Summary
تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
ترجمة مرناً إلى البروتينات عملية معقدة تنطوي على عدة طبقات من اللائحة. كثيرا ما يفترض أن تعكس التغييرات في النسخ مرناً التغييرات في تخليق البروتين، ولكن الكثير من الاستثناءات قد لوحظت. في الآونة الأخيرة، برزت تقنية تسمى الريبوسوم التنميط (أو Seq ريبو) كطريقة قوية تتيح تحديد الهوية، مع درجة عالية من الدقة، أي مناطق مرناً يتم ترجمتها إلى بروتينات والتحديد الكمي للترجمة على مستوى المنظومة الجينوم. نقدم هنا، بروتوكول معممة على نطاق الجينوم التقدير الكمي للترجمة باستخدام Seq ريبو في مهدها الخميرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين البيانات ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً يسمح لنا بقياس كفاءة الترجمة الآلاف من النصوص مرناً في نفس العينة في وقت واحد، ومقارنة التغيرات في هذه المعلمات في الاستجابة إلى تجريبية التلاعب أو في حالات فسيولوجية مختلفة. يصف لنا بروتوكول مفصل لجيل أقدام الريبوسوم باستخدام نوكلاس الهضم، عزل مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة عن طريق تجزئة السكروز التدرج، وإعداد مكتبات الحمض النووي لتسلسل العميقة جنبا إلى جنب مع المناسبة نوعية الضوابط اللازمة لضمان دقة التحليل في فيفو الترجمة.
Introduction
الترجمة مرناً هو إحدى العمليات الأساسية في الخلية، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير البروتين. ولذلك، الترجمة مرناً مراقبة شديدة واستجابة لمختلف المحفزات الفسيولوجية الداخلية والخارجية 1،2. ومع ذلك، تظل آليات التنظيم متعدية المداريين. هنا، نحن تصف البروتوكول للتحديد الكمي للترجمة في مهدها الخميرة على نطاق الجينوم بالتنميط الريبوسوم. والهدف العام لأسلوب التنميط الريبوسوم هو دراسة وتحديد مقدار ترجمة مرناس محددة تحت ظروف مختلفة الخلوية. هذا الأسلوب يستخدم التسلسل الجيل القادم لتحليل كمي شغل الريبوسوم في جميع أنحاء الجينوم ويتيح رصد معدل البروتين التوليف في فيفو كودون واحد القرار 3،4. حاليا، هذا الأسلوب يوفر الوسائل الأكثر تقدما لقياس مستويات البروتين الترجمة، وقد ثبت أن تكون أداة اكتشاف مفيدة توفر معلومات يمكن الكشف عنها بغيرها من التقنيات المتوفرة حاليا، مثل [ميكروارس] أو ترجمة الدولة مصفوفة تحليل (تسا) 5. الريبوسوم التنميط تقارير عن التغيرات مجتمعة في مستويات النص والإخراج متعدية الجنسيات، كما أنه يوفر الكثير من حساسية أكبر مقارنة بالأساليب الأخرى.
يقوم هذا النهج على تسلسل العميقة المحمية الريبوسوم مرناً شظايا 3. أثناء ترجمة البروتين، حماية ريبوسوم ~ 28 nt أجزاء من مرناً (تسمى أقدام) 6. قبل تحديد تسلسل أجزاء محمية الريبوسوم، يمكن تعيين موضع ريبوسوم في مرناً المترجمة Seq ريبو وتحديد المناطق التي من مرناً يرجح أن تترجم بنشاط البروتين 3،7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن نقيس الكمية ترجمة مرناً بإحصاء عدد المسارات التي تتوافق مع نسخة مرناً معين.
بغية عزل الأجزاء المحمية الريبوسوم، تعامل ليساتيس خلية في البداية مع مثبط ترجمة إلى المماطلة ريبوسوم تليها الهضم ريبونوكليسي. بينما هي أفسدتها الحرة مرناً وأجزاء من مرناس المترجمة التي لا تحميها ريبوسوم ribonuclease، يمكن استرداد الشظايا مرناً محمية الريبوسوم بتنقية مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة. هذه آثار أقدام مرناً ثم تحويلها إلى مكتبة كدنا وتحليلها بواسطة تسلسل العميق (الشكل 1). وبالتوازي مع الريبوسوم التنميط، المستخرجة من نفس العينة سليمة مرناً ومتسلسلة. بمقارنة مستوى الترجمة التي حددها ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً، يمكننا تحديد الجينات التي هي على وجه التحديد أعلى أو أسفل-التنظيم على مستوى الترجمة وحساب كفاءة الترجمة مرناً على مستوى المنظومة الجينوم. بينما البروتوكول الموصوفة في هذه المقالة محددة للخميرة، ينبغي أيضا مفيدة للباحثين الذين سيحاولون وضع البروتوكول ريبو-Seq في النظم الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-استخراج إعداد
- الانتصارات سلالات الخميرة من الأرصدة المجمدة للمستعمرات واحدة في لوحات YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2% والجلوكوز 2% واجار 2%). احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
- تطعيم الخميرة من لوحة YPD (استخدام مستعمرة واحدة) إلى 15 مل متوسطة YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% جلوكوز) في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي وتنمو بين عشية وضحاها بالهز (200-250 لفة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية.
- تمييع الثقافة إلى 500 مل متوسطة YPD في ل 2 قارورة معقمة، حيث أن التطوير التنظيمي600 < 0.1. تنمو خلايا الخميرة مع تهتز عند 30 درجة مئوية ح 3-5 حتى OD600 = 0.5 (سجل منتصف المرحلة).
- جمع الخلايا بعملية التصفية من خلال 0.45 ميكرومتر غشاء مرشحات استخدام تجمع تصفية حامل زجاج. كشط بيليه مع ملعقة، فلاش التجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية. الحجم المتوقع لبيليه المجمدة ~ 0.2-0.5 ز.
تنبيه: النتروجين السائل درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة. - إعداد "المخزن المؤقت تحلل" الطازجة (140 ملم بوكل، 5 ملم مجكل2، 100 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، 0.5 مم DTT، 1% 20 مم تريس-HCl pH 8.0، Triton X-100) مباشرة قبل الاستخدام، الحفاظ على الجليد.
- وضع الخرز الصلب الكروم 3 (3.2 ملم) في أنبوب فولاذ المقاوم للصدأ 1.8 مل. قبل البرد في النتروجين السائل وإضافة الكريات المجمدة، وتغطي بغطاء مطاط سيليكون. مجانسة العينة قبل كريوجريندينج ل 10 s عند 4200 دورة في الدقيقة؛ كرر 10 مرات. البرد الأنبوبة في النيتروجين السائل لمالا يقل عن 10 ق بين كل جولة.
ملاحظة: من المهم أن تبقى دائماً العينة المجمدة. - أضف 1 مل من "المخزن المؤقت لتحلل"، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج. نقل إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بينما كان يعمل على الجليد، نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة. نقل 100 ميكروليتر من ليستي إلى أنبوب 1.5 مل جديد لعزل مرناً poly(A). الشروع فورا في عزل الحمض النووي الريبي أو تجميد فلاش الأنبوبة في النيتروجين السائل. قياس OD260 من بقية، التي سيتم استخدامها لاستخراج البصمة، وفلاش تجميد الأنابيب في نيتروجين سائل. تخزين ليساتيس في-80 درجة مئوية.
2-البصمة استخراج
- إعداد التدرجات السكروز
- إعداد حلول لنسبة 50%، 40%، 30%، 20%، والسكروز 10% في "المخزن المؤقت للتدرج" (20 مم تريس-HCl pH 8.0، 140 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 100 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، 0.5 مم DTT).
- "الماصة؛" مل 2.2 العازلة السكروز 50% مستعدة للجزء السفلي من أنبوب بوليالومير 13.2 مل رقيقة الجدار وتجميد الحل لمدة 10 دقائق في-80 درجة مئوية (الشكل 2). ثم طبقة مل 2.2 من المخزن المؤقت السكروز 40% على رأس المخزن المؤقت السكروز 50% المجمدة، وتجميد لمدة 10 دقائق في-80 درجة مئوية. في أعقاب نفس التعليمات، السكروز طبقة 30%، ثم نسبة 20 في المائة، وأخيراً 10% المخازن فوق بعضها البعض. تجنب الوقوع في فقاعات الهواء بينما طبقات. الاحتفاظ التدرجات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. ينبغي إعداد يوم واحد على الأقل قبل التجربة التدرجات السكروز وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- الهضم نوكلاس
- ذوبان الجليد التدرجات السكروز في الليلة التي سبقت التجارب عند 4 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد خلية ليستي (بصمة عينة) على الجليد. نقل قاسمة للخلية التي تحتوي على 50 وحدة260 OD إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة جديدة "تحلل العازلة" تصل إلى 1 مل. تخزين المتبقي في-80 درجة مئوية. إضافة 10 ميكروليتر رناسي أنا (100 يو/ميكروليتر) واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع تناوب لطيف على المدورة الرأس-أكثر-الكعب.
- (اختياري) توضيح العينات من 20,000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية واسترجاع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.
- تنبيذ فائق
- بلطف طبقة عينات ليستي إلى الأعلى من التدرج السكروز 10-50%.
- أنابيب أولتراسينتريفوجي بوليالومير في 210,000 س ز (35,000 لفة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية عن 3 ح "تي" ف-41 دوار باستخدام.
- إنشاء نظام تجزئة التدرج
- تشغيل المكونات والسماح لرصد الأشعة فوق البنفسجية للاحماء لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- في حالة استخدام برنامج مسجل رقمي، بدء تشغيل البرنامج على الكمبيوتر، تعيين حدود تحجيم الرسم البياني إلى-0.01 و 1.
- ملء المحاقن مع "تشيس الحل" (20 ملم تريس-HCl pH 8.0، 140 ملم بوكل، 5 ملم مجكل2، السكروز 60 في المائة)، وإزالة أي فقاعات الهواء داخل محقن وقنية.
- تركيب أنبوب ultracentrifuge مليئة بالمياه خالية من رناسي. بيرس الأنبوب مع القنية حتى يمكن رؤية علامات سوداء اثنين. بدء ضخ حقنه في 1 مل/دقيقة.
- كما يمر الماء من خلال تدفق الخلية، اضغط الزر "السيارات الصفر" على رصد الأشعة فوق البنفسجية لضبط خط الأساس إلى 0. تعيين الحساسية لرصد الأشعة فوق البنفسجية إلى "2.0 الاتحاد الأفريقي". بعد أن تم إنشاء خط أساس مستقر، وقف ضخ حقنه. استرداد "الحل تشيس" وإزالة أنبوب أولتراسينتريفوجي.
- عزل مونوسومي
- تثبيت وبيرس ultracentrifuge الأنبوبة المحتوية على التدرج السكروز. بدء ضخ حقنه في 1 مل/دقيقة، وجمع الكسور 1 مل مراقبة قيم254 . تجمع الكسور تمثل ذروة مونوسومي 80S في أنبوب واحد، والحفاظ على الجليد (الشكل 3).
- بمجرد "حل تشيس" يصل إلى الخلية تدفق، وقف ضخ حقنه. استرداد "الحل تشيس" وإزالة أنبوب أولتراسينتريفوجي. كرر تجزئة لبقية العينات بدءاً من الخطوة 2.5.1.
ملاحظة: عند الانتهاء من تنظيف نظام تجزئة مع مالا يقل عن 30 مل من المياه خالية من رناسي. دقة غسل الأنابيب والمحاقن وكافة المكونات القابلة للإزالة بالماء الدافئ. - تصفية الكسور من خلال مرشحات الطرد المركزي 0.5 مل (100 كاتشين موكو) في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل في التدفق من خلال، وكرر حتى يتم تخزين < 100 ميكروليتر. إضافة 400 ميكروليتر من "الإصدار المخزن المؤقت" (20 مم تريس-HCl pH 7.0، 2 مم يدتا، مثبط رناسي U/mL 40). مزيج من بيبيتينج، تبني على الجليد 10 دقيقة ونقل الوحدة إلى أنبوب جمع جديدة. الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع في التدفق من خلال.
- تنقية يفتت البصمة
- نقل من خلال تدفق تحتوي على بصمة الحمض النووي الريبي الشظايا أنبوب مل 1.5 جديدة، وإضافة 20 ميكروليتر من 20% الحزب الديمقراطي الصربي (إلى تركيز نهائي من 1%)، مزيج من بيبيتينج.
- إضافة إلى حجم 1 حمض-الفينول: كلوروفورم (pH 4.5)، ودوامه لمدة 10 ق.
تنبيه: حمض-الفينول: كلوروفورم السامة، وتجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. - الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضع على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- يعجل ببصمة الحمض النووي الريبي الشظايا بإضافة المجلد 1/10 من نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%.
3-Poly(A) مرناً الاستخراج
- مجموع استخراج الحمض النووي الريبي
- ذوبان الجليد قاسمة 100 ميكروليتر من الخلية ليساتي (الرنا مجموع العينة) على الجليد، وإضافة 300 ميكروليتر من عيار 20 ملم تريس-HCl pH 7.0 و 20 ميكروليتر من 20% الحزب الديمقراطي الصربي (إلى تركيز نهائي من 1%)، مزيج من بيبيتينج.
- إضافة إلى حجم 1 (400 ميكروليتر) حمض-الفينول: كلوروفورم (pH 4.5) ودوامه لمدة 10 ق.
- الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضع على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- القيام استخراج فينول ثانية. إضافة إلى حجم 1 حمض-الفينول: كلوروفورم (4.5 درجة الحموضة)، دوامة للحرارة 10 س. عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضعت على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
- يعجل بالجيش الملكي النيبالي. هذا إضافة إلى حجم 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
- Poly(A) مرناً العزلة
- الطرد المركزي عينات الحمض النووي الريبي في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
- حل بيليه في 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة من عدة عزل مرناً poly(A). نشرع في استخراج مرناً poly(A) وفقا لبروتوكول poly(A) مرناً العزلة طقم الخاص بالشركة المصنعة.
- يعجل بالعينات مرناً بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
- تجزئة مرناً
- الطرد المركزي في نماذج مرناً في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 ثانية، وإزالة بقية الإيثانول مع هلام-تحميل تلميح، والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند مرناً في ميكروليتر 18 من المياه خالية من رناسي، إضافة 2 ميكروليتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي تجزئة المخزن المؤقت. احتضان 5 دقيقة في 94° C. نقل أنبوب للجليد.
- يعجل بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
4-ديفوسفوريليشن
- علاج البصمة وعينات مرناً مجزأة مع T4 بولينوكليوتيدي كيناز. ولهذا الغرض، الطرد المركزي العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع هلام تحميل تلميح. الهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه في 7.75 ميليلتر من الماء، إضافة 1 ميليلتر كيناز المخزن المؤقت بولينوكليوتيدي x T4 10، 1 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (10,000 U/mL)، وميليلتر 0.25 من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر). احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
- (اختياري) قبل تشغيل هلام يوريا TBE 15% على 180 الخامس لمدة 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت x TBE 1.
- إضافة 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE عينة المخزن المؤقت إلى 10 ميليلتر من كل عينة البصمة ومرناً. إعداد عينة عنصر تحكم يحتوي على 1 ميليلتر من 10 ميكرون حجم العلوي علامة اليغنوكليوتيد (32 nt)، 1 ميليلتر من 10 ميكرون انخفاض حجم اليغنوكليوتيد ماركر (28 nt)، 8 ميليلتر المياه، و 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE العازلة عينة لعينات البصمة. إعداد عينة عنصر تحكم يحتوي على 1 ميليلتر من 10 ميكرون رنا اليغنوكليوتيد ماركر (63 nt)، 9 ميليلتر المياه، و 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE العازلة عينة لعينات مرناً.
- احتضان عينات وضوابط دقيقة 3 في 75 درجة مئوية، تدور إلى أسفل، ووضعت على الجليد للحد الأدنى 1 تحميل كل عينة في الآبار 2 جل اليوريا TBE 15%، أجزاء منفصلة من الجيش الملكي النيبالي بالتفريد جل في 180 الخامس ح 1.
- وصمة عار للهلام لمدة 5 دقائق مع وصمة عار جل حمض النووي (س 10,000 مخفف بالمياه)، وحماية من الضوء.
- استخدام ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، قطع الفرقة السليم بين 28 و 32 من علامات nt لعينات البصمة (الشكل 4A) وحوالي 50-70 nt مرناً عينات (الشكل 4) مع شفرة حلاقة نظيفة. تجميد القطع polyacrylamide هلام في-80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- استخراج الحمض النووي الريبي من هلام بولياكريلاميدي كما يلي. حرارة قطع جل على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وطحن الجل باستخدام المدقات بيليه المتاح. الوتي الجيش الملكي النيبالي مع 300 ميليلتر شطف العازلة (20 مم تريس-HCl pH 7.0، 2 مم يدتا) وإضافة 1 ميليلتر رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3.
- الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المادة طافية، ويعجل بإضافة المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، بحجم 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
5-3-محول ربط
- الطرد المركزي عينات البصمة ومرناً في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 4.75 المياه خالية من نوكلاس، 2 ميليلتر من 50% PEG8000، 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 X 10 ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 3 '--محول (100 نانوغرام/ميليلتر)، ميليلتر 0.25 من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى 2 اقتطاع خمس (200,000 U/mL). تبني بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
- في صباح اليوم التالي، إزالة فائض المحول بإضافة 0.5 ميليلتر من 5 '--ديادينيلاسي (يو 10/ميليلتر) و 0.5 ميليلتر من"تفصيل ي" [ااكسونوكلس] (يو 10/ميليلتر) إلى رد فعل ربط مباشرة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.
- يعجل بالعينات. لهذا، أضف 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي، 1 ميليلتر الجليكوجين (10 مغ/مل)، المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، وحجم 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
6-عكس النسخ
- الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 11.5 المياه خالية من نوكلاس، إضافة 0.5 ميليلتر من 8 ميكرومتر النسخ العكسي التمهيدي (RT التمهيدي) و 1 ميليلتر من دنتب ميكس (10 مم). احتضان لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، ومكان على الجليد.
- إضافة 4 ميليلتر من 5 × أول حبلا العازلة، 2 ميليلتر من 0.1 م DTT، 0.5 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، 0.5 ميليلتر من المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 48 درجة مئوية، 1 دقيقة في 65 درجة مئوية، 5 دقيقة عند 80 درجة مئوية.
- لا يعجل والشروع فورا التحلل من الجيش الملكي النيبالي، بإضافة ميليلتر 0.8 من هيدروكسيد الصوديوم م 2، احتضان 30 دقيقة عند 98 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 0.8 م 2 HCl لتحييد رد فعل.
- يعجل بالعينات.
7-على
- الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 16.75 المياه خالية من نوكلاس. إضافة 2 ميليلتر من 10 × واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 50 مم الحركة ميليلتر2، 0.25 من سدنى ليجاسى (100 يو/ميليلتر). احتضانها ح 1 في 60 درجة مئوية، 10 دقيقة عند 80 درجة مئوية. لا يعجل، وتخزين المنتج رد فعل ربط ssDNA عند-20 درجة مئوية.
8-بكر مكتبة التضخيم
- بينما العامل في الجليد، وخلط ما يلي في أنبوب PCR: 146 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي، 2 ميليلتر من 20 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2 ميليلتر من 20 ميكرومتر "فهرسة عكس" التمهيدي، 40 ميليلتر من 5 × عالية الدقة الحمض النووي بليميراسي المخزن المؤقت، 4 ميليلتر من دنتبس (10 ملم)، 4 ميليلتر من سدنا ربط رد الفعل الناتج ، و 2 ميليلتر من عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي. اختر تمهيدي "فهرسة عكس" مختلف لكل عينة وسوف يكون متعدد للتسلسل. نقل من قاسمة 50 ميليلتر من خليط PCR إلى 4 أنابيب PCR جديدة.
- أداء [بكر] تضخيم مع اختلاف عدد الدورات (8، 10، 12، 14) باستخدام الإعدادات التالية:
1 دقيقة في تمسخ الأولى 98 درجة مئوية
دورات 8 إلى 14:
15 s في 94 درجة مئوية
5 s في 55 درجة مئوية
10 s عند 65 درجة مئوية
2 دقيقة في التمديد النهائي 65 درجة مئوية - يعجل بالمنتج بكر بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
- الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه.
- ريسوسبيند بيليه في 8 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس، إضافة 2 ميليلتر من غير يشوه 5 × المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي. تحميل العينة في 1 جيدا من جل TBE 8% غير يشوه. فصل المنتجات الحمض النووي بالتفريد جل 150 الخامس لمدة 35 دقيقة. كعنصر تحكم، إعداد عينة تحتوي على 0.5 ميليلتر bp 10 سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام/ميليلتر)، 7.5 ميليلتر المياه و 2 ميليلتر من غير يشوه 5 × المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي، وتشغيل على ممر منفصل من الجل.
- وصمة عار للهلام لمدة 5 دقائق مع وصمة عار جل حمض النووي (س 10,000 مخفف بالمياه)، وحماية من الضوء. استخدام ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، قطع الفرقة حوالي 150 شركة بريتيش بتروليوم لعينات البصمة وحوالي 180 شركة بريتيش بتروليوم لعينات مرناً (الشكل 6) مع شفرة حلاقة نظيفة. تخزين قطع جل في-80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- حرارة قطع جل على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وطحن الجل باستخدام المدقات بيليه المتاح. الوت الحمض النووي مع 300 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس-HCl pH 7.0، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3.
- الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المادة طافية، ويعجل بإضافة المجلد 1/10 من نواك (pH 5.5)، بحجم 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
- الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه. وأخيراً، ريسوسبيند المكتبات في 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس والمضي قدما للقياس الكمي، ومراقبة الجودة والتسلسل.
9-مكتبة القياس الكمي والتسلسل الفائق
- قبل إرسال العينات للتسلسل، تحديد العائد ونوعية المكتبات تضخيم PCR. تظهر ملامح الممثل للبصمة ومكتبات تسلسل مرناً في الشكل 7. هو الحجم المتوقع للمكتبة بكر تضخيم bp 148-152 لعينات البصمة، وشركة بريتيش بتروليوم 170-190 لعينات مرناً.
- إذا كان سيتم تجميع عدة عينات مع مختلف رموز شريطية للتسلسل، أداء دقيقة التحديد الكمي للمكتبات باستخدام تحليل الكمي مكتبة تسلسل القائم على قبكر.
- تجمع المكتبات في نسب اكويمولار. حساب الحجم الإجمالي للمجمع ميليلتر 3 × العدد الإجمالي للعينات تجميع. تحديد حجم كل مكتبة يحتاج إلى إضافة بحيث تختلط المكتبات في نسب اكويمولار لتحقيق 10 نانومتر التركيز النهائي تجمع. إضافة أحجام المحسوبة لكل مكتبة في أنبوب 1.5 مل جديدة، مزيج من بيبيتينج. إضافة المياه تحقيق الحجم الإجمالي المحسوب. تخزين المكتبات المجمعة في-20 درجة مئوية.
- إرسال قاسمة مكتبة المجمعة لتكون متسلسلة باستخدام 50 بي بي واحد في نهاية تسلسل تشغيل على منصة تسلسل إيلومينا. ونحن بشكل روتيني متعدد عينات 12 في تسلسل واحد تشغيل، الغلات التي ~ 200 مليون يقرأ كل حارة التسلسل.
ملاحظة: العدد النهائي لقراءة البصمة التي جمعت كل كل عينة يعتمد على كمية المواد المدخلة ومستوى التلوث الرنا الريباسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت خطوط الأنابيب مفصلة لتحليل بيوينفورماتيك من الريبوسوم التنميط البيانات المذكورة سابقا 8،9. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت عدة مجموعات بحثية أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل التعبير الجيني التفاضلي وتجهيز البيانات التسلسل، التي محددة الريبوسوم التنميط الأسلوب 10،11،12 ،13،،من1415،16،،من1718. الخطوة الأولى في تحليل البيانات ريبو-Seq demultiplexing والتشذيب المحول تسلسل 3 ' أجاتكجاجاجكاكاكجتكت باستخدام البرمجيات كوتادابت 19. ثم تتفق على ما يلي تسلسل ضد الكشف، مثل الرنا الريباسي والحمض الريبي النووي النقال، استخدام Bowtie 20 لإزالة تلويث متواليات، غير الترميز وثم يتم تعيين ما يلي: أن لا تتم محاذاة إلى جينوم الخميرة. قراءة عد كل الجينات يمكن أن يقيمها ثم هتسيق-العد البرمجيات 21، ويتم التعرف على الجينات الأثران عن استخدام DESeq2 22.
يبين الشكل 8 الممثل نتائج التحليل الكمي للترجمة في hbs1Δ،من 2324 الخميرة الحذف المسخ التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول لدينا. أولاً، قمنا بتقييم عدد ونسبة من القراءات التي تناظر رنا غير الترميز (مثل ررناس) التي تم الحصول عليها بعد تسلسل البصمة ومرناً من المكتبات التي تم إنشاؤها للبرية من نوع الخلايا والمسخ hbs1Δ. وجدنا أنه، حتى بدون أي الرنا الريباسي استنفاد الخطوات (مناقشتها أدناه)، من 50 إلى 60 في المائة من جميع ما يلي التسلسل في البصمة لدينا مكتبات تتوافق مع الشظايا البصمة محمية الريبوسوم (الشكل 8 أ). وفي المقابل، 3 في المائة فقط من شظايا المستمدة من الرنا الريباسي لوحظت في مكتبات مرناً مما يدل على أن العزلة poly(A) مرناً يسمح للقضاء الفعال على ما يلي: الرنا الريباسي. معا، كنا قادرين على الحصول على أكثر من 10 مليون قراءة بصمة لكل من عينات البصمة التسلسل 2 replicates. تقييم التغير من مكتبة الجيل وإمكانية تكرار نتائج البيانات، نحن نحلل عادة replicates البيولوجي المستقلة اثنين على الأقل في كل حالة تجريبية. المكتبات عينة البصمة ومرناً وتظهر إمكانية تكرار نتائج جيدة مع معامل ارتباط Pearson R ~ 0.99 بين العينات المطابقة (8B الشكل).
بالإضافة إلى تقييم مستوى الترجمة البروتين على مستوى المنظومة الجينوم، الريبوسوم التنميط يسمح قياس التغيرات في كفاءة الترجمة بين الظروف التجريبية 3. لذلك، يستخدم قاسمة الخلية ليستي (لا تعامل مع ribonuclease) لعزل مرناً poly(A) وإعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي. لأن البصمة مكتبة ومكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي تعد تحت نفس الظروف التي تسيطر عليها، ويمكن أن تعزى إلى كل تكرار الفردية، يمكن مقارنة datasets Seq ريبو وتسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة لتحديد الجينات التي تنظم بالتغيرات في مرناً النسخ، وكفاءة الترجمة، أو بتأثير مجتمعة. تحديد الجينات التي تنظم أعلى أو أسفل على وجه التحديد على مستوى الترجمة البروتين في الطور hbs1Δ، قمنا بحساب التغييرات في كفاءة الترجمة بقسمة قيم البصمة ربكم ربكم مرناً لكل من الجينات (الشكل 8).
رقم 1: نظرة عامة على البروتوكول ريبو-Seq. يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في حوالي 11 يوما. يتم عرض الوقت المقدر لكل خطوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد التدرجات السكروز الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: لمحات التدرج السكروز الممثل. (أ) الحصول على الشخصية السكروز التدرج للتحكم (لا تعامل مع رناسي أنا) عينة. (ب) من أجل استخراج الأجزاء رنا محمية الريبوسوم، ليساتيس خلية يتم التعامل مع رناسي أنا ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم يتم تجميع الكسور المقابلة إلى ذروة مونوسومال لاستخراج البصمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الحصول على صور الممثل من المواد الهلامية polyacrylamide 15% بعد T4 بولينوكليوتيدي كيناز العلاج. (أ) يظهر حجم الشريحة جل قصت حول nt 28 و 32 لعينات البصمة. (ب) خفض الشريحة جل حول 50-70 nt لعينات مرناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الحصول على صور الممثل من المواد الهلامية polyacrylamide 10% بعد النسخ العكسي- (أ) قطع الشريط العلوي ~ 128 nt لعينات البصمة، المقابلة لمنتج النسخ العكسي. (ب) خفض الفرقة حوالي 150-170 nt للعينات مرناً (الشريط العلوي). وتتوافق مع عصابات أقل التمهيدي RT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تنقية Polyacrylamide جل المكتبات تضخيم PCR. بكر المنتجات التي تم الحصول عليها بعد دورات 8، 10 و 12، و 14 من التضخيم مكتبة تم حلها في جل غير يشوه TBE 8%.حجم المكتبات البصمة كامل طول ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم، بينما حجم المكتبات مرناً ~ 170-190 هناك تجنب الشريط السفلي التي لا تحتوي على إدراج.
رقم 7: تحليل بيواناليزير- (أ) ملامح بيواناليزير ممثل المكتبة بكر تضخيم البصمة. متوسط حجم المكتبة البصمة من المتوقع أن يكون من 148 إلى 152 nt. (ب) الملامح بيواناليزير ممثل مكتبة تسلسل الحصول على عينات مرناً. الحجم المتوقع للمكتبة مرناً من 170-190 nt. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: النتائج التمثيلية. (أ) عدد القراءات مرناً وبصمة الرنا الريباسي الحصول على عينة من نوع البرية والمسخ hbs1Δ. مجموع عدد القراءات المتولدة عن تسلسل يتطابق البيولوجية هما ترد البرية من نوع الخلايا والمسخ hbs1Δ. (ب) إمكانية تكرار نتائج القياسات البصمة ووفرة مرناً بين اثنين إنشاء نسخ متماثلة. يتم الإشارة إلى معاملات الارتباط بيرسون (R). (ج) ترانسكريبشونال والتغييرات متعدية الجنسيات في المسخ hbs1Δ. إلى حد كبير يتم تجميع الجينات تنظم أعلى وأسفل-وينظم في hbs1Δ وفقا لما إذا كانت تتأثر بتغيير في النسخ مرناً، كفاءة الترجمة، أو بتأثير مجتمعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كبسولة تفجير | التسلسل | فهرس | ||||
| 3 ' محول (100 نانوغرام/ميليلتر) | /5rApp/أجاتكجاجاجكاكاكجتكت/3ddC/ | |||||
| RT التمهيدي | بجاتكجتكجاكتجتاجاكتكتجاكجتجتاجاتكتكجتجتكجككجتاتكات/iSp18/جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| إلى الأمام بكر التمهيدي | آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكجتكاجاجتكتاكاجتككجاكج | |||||
| الفهرس التمهيدي 1 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | أتكاكج | ||||
| الفهرس التمهيدي 2 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاكاتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | كجاتجت | ||||
| الفهرس التمهيدي 3 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | تتاجك | ||||
| الفهرس التمهيدي 4 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتكاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | تجاككا | ||||
| الفهرس التمهيدي 5 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | أكاجتج | ||||
| الفهرس التمهيدي 6 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتاتجكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | جككات | ||||
الجدول 1: 3 ' تسلسل محول والتمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النهج Seq ريبو الذي برز كتقنية قوية لتحليل مرناً الترجمة في فيفو على نطاق الجينوم المستوى 3. الدراسات باستخدام هذا النهج، الذي يسمح برصد الترجمة مع القرار كودون واحد، قد ساهم في فهمنا للتنظيم متعدية الجنسيات. وعلى الرغم من مزاياه، Seq ريبو نقائص عديدة. شظايا الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) دائماً شارك المنقي أثناء عزلة أقدام محمية الريبوسوم تناقص محصول ما يلي تسلسل المفيدة التي يمكن الحصول عليها في ريبو-Seq تجارب 9،25. وتبين البيانات المتوفرة لدينا أن تلوث الرنا الريباسي يمكن أن تسهم بما يصل إلى 40-50% من جميع ما يلي: (الشكل 8). إحدى الطرق للتغلب على هذا القيد زيادة عمق التسلسل. ينبغي إجراء جولات إضافية من التسلسل حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من تسلسل ما يلي لكل من العينات التي تم تحليلها. ويبين تحليل المكتبات تسلسل إعدادها باستخدام بروتوكول لدينا أنه يمكن الحصول على أكثر من 5 مليون بصمة ما يلي: لكل مكتبة البصمة، عندما يتم متعدد عينات 12 معا في عمل قياسية 50-بي بي واحد-تشغيل على منصة إيلومينا هيسيق 2000. ومع ذلك، إذا لوحظ تلوث كبيرة مع الرنا الريباسي، يمكن إجراء خطوة إزالة الرنا الريباسي اختيارية.
واحدة من استراتيجيات لإزالة الرنا الريباسي تلويث شظايا من مكتبات البصمة استخدام التهجين الاختزالي مع النوكليوتيد بيوتينيلاتيد كما هو موضح سابقا 8،26،27. وبدلاً من ذلك، يمكن إزالة الرنا الريباسي تلويث ما يلي باستخدام مجموعات استنفاد الرنا الريباسي المتاحة تجارياً. لهذا، يمكن أداء الباحثين استنفاد الرنا الريباسي الشظايا المنقي البصمة 3 '--محول-متصلة من الخطوة 5.4. التالي استنفاد الرنا الريباسي، البصمة يمكن عجلت العينات وتستخدم مباشرة للنسخ العكسي (الخطوة 6) كما هو موضح في البروتوكول.
بالإضافة إلى تنقية مونوسوميس استخدام تجزئة التدرج السكروز المبينة في البروتوكول لدينا، أساليب عدة وضعت التي تستخدم تنقية المستندة إلى عمود 28 وتنبيذ فائق من خلال وسادة سكروز 8 ،29. في حين أن هذه الأساليب يمكن تسريع عملية إعداد مكتبة البصمة وهي صعبة من الناحية التقنية أقل بالمقارنة مع وجود التدرج السكروز، أنها لا تسمح التحليل النوعي من مونوسوميس المنقي وكفاءة نوكلياسي الخطوة الهضم. في الآونة الأخيرة، أظهرت اختيار nuclease تؤثر على كفاءة تنقية محمية الريبوسوم الأجزاء رنا في 30من مختلف الأنواع. وفي حين قد ثبت رناسي أنا بنشاط قوي في الخميرة الخلية ليساتيس، نشاطها تؤثر على سلامة ريبوسوم في الأنسجة الماوس فضلا عن ذباب الفاكهة. ولذلك، ينبغي أن يكون الأمثل بالاختيار وتركيز نوكلاس عند اعتماد هذا البروتوكول للأنواع الأخرى.
ثمة اعتبار هام آخر هو استخدام مثبطات الترجمة. معظم البروتوكولات للتنميط الريبوسوم وعادة ما تشمل علاج الخلايا مع مثبطات استطالة، مثل سيكلوهيكسيميدي أو هارينجتونيني، منعا لجولة إعادة ريبوسوم أثناء الحصاد 3الخلية. واحدة من القيود المفروضة على استخدام مثبطات الترجمة أن المخدرات منتشر تدريجيا في الخلية، الذي يحفز تثبيط تدريجي من ريبوسوم 31. وعلاوة على ذلك، لا تمنع الأدوية الشروع في الترجمة أو إنهائها. نتيجة لذلك، ريبوسوم تتراكم في كودون بداية غير متناسب وتنضب في إيقاف كودون 8،،من2731. من أجل الحد من هذه القطع الأثرية، اخترنا فلاش تجميد الخلايا في النتروجين السائل، وتعامل مع سيكلوهيكسيميدي في وقت الاستخراج في تحلل المخزن المؤقت فقط.
رغم وجود عدد كبير نسبيا من التقارير التي استخدمت ريبو-Seq في الأنواع المختلفة، تفتقر إلى بروتوكولات موحدة لإجراء تحليل Seq ريبو. نتيجة لذلك، لا يمكن مقارنة ريبو-تسلسل البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة مختبرات مختلفة مباشرة. على سبيل المثال، كشفت مقارنة لنشر الريبوسوم التنميط datasets اختلافات كبيرة في النتائج بين الدراسات 32. وهذا يرجع جزئيا إلى التحسينات المستمرة التي بذلت كبروتوكول تطورت على مدى السنوات العديدة الماضية. وبالإضافة إلى ذلك، تعديل العديد من الباحثين الريبوسوم التنميط البروتوكول على اعتماده للاحتياجات المحددة لهذه الدراسة أو نموذج نظام 9،25. مواصلة توحيد الريبوسوم التنميط البروتوكول فضلا عن تحليل البيانات والتطبيع، سيتيح منع بعض التحيزات التجريبية وضمان القياس الكمي الدقيق واستنساخه في فيفو الترجمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح AG040191 و AG054566 على VML. أجرى هذا البحث في حين كان VML مستلم عفر "منحة بحثية" من "الاتحاد الأمريكي" "بحوث الشيخوخة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
