase acquosa (in alto) per una nuova provetta da 1,5 mL.
- Precipitare frammenti di RNA di impronta con l'aggiunta di 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%.
3. poli (a) mRNA estrazione
- Estrazione di RNA totale
- Scongelare un'aliquota di 100 μL di lisato cellulare (campione diRNA totale ) sul ghiaccio, aggiungere 300 μL di 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e 20 μL di 20% SDS (a una concentrazione finale dell'1%), Miscelare pipettando.
- Aggiungere 1 volume (400 µ l) di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5) e vortex per 10 s.
- Scaldare a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, trasferire la fase acquosa (in alto) per una nuova provetta da 1,5 mL.
- Eseguire una seconda estrazione del fenolo. Aggiungere 1 volume di acido-fenolo: cloroformio (pH 4,5), vortexare per 10 s. calore a 65 ° C per 5 minuti, mettere il ghiaccio per 1 min. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, la fase acquosa di trasferimento in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Precipitare il RNA. Per questo è necessario aggiungere 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
- Isolamento di mRNA di poli (a)
- Centrifugare i campioni di RNA a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet per 5 min.
- Dissolva la pallina in 300 μL di tampone di lisi/associazione dal kit di isolamento del mRNA di poli (a). Procedere all'estrazione del mRNA di poli (a) secondo il protocollo del produttore kit isolamento mRNA poli (a).
- Precipitare i campioni di mRNA mediante l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
- frammentazione di mRNA
- Centrifugare i campioni di mRNA a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 sec, rimuovere il resto dell'etanolo con un gel-caricamento punta e asciugare all'aria il pellet per 5 min.
- Risospendere mRNA in 18 μL di acqua RNAsi-libera, aggiungere 2 μL di tampone di frammentazione di RNA 10x. Incubare per 5 minuti a 94° C. Tubo al ghiaccio di trasferimento.
- Precipitare con l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
4. defosforilazione
- Trattamento di impronta e frammentato campioni di mRNA con chinasi di polinucleotide T4. Per questo, centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con un suggerimento di caricamento del gel. Asciugare all'aria il pellet per 5 min.
- Risospendere il pellet in 7.75 µ l di acqua, aggiungere 1 µ l di buffer di 10 x T4 polinucleotide chinasi, 1 µ l della chinasi di polinucleotide T4 (10.000 U/mL) e 0,25 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l). Incubare 1h a 37 ° C.
- (Opzionale) Pre-corsa un gel di TBE-urea 15% a 180 V utilizzando 1 x TBE buffer per 15 min.
- Aggiungere 10 µ l di tampone TBE-urea: 2x a 10 µ l di ciascun campione Footprint e mRNA. Preparare un campione di controllo contenente 1 µ l di 10 del oligonucleotide di marcatore di dimensione superiore µM (32 nt), 1 µ l di 10 µM inferiore dimensione marcatore del oligonucleotide (28 nt), 8 µ l acqua e 10 µ l di tampone TBE-urea per campioni di impronta: 2x. Preparare un campione di controllo contenente 1 µ l di 10 del oligonucleotide di marcatore del RNA di µM (63 nt), 9 µ l acqua e 10 µ l di tampone TBE-urea per campioni di mRNA: 2x.
- Incubare i campioni e controlli 3 min a 75 ° C, rotazione verso il basso, mettere il ghiaccio per 1 min carico di ciascun campione in 2 pozzetti del gel 15% TBE-urea, frammenti di RNA separati mediante elettroforesi in gel a 180 V per 1 h.
- Macchia del gel per 5 min con una macchia di gel di acido nucleico (10.000 x diluito in acqua), proteggere dalla luce.
- Utilizzando un transilluminatore luce blu, tagliato la banda adeguata tra 28 e 32 marcatori di nt per impronta i campioni (Figura 4A) e circa 50-70 nt per mRNA campioni (Figura 4B) con una lama di rasoio pulita. Congelare i pezzi di gel di poliacrilammide a-80 ° C per almeno 10 min.
- Estrarre RNA da gel di poliacrilammide come segue. Il calore pezzi gel a 70 ° C per 2 min, macinare il gel utilizzando pellet monouso Pestelli. Eluire RNA con 300 µ l di tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), aggiungere 1 inibitore di RNAsi µ l (20 U / µ l) e incubare a 37 ° C per 3 h.
- Centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e precipitare aggiungendo 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
5. 3'-adattatore legatura
- Centrifugare i campioni di mRNA e impronta a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento. Asciugare all'aria il pellet per 10 min.
- Risospendere il pellet in 4.75 µ l di acqua priva di nucleasi, 2 µ l di 50% PEG8000, 1 µ l di 10 X T4 RNA ligasi tampone, 1 µ l di 3'-adattatore (100 ng / µ l), 0,25 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 1 µ l di ligasi T4 RNA 2 troncata KQ (200.000 U/mL). Incubare per una notte a 16 ° C.
- La mattina successiva, rimuovere l'eccesso di adattatore aggiungendo 0,5 µ l di 5'-deadenylase (10 U / µ l) e 0,5 µ l di exonuclease J Rec (10 U / µ l) direttamente alla reazione di legatura. Incubare per 30 min a 30 ° C.
- Precipitare i campioni. Per questo, aggiungere 30 µ l di acqua priva di nucleasi, glicogeno di 1 µ l (10 mg/mL), 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
6. trascrizione inversa
- Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento. Asciugare all'aria il pellet per 10 min.
- Risospendere il pellet in 11,5 µ l di acqua priva di nucleasi, aggiungere 0,5 µ l delle 8 µM trascrizione inversa primer (RT) e 1 µ l di miscela del dNTP (10 mM). Incubare per 5 minuti a 65 ° C, posto sul ghiaccio.
- Aggiungere 4 µ l di 5 X primo buffer strand, 2 µ l di 0.1 M DTT, 0,5 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 0,5 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l). Incubare per 30 min a 48 ° C, 1 min a 65 ° C, 5 min a 80 ° C.
- Non precipitare e procedere immediatamente all'idrolisi di RNA, con l'aggiunta di 0,8 µ l di NaOH M 2, incubare per 30 minuti a 98 ° C. Aggiungere 0,8 µ l 2M HCl per neutralizzare la reazione.
- Precipitare i campioni.
7. circularization
- Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet per 10 min.
- Risospendere il pellet in 16.75 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 2 µ l di tampone di single-stranded DNA (ssDNA) ligasi, 1 µ l di 50mm MnCl2, 0,25 µ l di ssDNA ligasi 10x (100 U / µ l). Incubare per 1 h a 60 ° C, 10 min a 80 ° C. Non precipitare e conservare il prodotto di reazione di legatura ssDNA a-20 ° C.
8. PCR biblioteca amplificazione
- Mentre lavoro su ghiaccio, mescolare in una provetta PCR i seguenti: 146 µ l di acqua priva di nucleasi, 2 µ l di 20 µM Forward primer, 2 µ l di primer Reverse indicizzati di 20 µM, 40 µ l di 5 x ad alta fedeltà del DNA plymerase buffer, 4 µ l di dNTP (10 mM), 4 µ l di prodotto di reazione di legatura ssDNA e 2 µ l di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Scegliere un diverso indicizzati Reverse primer per ogni campione che verrà essere multiplexati per il sequenziamento. Trasferire un'aliquota di 50 µ l della miscela PCR in 4 nuove provette per PCR.
- Eseguire l'amplificazione di PCR con numero variabile di cicli (8, 10, 12, 14) utilizzando le seguenti impostazioni:
1 min a 98 ° C denaturazione iniziale
da 8 a 14 cicli:
15 s a 94 ° C
5 s a 55 ° C
10 s a 65 ° C
2 min a 65 ° C estensione finale - Precipitare il prodotto PCR con l'aggiunta di 1/10 di volume di 3 M NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
- Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet.
- Risospendere il pellet in 8 µ l di acqua priva di nucleasi, aggiungere 2 µ l di non-denaturante dell'acido nucleico sample buffer 5x. Caricare l'esempio su 1 bene di un gel TBE 8% non-denaturante. Separare i prodotti di DNA mediante elettroforesi in gel a 150 V per 35 min. Come controllo, preparare un campione contenente 0,5 µ l di 10 bp DNA ladder (1 µ g / µ l), 7,5 µ l acqua e 2 µ l di non-denaturante dell'acido nucleico sample buffer 5x ed eseguire su una corsia separata del gel.
- Macchia del gel per 5 min con una macchia di gel di acido nucleico (10.000 x diluito in acqua), proteggere dalla luce. Utilizzando un transilluminatore luce blu, tagliare la banda intorno 150 bp per campioni di impronta e circa 180 bp per campioni di mRNA (Figura 6) con una lama di rasoio pulito. Conservare i pezzi di gel a-80 ° C per almeno 10 min.
- Il calore pezzi gel a 70 ° C per 2 min, macinare il gel utilizzando pellet monouso Pestelli. Eluire il DNA con 300 µ l di 20 mM Tris-HCl a pH 7.0 e incubare a 37 ° C per 3 h.
- Centrifugare il campione a 12.000 x g, per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e precipitare aggiungendo 1/10 di volume di NaOAc (pH 5,5), volume 1/100 di glicogeno (10 mg/mL) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare a-20 ° C per almeno 1 h.
- Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C, eliminare l'etanolo. Rotazione verso il basso 30 s a velocità max, rimuovere il resto dell'etanolo con una punta di gel-caricamento e asciugare all'aria il pellet. Infine, risospendere le librerie in 20 µ l di acqua priva di nucleasi e procedere alla quantificazione, controllo qualità e sequenziamento.
9. Biblioteca quantificazione e High-throughput sequenziamento
- Prima di inviare i campioni per il sequenziamento, determinare la resa e la qualità delle librerie di PCR-amplificato. Profili rappresentativi per impronta e mRNA sequenziamento librerie sono mostrati nella Figura 7. La dimensione prevista della biblioteca PCR-amplificato è 148-152 bp per campioni di impronta e 170-190 bp per campioni di mRNA.
- Se diversi campioni con differenti codici a barre saranno riuniti per la sequenza, eseguire accurata quantificazione delle librerie usando un'analisi di quantificazione biblioteca qPCR di sequenziamento.
- Piscina le librerie nei rapporti equimolare. Calcolare il volume totale della piscina come 3 µ l x numero totale di campioni da mettere in comune. Determinare il volume di ogni libreria che deve essere aggiunto in modo che le librerie sono mescolate nei rapporti equimolari per ottenere la concentrazione finale di 10 nM della piscina. Aggiungere i volumi calcolati di ogni libreria in una nuova provetta da 1,5 mL, mescolare pipettando. Aggiungere acqua per ottenere il volume totale calcolato. Librerie di negozio in pool a-20 ° C.
- Invia un'aliquota della biblioteca in pool da sequenziare usando 50 bp monolato sequencing in una piattaforma di sequenziamento Illumina. Abbiamo ordinariamente multiplex 12 campioni in un singolo sequenziamento eseguire, quali rendimenti ~ 200 milioni legge per corsia di sequenziamento.
Nota: Il numero finale di impronta letture raccolti per ogni campione dipende la quantità del materiale in ingresso e il livello di contaminazione del rRNA.
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Representative Results
Sono state dettagliate condotte per analisi bioinformatica del ribosoma profiling dei dati descritto in precedenza 8,9. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato strumenti bioinformatici per l'analisi dell'espressione genica differenziale e trattamento dei dati di sequenziamento, che sono specifici per ribosoma profilatura metodo 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. Il primo passo nell'analisi dei dati di Ribo-Seq è demultiplazione e rifilatura la sequenza di adattatore 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT utilizzando Cutadapt software 19. Quindi le letture di sequenziamento sono allineate contro non-codificazione RNAs, come rRNA e tRNA, utilizzando Bowtie 20 per rimuovere contaminanti sequenze, e letture che non si allineano vengono mappate al genoma di lievito. Leggere il numero di ciascun gene quindi può essere valutato da HTseq-conteggio software 21e geni differenzialmente espressi sono identificati usando DESeq2 22.
Figura 8 Mostra risultati rappresentativi dell'analisi quantitativa della traduzione in 23,hbs1Δ24 mutante di delezione lievito che sono state ottenute utilizzando il nostro protocollo. In primo luogo, abbiamo valutato il numero e la proporzione di letture che corrispondono al RNA non codificanti (ad es. i rRNAs) ottenuto dopo sequenziamento librerie impronta e mRNA generate per cellule wild-type e il mutante di hbs1Δ. Abbiamo scoperto che, anche senza rRNA svuotamento passaggi (discussi sotto), dal 50 al 60% di tutte le letture in sequenza nella nostra impronta librerie corrispondono ai frammenti di impronta ribosoma-protetto (Figura 8A). Al contrario, solo il 3% di frammenti di rRNA-derivati sono stati osservati nelle librerie di mRNA che dimostrano che il poli (a) mRNA isolamento permette efficace eliminazione di rRNA letture. Insieme, siamo riusciti a ottenere più di 10 milioni impronta letture per ciascuno dei campioni di impronta di sequenziamento 2 repliche. Per valutare la variabilità della generazione della libreria e riproducibilità dei dati, analizziamo solitamente almeno due ripetizioni biologici indipendente per ogni condizione sperimentale. Librerie di campioni di mRNA e impronta mostrano buona riproducibilità con coefficiente di correlazione di Pearson R ~ 0.99 tra campioni abbinati (Figura 8B).
Oltre a valutare il livello di proteina traduzione a livello di genoma, profilatura ribosoma permette di misurare cambiamenti nell'efficienza di traduzione tra condizioni sperimentali 3. Per questo, un'aliquota della cella lysata (non trattata con ribonucleasi) è usata per isolamento di mRNA di poli (a) e la preparazione di una libreria di RNA-Seq. Perché sia orma libreria e biblioteca di RNA-Seq sono preparati sotto le stesse condizioni controllate e possono essere ricondotti a ogni replica individuo, Ribo-Seq e RNA-Seq set di dati possono essere confrontati direttamente per identificare i geni che sono regolati dai cambiamenti nel mRNA trascrizione, traduzione di efficienza, o da un effetto combinato. Per identificare i geni che sono up - o down-regolati specificamente al livello della traduzione della proteina nel mutante hbs1Δ, abbiamo calcolato le modifiche in termini di efficienza di traduzione dividendo i valori di impronta rpkm per rpkm di mRNA per ciascuno dei geni (Figura 8).
Figura 1: Panoramica del protocollo Ribo-Seq. L'intero protocollo può essere eseguita in circa 11 giorni. Tempo stimato per ogni passaggio è mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: preparazione di pendenze del saccarosio Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: profili gradiente di saccarosio rappresentante. (A) profilo gradiente di saccarosio ottenuto per controllo (non trattate con RNasi I) campione. (B) per estrarre frammenti di RNA ribosoma-protetto, lisati cellulari vengono trattati con RNasi I per 1 h a temperatura ambiente (TA). Le frazioni corrispondente al picco monosomal sono poi raccolti per l'estrazione di impronta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini rappresentative dei gel di poliacrilammide di 15% ottenuta dopo trattamento della chinasi di polinucleotide T4. (A) le dimensioni della sezione gel asportato circa 28 e 32 nt sono indicata per i campioni di impronta. (B) tagliare la fetta di gel di circa 50-70 nt per campioni di mRNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: immagini rappresentative dei gel di poliacrilammide 10% ottenuta dopo trascrizione inversa. (A) tagliare la banda superiore ~ 128 nt per campioni di impronta, corrispondente al prodotto di trascrizione inversa. (B) tagliare la banda intorno a 150-170 nt per i campioni di mRNA (fascia superiore). Le bande basse corrispondono al primer RT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: gel di poliacrilammide purificazione di PCR-amplificato librerie. Prodotti PCR ottenuti dopo 8, 10, 12 e 14 cicli di amplificazione di libreria sono stati risolti su un gel TBE 8% non-denaturante.La dimensione delle librerie full-length impronta è ~ 150 bp, considerando che la dimensione delle librerie di mRNA è ~ 170-190 BP. evitare la banda inferiore che non contiene inserto.
Figura 7: analisi Bioanalyzer. (A) rappresentante Bioanalyzer profili della biblioteca impronta PCR-amplificato. La dimensione media della biblioteca impronta dovrebbe essere da 148 a 152 nt. (B) rappresentante Bioanalyzer profili della biblioteca sequenziamento ottenuti per campioni di mRNA. La dimensione prevista della biblioteca mRNA è 170-190 nt. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: risultati rappresentativi. (A) numero di letture di mRNA, footprint e rRNA ottenute per esempio wild-type e il mutante di hbs1Δ. Numero combinato di letture generate dall'ordinamento biologico due replica è mostrato per cellule wild-type e il mutante di hbs1Δ. (B) riproducibilità delle misurazioni impronta e abbondanza del mRNA tra due replica. Sono indicati i coefficienti di correlazione di Pearson (R). (C) trascrizionale e traslazionale modifiche nel mutante hbs1Δ. Significativamente geni up-regolati e down-regolato in hbs1Δ sono raggruppati in base alla se sono interessate da un cambiamento nella trascrizione del mRNA, traduzione di efficienza, o da un effetto combinato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Primer | Sequenza | Indice | ||||
| 3' adattatore (100 ng / µ l) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| Primer RT | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Forward primer PCR | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Iniettore di indice 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Primer di indice 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Primer di indice 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Primer di indice 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Indice primer 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Primer Indice 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tabella 1: 3' sequenze primer e adattatore.
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Discussion
L'approccio di Ribo-Seq è emerso come una potente tecnologia per l'analisi del mRNA traduzione in vivo presso il genoma di livello 3. Gli studi che utilizzano questo approccio, che permette di monitorare la traduzione con risoluzione di singolo-codone, ha contribuito alla nostra comprensione della regolazione traduzionale. Nonostante i suoi vantaggi, Ribo-Seq presenta diverse limitazioni. Frammenti di RNA ribosomiale (rRNA) sono sempre co-purificate durante l'isolamento delle orme protetto da ribosoma diminuendo il rendimento di letture di sequenziamento utili che possono essere ottenuti in esperimenti Ribo-Seq 9,25. I nostri dati dimostrano che la contaminazione di rRNA possa contribuire alla come il 40-50% di tutte le letture (Figura 8). Uno dei modi per superare questa limitazione è per aumentare la profondità di sequenziamento. Turni aggiuntivi di sequenziamento devono essere eseguite fino a raggiungere il numero richiesto di sequenziamento letture per ciascuno dei campioni analizzati. Analisi delle librerie sequenziamento preparati utilizzando il nostro protocollo dimostra che più di 5 milioni impronta letture possono essere ottenute per ogni libreria di impronta, quando 12 campioni sono multiplexati insieme in un 50-bp standard single-end eseguire sulla piattaforma Illumina HiSeq 2000. Tuttavia, se si osserva un notevole contaminazione con rRNA, un passaggio di rimozione di rRNA facoltativo può essere eseguito.
Una delle strategie per rimuovere rRNA contaminando frammenti dalle librerie di impronta consiste nell'utilizzare ibridazione sottrattiva con gli oligonucleotidi biotinilati come descritto in precedenza 8,26,27. In alternativa, rRNA contaminando letture possa essere rimossi utilizzando kit di svuotamento di rRNA commercialmente disponibili. Per questo, i ricercatori possono eseguire lo svuotamento del rRNA su frammenti di impronta 3'-adattatore-legati purificata dal passaggio 5.4. Deplezione di rRNA seguente, impronta di campioni possono essere precipitati e utilizzati direttamente per la trascrizione inversa (passaggio 6) come descritto nel protocollo.
Oltre alla purificazione di monosomi mediante frazionamento gradiente di saccarosio descritto nel nostro protocollo, sono stati sviluppati diversi metodi che utilizzano una purificazione basato su colonna 28 e ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio 8 ,29. Mentre questi metodi possono accelerare il processo di preparazione di impronta biblioteca e sono tecnicamente meno impegnativi rispetto al frazionamento di gradiente di saccarosio, non consentono analisi qualitativa dei monosomi purificati e l'efficienza della nucleasi fase di digestione. Recentemente, la scelta di nucleasi ha dimostrata di influenzare l'efficienza di purificazione dei frammenti di RNA ribosoma-protetto in diverse specie 30. Mentre la RNasi I ha attività robusta in lisati cellulari di lievito, sua attività ha dimostrata di influire sull'integrità dei ribosomi in tessuti di topo pure come mosche della frutta. Pertanto, la scelta e la concentrazione di nucleasi dovrebbe essere ottimizzati quando l'adozione del presente protocollo ad altre specie.
Un'altra considerazione importante è l'uso degli inibitori della traduzione. Maggior parte dei protocolli per la profilatura del ribosoma tipicamente coinvolgono trattando le cellule con inibitori di allungamento, come cicloesimmide o harringtonine, al fine di evitare il dilavamento dei ribosomi durante la cella di raccolta 3. Una delle limitazioni dell'uso di inibitori della traduzione è che le droghe diffondono progressivamente nella cellula, inducendo una progressiva inibizione dei ribosomi 31. Inoltre, i farmaci non inibiscono l'inizio della traduzione o terminazione. Di conseguenza, i ribosomi sproporzionatamente si accumulano al codone di inizio e sono vuotati del codone di stop 8,27,31. Al fine di limitare questo artefatto, abbiamo scelto di flash congelare le cellule in azoto liquido e trattare con cicloesimmide al momento dell'estrazione in tampone di lisi solo.
Nonostante un numero relativamente elevato di rapporti che hanno utilizzato Ribo-Seq in varie specie, mancano protocolli standardizzati per l'analisi di Ribo-Seq. Di conseguenza, Ribo-Seq dati generati da diversi laboratori non possono essere confrontati direttamente. Ad esempio, il confronto del ribosoma pubblicato i set di dati di profilatura ha rivelato significative discrepanze nei risultati tra studi 32. Ciò è in parte dovuto a continui miglioramenti che sono state fatte come il protocollo si è evoluto nel corso degli ultimi anni. Inoltre, molti ricercatori modificati il ribosoma profilatura protocollo per adottarlo alle esigenze specifiche del loro studio o modello sistema 9,25. Ulteriore standardizzazione il ribosoma profilatura anche protocollo come l'analisi dei dati e normalizzazione, sarebbe consentire di prevenire alcuni dei pregiudizi sperimentali e garantire Quantificazione accurata e riproducibile della traduzione in vivo .
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni di salute AG040191 e AG054566 di VML. Questa ricerca è stata condotta mentre VML era un destinatario AFAR Research Grant della Federazione americana per la ricerca di invecchiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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