Summary
Переводческая регулирование играет важную роль в элементе белка изобилия. Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для количественного анализа перевода в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Перевод мРНК на белки — сложный процесс, с участием нескольких слоев регулирования. Часто предполагается, что изменения в мРНК транскрипции отражают изменения в синтезе белка, но было отмечено много исключений. Недавно называемый рибосома профилирования (или Рибо-Seq) возник как мощный метод, который позволяет идентифицировать, с высокой точностью, какие регионы мРНК переводятся на белки и количественная оценка перевода на уровне генома всей. Здесь мы представляем обобщенных протокол для количественного определения генома общесистемной перевода с помощью Рибо-Seq в многообещающий дрожжей. Кроме того сочетая Рибо-Seq данных с мРНК изобилие измерений позволяет нам одновременно количественную оценку эффективности перевода тысяч мРНК стенограммы в том же образце и сравнить изменения этих параметров в ответ на экспериментальной манипуляции или в различных физиологических состояниях. Мы описываем подробный протокол для поколения рибосома контуры с помощью нуклеиназы пищеварение, изоляции нетронутыми рибосомы след комплексов через сахарозы градиента фракционирования и подготовки ДНК библиотек для глубокой последовательности вместе с соответствующей контроль качества, необходимые для обеспечения точного анализа в естественных условиях перевода.
Introduction
мРНК перевод – один из основных процессов в клетке, которая играет важную роль в регуляции экспрессии белков. Таким образом перевод мРНК жестко контролируется в ответ на различные внутренние и внешние физиологические стимулы 1,2. Однако механизмы регуляции поступательные остаются изученными. Здесь мы описываем протокол для количественного определения генома общесистемной перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования. Общая цель метода профилирования рибосома является изучение и количественно перевод конкретные мРНК условиях различных клеточных. Этот метод использует секвенирование нового поколения для количественного анализа рибосома размещение на протяжении всего генома и позволяет контролировать уровень белка синтеза в естественных условиях на один кодон резолюции 3,4. В настоящее время, этот метод обеспечивает наиболее передовые средства измерения уровня белка перевода и оказался полезным открытием инструментом предоставления информации, которые не могут быть выявлены путем других имеющихся в настоящее время методов, например microarrays или перевод состояния массива анализ (TSAA) 5. Как рибосомы, отчеты о комбинированных изменения в уровнях Стенограмма и трансляционная вывода профилирования она также обеспечивает намного большую чувствительность, по сравнению с другими методами.
Этот подход основан на глубокой sequencing рибосомы защищенные мРНК фрагменты 3. В процессе перевода протеина, защищать рибосомы ~ 28 части nt мРНК (так называемый следы) 6. Определяя последовательность фрагментов рибосомы защищенный, Рибо-Seq можно сопоставить положение на переведенные мРНК рибосомы и определить, какие регионы мРНК, вероятно, активно воплощаться в протеин 3,7. Кроме того мы можем количественно измерить перевод мРНК, подсчитывая количество следов, которые присоединяются к стенограмме заданный мРНК.
Для того, чтобы изолировать фрагменты защищенных рибосомы, lysates клетки первоначально рассматриваются с ингибитор перевода в стойло рибосомы, следуют рибонуклеазы пищеварение. В то время как свободные мРНК и часть переведенных мРНК не защищены рибосомы деградировали, рибонуклеаза, фрагменты мРНК рибосомы защитой могут быть восстановлены очищая нетронутыми рибосомы след комплексов. Эти следы мРНК затем преобразуется в библиотеку cDNA и анализируемой глубокую последовательности (рис. 1). Параллельно для профилирования рибосомы нетронутыми мРНК извлекается из того же образца и виртуализации. Сравнивая уровень перевода определенных Рибо-Seq с мРНК изобилие измерения, мы можем выявить гены, которые специально вверх или вниз регулируемой на уровне перевода и рассчитать эффективность перевода мРНК на уровне генома всей. В то время как протокол, описанные в этой статье является специфичным для дрожжей, она должна быть также полезной для исследователей, которые будут пытаться установить протокол Рибо-Seq в других системах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. извлечь подготовка
- Полоска штаммов дрожжей из замороженных запасов для одной колоний на YPD пластины (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% раствор глюкозы и 2% агар). Инкубируйте пластины при 30 ° C в течение 2 дней.
- Прививок дрожжей от YPD пластины (использование одного колония) в 15 мл YPD среды (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% раствор глюкозы) в 50 мл конические пластиковых пробирок и расти на ночь встряхивании (200-250 об/мин) при 30 ° C.
- Разбавить культуры в 500 мл YPD среды в стерильную колбу 2 Л, так что OD600 < 0.1. Расти дрожжевых клеток с тряску при 30 ° C для 3-5 ч до600 OD = 0.5 (середина журнала фаза).
- Соберите клетки путем фильтрации через 0.45 мкм мембранные фильтры с помощью стекла держатель фильтра Ассамблеи. Скрип гранул с помощью шпателя, флэш-замораживание в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C. Ожидаемый размер замороженных Пелле ~ 0,2 - 0,5 г.
Предупреждение: Жидкий азот является крайне низкой температуры; надевайте соответствующую защиту. - Подготовьте свежие буфера Lysis (20 мм трис-HCl рН 8,0, 140 мм KCl, 5 мм2MgCl 100 мкг/мл циклогексимида, 0.5 мм DTT, 1% тритон X-100) непосредственно перед использованием, держать на льду.
- Положите 3 хром сталь бусины (3,2 мм) в 1.8 мл трубки из нержавеющей стали. Предварительно охладить в жидком азоте и добавить замороженных окатышей, накрыть силиконовый резиновый колпачок. Однородный образца по cryogrinding для 10 s при 4200 об/мин; Повторите 10 раз. Холод трубку в жидком азоте для по крайней мере 10 s между каждым раундом.
Примечание: Важно всегда держать образец заморожены. - Добавить 1 мл буфера Lysis, смешайте хорошо закупорить. Перевод на новый 1,5 мл трубки.
- Центрифуга на 20000 x g 5 мин при 4 ° C. Во время работы на льду, передачи супернатант в новой 1,5 мл трубку. Передавать 100 мкл lysate новой 1,5 мл трубки для poly(A) мРНК изоляции. Немедленно приступить к РНК изоляции или вспышки заморозить трубку в жидком азоте. Мера ОД260 остальной части lysate, который будет использоваться для извлечения след и flash замораживания труб в жидком азоте. Магазин лизатов-80 ° c.
2. след добыча
- Подготовка сахарозы градиентов
- Подготовка решения для 50%, 40%, 30%, 20% и 10%-ая сахароза в буфере градиента (20 мм трис-HCl рН 8,0, 140 мм KCl, 5 MgCl2, 100 мкг/мл циклогексимида, 0.5 мм DTT).
- Пипетка 2,2 мл подготовленный 50% сахарозы буфера в нижней части 13.2 мл трубки тонкостенные polyallomer и заморозить решение для 10 мин при температуре-80 ° C (рис. 2). Затем слой 2,2 мл 40% сахарозы буфера поверх замороженный буфер 50% сахарозы и заморозить на 10 мин при температуре-80 ° C. После же инструкции, слой 30%, а затем 20% и, наконец, 10% сахарозы буферов поверх друг друга. Избегайте воздушных пузырей во время наложения. Сохранить градиенты-80 ° c до использования. Сахароза градиенты следует подготовить по крайней мере за один день до эксперимента и хранятся при температуре-80 ° C.
- Нуклеаза пищеварение
- Оттепель градиенты сахарозы в ночь перед эксперименты на 4 ° C.
- Оттепель lysate (след образец клеток) на льду. Передача Алиготе ячейки lysate, содержащие 50 ОД260 единиц новой 1,5 мл трубки и добавить свежие литического буфера до 1 мл. Магазин, оставшиеся lysate-80 ° c. Добавить 10 мкл РНКазы я (100 U/мкл) и инкубировать 1 час при комнатной температуре с нежным ротации на голову над каблуки ротатора.
- (Необязательно) Уточнить образцы на 20000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и восстановить супернатант в новой 1,5 мл трубку.
- Ultracentrifugation
- Аккуратно слоя lysate образцов в верхней части 10-50% сахарозы градиента.
- Ультрацентрифуги polyallomer трубки на 210 000 x g (35 000 об/мин) при 4 ° C 3 h, с помощью ротора SW-41 Ti.
- Настройка градиента фракционирование системы
- Поверните на компоненты и позволяют УФ монитор для прогрева по крайней мере 30 минут.
- Если с помощью программного обеспечения цифровой рекордер, запустите программное обеспечение на компьютере, установите пределы масштабирования графа -0.01 и 1.
- Заполните шприц с раствором Чейз (20 мм трис-HCl рН 8,0, 140 мм KCl, MgCl 5 мм2, 60% сахарозы), удалить все пузырьки воздуха внутри шприца и канюли.
- Установите ультрацентрифуга трубки с водой, RNase бесплатно. Прокалывать трубку с канюлю до тех пор, пока две черные метки можно увидеть. Запустите шприцевый насос в 1 мл/мин.
- Как вода проходит через поток ячейку, нажмите кнопку «Auto Zero» на мониторе УФ для настройки базовых 0. Установка чувствительности УФ монитора «2.0 АС». После того, как был создан стабильный базовый, остановите шприцевой насос. Восстановление решение Чейз и снять трубку ультрацентрифугирования.
- Monosome изоляции
- Установить и проколоть ультрацентрифуга трубки, содержащие сахарозу градиента. Запустите шприцевый насос в 1 мл/мин, сбора фракций 1 мл, мониторинг254 значений. Бассейн фракций, представляющие пик monosome 80-х годов в одну трубу, держать на льду (рис. 3).
- После того, как решение Чейз достигнет потока, остановите шприцевой насос. Восстановление решение Чейз и снять трубку ультрацентрифугирования. Повторите фракционирование для остальной части образцов, начиная с шага 2.5.1.
Примечание: После завершения очистки фракционирование системы с по крайней мере 30 мл РНКазы свободной воды. Тщательно промойте трубы, шприц и все съемные компоненты с теплой водой. - Через 0,5 мл центробежные фильтры (100 кДа MWCO) фильтр фракций на 12000 g x 10 мин при температуре 4 ° C и отбросить потока через, повторять до тех пор, пока объем < 100 мкл. Добавьте 400 мкл буфера выпуска (20 мм трис-HCl pH 7.0, 2 мм ЭДТА, 40 ед/мл РНКазы ингибитора). Микс, дозирование, температуре лед 10 мин и перевести подразделение в новой коллекции трубку. Центрифуга на g 12000 x 10 мин при температуре 4 ° C и собирать потока через.
- Очищение части следа
- Передача потока через содержащих след РНК фрагменты новой 1,5 мл трубки, добавить 20 мкл 20% SDS (до конечной концентрации 1%), перемешать, закупорить.
- Добавить 1 объем кислоты-фенола: хлороформ (pH 4.5), вихревые для 10 s.
Предупреждение: Кислота-фенола: хлороформ токсичных, Избегайте контакта с кожей и ингаляции. - Тепло при 65 ° C за 5 мин, положить на льду за 1 мин центрифуги образца на 12000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, передать новой трубки 1,5 мл водной фазе (вверху).
- Осадок след РНК фрагменты, добавив 1/10 объема NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола.
3. Poly(A) мРНК добыча
- Общее извлечение RNA
- Оттепель 100 мкл Алиготе ячейки lysate (Всего РНК образца) на льду, добавьте 300 мкл 20 мм трис-HCl pH 7.0 и 20 мкл 20% SDS (до конечной концентрации 1%), перемешать, закупорить.
- Добавить 1 тома (400 мкл) кислоты-фенола: хлороформ (pH 4.5) и вихревые для 10 s.
- Тепло при 65 ° C за 5 мин, положить на льду за 1 мин центрифуги образца на 12000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, передать новой трубки 1,5 мл водной фазе (вверху).
- Выполните второй извлечение фенола. Добавить 1 объем кислоты-фенола: хлороформ (pH 4.5), вихревые для 10 s. тепла при 65 ° C за 5 мин, положить на льду за 1 мин центрифуги образца на 12000 x g 5 минут при температуре 4 ° C, передать новой трубки 1,5 мл водной фазе.
- Осадок РНК. Для этого добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
- Poly(A) мРНК изоляции
- Центрифугуйте образцы РНК в 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки, и воздух сухой Пелле за 5 мин.
- Растворяют гранулы в 300 мкл буфера Lysis/привязки из комплекта изоляции мРНК poly(A). Перейти к poly(A) мРНК извлечения по протоколу мРНК poly(A) изоляции комплект Производитель.
- Осадок образцов mRNA, добавив 1/10 объема 3 M NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
- Фрагментация мРНК
- Центрифугуйте образцы мРНК на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 сек, удалите остальные этанола с гель загрузкой наконечник и воздух сухой Пелле за 5 мин.
- Ресуспензируйте мРНК в 18 мкл РНКазы свободной воды, добавить 2 мкл 10 x буфер фрагментации РНК. Инкубировать 5 мин на 94° C. Передача трубки для льда.
- Осадок, добавив 1/10 объема 3 M NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
4. дефосфорилирование
- Относиться к след и фрагментированные образцы мРНК с T4 полинуклеотид киназы. Для этого Центрифугуйте образцы на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с гель загрузки подсказки. Воздух сухой Пелле за 5 мин.
- Ресуспензируйте гранулы в 7,75 мкл воды, добавить 1 мкл 10 буфер киназы полинуклеотид x T4, 1 мкл T4 полинуклеотид киназы (10000 ед/мл) и 0,25 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл). Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
- (Необязательно) Предварительно запустите гель КЭ мочевину 15% на 180 V 15 мин с использованием 1 x TBE буфера.
- Добавьте 10 мкл 2 X буфер образца КЭ мочевины 10 мкл каждого следа и мРНК образца. Подготовить образец элемента управления, содержащие 1 мкл 10 мкм верхний размер маркера олигонуклеотида (32 nt), 1 мкл 10 мкм Нижний размер маркера олигонуклеотида (28 nt), 8 мкл воды и 10 мкл 2 х кэ мочевина буфер образца для образцов след. Подготовить образец элемента управления, содержащие 1 мкл 10 мкм РНК маркер олигонуклеотида (63 nt), 9 мкл воды и 10 мкл 2 х кэ мочевина буфер образца для образцов mRNA.
- Проинкубируйте образцы и контроль 3 мин при 75 ° C, спина вниз, положил на льду за 1 мин загрузки каждого образца в 2 скважины 15% геля КЭ мочевина, отдельные фрагменты РНК электрофорезом геля на 180 V на 1 ч.
- Пятно гель для 5 мин с пятно гель нуклеиновой кислоты (разбавленной 10 000 x в воде), защищать от света.
- С помощью синего света transilluminator, вырезать надлежащего полосы между 28 и 32 nt маркеров для след образцов (рис. 4A) и около 50-70 nt для мРНК образцов (рис. 4B) с чистым лезвием. Заморозить геля полиакриламида штук на-80 ° C для по крайней мере 10 мин.
- Извлечь РНК из геля полиакриламида следующим образом. Тепло гель штук при 70 ° C на 2 мин, шлифуют гель, с помощью одноразовых Пелле пестики. Элюировать РНК с 300 мкл Элюирующий буфер (20 мм трис-HCl pH 7.0, 2 мм ЭДТА), добавить 1 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл) и инкубировать при 37 ° C в течение 3 ч.
- Центрифугуйте образцы на 12000 g x 5 минут при температуре 4 ° C, собирать супернатанта и осадок, добавив 1/10 объема NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
5. 3'-адаптер лигирование
- Центрифугуйте образцы след и мРНК на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки. Воздух сухой Пелле за 10 мин.
- Ресуспензируйте гранулы в 4,75 мкл нуклеиназы свободной воды, 2 мкл 50% PEG8000, 1 мкл 10 X T4 РНК лигаза буфера, 1 мкл 3'-адаптер (100 нг/мкл), 0,25 мкл битор РНКазы (20 U/мкл), 1 мкл T4 РНК лигаза 2 усечены KQ (200 000 ед/мл). Инкубируйте на ночь на 16 ° C.
- Наутро, удалите избыток адаптера, добавив 0.5 мкл 5'-deadenylase (10 U/мкл) и 0,5 мкл Rec J при exonuclease (10 U/мкл) непосредственно к реакции перешнуровки. Инкубируйте 30 мин при температуре 30 ° C.
- Осадок образцы. Для этого добавьте 30 мкл нуклеиназы свободной воды, 1 мкл гликогена (10 мг/мл), 1/10 объема NaOAc (рН 5,5) и 2,5 томов 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
6. Обратная транскрипция
- Центрифугуйте образцы на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки. Воздух сухой Пелле за 10 мин.
- Ресуспензируйте гранулы в 11,5 мкл нуклеиназы свободной воды, добавить 0,5 мкл 8 мкм обратной транскрипции грунтовка (праймер RT) и 1 мкл dNTP смеси (10 мм). Инкубировать в течение 5 мин при температуре 65 ° C, на льду.
- 4 мкл 5 X первая прядь буфера, 2 мкл 0,1 м DTT, 0.5 мкл битор РНКазы (20 U/мкл), 0.5 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Инкубируйте 30 мин при 48 ° C, 1 мин при 65 ° C, 5 мин при температуре 80 ° C.
- Не осадок и немедленно приступить к гидролизу РНК, добавив 0,8 мкл 2 M NaOH, инкубировать 30 мин при 98 ° C. 0,8 мкл 2 М HCl для нейтрализации реакции.
- Осадок образцы.
7. рецензий
- Центрифугуйте образцы на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки, и воздух сухой Пелле за 10 мин.
- Ресуспензируйте гранулы в 16,75 мкл воды, свободной от нуклеиназы. 2 мкл 10 x одноцепочечной ДНК (ssDNA) лигаза буфера, 1 мкл 50 мм НКД2, 0,25 мкл ssDNA лигаза (100 U/мкл). Инкубировать 1 час при температуре 60 ° C, 10 мин на 80 ° C. Не осадок и хранить продукт реакции перешнуровки ssDNA при-20 ° C.
8. ПЦР-амплификации Библиотека
- В то время как рабочие на льду, смешать в ПЦР-пробирку следующее: 146 мкл нуклеиназы свободной воды, 2 мкл 20 мкм вперед грунт, 2 мкл 20 мкм индексируются вспять грунт, 40 мкл 5 x высокой четкости ДНК полимеразу буфера, 4 мкл дНТФ (10 мм), 4 мкл продукт реакции перешнуровки ssDNA и 2 мкл высокой верности ДНК-полимеразы. Выбор различных индексированных вспять грунтовка для каждого образца, который будет мультиплексированных для виртуализации. Передача 50 мкл Алиготе смеси ПЦР в 4 новых ПЦР-пробирки.
- Выполните амплификации PCR с различным числом циклов (8, 10, 12, 14) с использованием следующих параметров:
1 мин на первоначальный денатурации 98 ° C
8-14 циклов:
15 s на 94 ° C
5 s при 55 ° C
10 s при 65 ° C
2 мин на окончательное расширение 65 ° C - Осадок продукт PCR, добавив 1/10 объема 3 M NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
- Центрифугуйте образцы на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки, и высушите на воздухе в гранулы.
- Ресуспензируйте гранулы в 8 мкл нуклеиназы свободной воды, 2 мкл-денатурации 5 x буфер образца нуклеиновых кислот. Загрузите образец на 1 хорошо-Денатурирующий гель КЭ 8%. Отдельные продукты ДНК электрофорезом геля на 150 V 35 мин. Как элемент управления подготовить образец, содержащий 0,5 мкл 10 bp ДНК лестница (1 мкг/мкл), 7,5 мкл воды и 2 мкл-денатурации 5 x буфер образца нуклеиновых кислот и работать на отдельном Лейн геля.
- Пятно гель для 5 мин с пятно гель нуклеиновой кислоты (разбавленной 10 000 x в воде), защищать от света. С помощью синего света transilluminator, вырезать полосе около 150 bp для след образцов и около 180 bp для образцов mRNA (рис. 6) с чистым лезвием. Храните гель куска-80 ° C для по крайней мере 10 мин.
- Тепло гель штук при 70 ° C на 2 мин, шлифуют гель, с помощью одноразовых Пелле пестики. Элюировать ДНК с 300 мкл 20 мм трис-HCl рН 7.0 и инкубировать при 37 ° C в течение 3 ч.
- Центрифугуйте образцы на 12000 x g, за 5 мин при температуре 4 ° C, собирать супернатанта и осадок, добавив 1/10 объема NaOAc (рН 5,5), 1/100 гликогена (10 мг/мл) и 2.5 тома 100% этанола. Инкубируйте в-20 ° C для по крайней мере 1 час.
- Центрифугуйте образцы на 20000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C, удалите этанола. Спин вниз 30 s Макс скорость, удалите остальные этанола с наконечником гель загрузки, и высушите на воздухе в гранулы. Наконец Ресуспензируйте библиотек в 20 мкл нуклеиназы свободной воды и провести количественную оценку, контроль качества и последовательности.
9. Библиотека количественной и высокопроизводительного секвенирования
- Перед отправкой образцов для виртуализации, определите, урожайность и качество библиотек, ПЦР усиливается. Представитель профили для библиотек последовательность мРНК и след показаны на рисунке 7. Ожидаемый размер библиотеки ПЦР усиливается-148-152 bp для образцов, след и 170-190 bp для образцов mRNA.
- Если несколько образцов с различных штрихкодами будет выполняться для последовательности, выполнения точной количественной библиотек с помощью на основе ПЦР секвенирования библиотека квантификация assay.
- Объединять библиотеки в эквимолярных соотношениях. Вычислить общий объем пула как 3 мкл x общее количество образцов, чтобы объединить. Определите объем каждой библиотеки, которую необходимо добавить, что библиотеки являются смешанными в эквимолярных соотношениях для достижения 10 Нм конечная концентрация бассейна. Расчетные объемы каждой библиотеки в новой 1,5 мл трубки, смешивать, закупорить. Добавьте воду для достижения расчетный общий объем. Хранить в пуле библиотек при-20 ° C.
- Отправьте Алиготе пуле библиотеки для виртуализации с использованием 50 bp один конец последовательности на платформе Illumina последовательности. Мы регулярно мультиплекс 12 образцов в одной последовательности, выполнения, который дает ~ 200 миллионов читает в последовательности Лейн.
Примечание: Окончательное количество считываний след, собранных за каждый образец зависит количество исходного материала и уровня загрязнения рРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подробные трубопроводов для анализа bioinformatic рибосомы, Профилирование данных были описаны ранее 8,9. Кроме того несколько исследовательских групп разработали Биоинформатика инструменты для дифференциальной ген выражение анализа и обработки последовательности данных, которые являются специфическими для рибосомы, профилирование метода 10,11,12 ,13,14,,1516,17,18. Первым шагом в анализе-Рибо-Seq данных демультиплексирование и обрезки последовательности адаптер 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT, с помощью программного обеспечения Cutadapt 19. Затем считывает последовательность выравниваются против некодирующих РНК, например рРНК и тРНК, удаление загрязняющих последовательности, с помощью Боути 20 и читает, которые не соответствуют затем сопоставляются с геном дрожжей. Читайте количество в ген может затем оценены HTseq фото программное обеспечение 21, и дифференциально выраженной гены идентифицируются с помощью DESeq2 22.
На рисунке 8 показана представитель результаты количественного анализа перевода в hbs1Δ 23,24 дрожжи удаления мутантов, которые были получены с помощью нашего протокола. Во-первых мы оценили количество и доля чтений, которые соответствуют некодирующих РНК (например теорией), полученные после секвенирования след и мРНК библиотек, созданного для одичал тип клеток и hbs1Δ мутант. Мы обнаружили, что, даже без каких-либо рРНК истощения шаги (см. ниже), от 50 до 60% всех виртуализированных гласит в наш след библиотек соответствуют рибосомы защищенные след фрагментов (рис. 8A). Напротив только 3% рРНК, полученных фрагментов наблюдались в библиотеках мРНК, демонстрируя, что poly(A) мРНК изоляции позволяет эффективное устранение рРНК читает. Вместе, мы смогли получить более 10 миллионов след чтения для каждого из образцов след в последовательности 2 реплицирует. Для оценки изменчивости библиотека поколения и воспроизводимости данных, мы обычно анализ по крайней мере двух независимых биологических реплицирует за каждой экспериментальной условие. След и мРНК библиотек образцов показывают хорошую воспроизводимость с коэффициент корреляции Пирсона R ~ 0.99 между образцов (Рисунок 8B).
В дополнение к оценке уровня белка перевода на уровне генома всей, рибосома профилирования позволяет измерения изменения в эффективности перевода между экспериментальных условиях 3. Для этого Алиготе lysate клетки (не относиться с рибонуклеаза) используется для изоляции мРНК poly(A) и подготовка РНК-Seq библиотеки. Потому что след библиотеки и библиотеки РНК-Seq готовятся же контролируемых условиях и можно проследить каждый индивидуальный реплицировать, Рибо-Seq и РНК-Seq наборы данных можно непосредственно по сравнению с идентификации генов, которые регулируются изменения в мРНК Транскрипция, эффективность перевода, или комбинированный эффект. Для идентификации генов, которые регулируются вверх или вниз специально на уровне перевода белка в hbs1Δ мутант, мы рассчитали изменения в эффективности перевода путем деления значения rpkm след мРНК rpkm для каждого из генов (Рисунок 8 c).
Рисунок 1: Обзор протокола Рибо-Seq. Весь протокол могут быть выполнены в приблизительно 11 дней. Предполагаемое время для каждого шага отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: подготовка сахарозы градиенты Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель сахарозы градиента профили. (A) получил сахарозы градиента профиль для управления (не относиться с РНКазы я) образца. (B) для того чтобы извлечь защищенные рибосома фрагменты РНК, lysates клетки лечат РНКазы я за 1 ч при комнатной температуре (RT). Фракции, соответствующий monosomal пик затем собираются для извлечения след. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель изображения 15% акриламидных гелей, полученные после лечения киназы полинуклеотид T4. (A) размер среза подакцизным гель вокруг 28 и 32 nt показано для образцов след. (B) вырезать фрагмент гель о 50-70 nt для образцов mRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель изображения 10% акриламидных гелей, полученные после обратной транскрипции. (A) вырезать Верхняя полоса ~ 128 nt для след образцов, соответствующий продукт обратной транскрипции. (B) вырезать полосы вокруг 150-170 nt для образцов mRNA (верхняя группа). Нижней полосы соответствуют RT грунтовка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: очищение геля полиакриламида ПЦР усиливается библиотек. Продукты PCR, полученные после 8, 10, 12 и 14 циклов усиления библиотеки были урегулированы на-Денатурирующий гель КЭ 8%.Размер библиотек полнометражного след ~ 150 bp, тогда как размер мРНК библиотек ~ 170-190 bp. избежать Нижняя полоса, не содержащий вставки.
Рисунок 7: анализ Bioanalyzer. (A) представитель Bioanalyzer профили ПЦР усиливается след библиотеки. Ожидается, что средний размер библиотеки след быть от 148 до 152 nt. (B) представитель Bioanalyzer профили последовательности библиотеки полученных образцов mRNA. Ожидаемый размер библиотеки мРНК-170-190 nt. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: представитель результаты. (A) количество мРНК, след и рРНК читает, полученные для образца дикого типа и мутантов hbs1Δ. Комбинированные количество операций чтения, порожденных последовательности, которую два биологических реплицирует показываются одичал тип клеток и hbs1Δ мутант. (B) воспроизводимость след и мРНК изобилие измерений между двумя реплицирует. Коэффициенты корреляции Пирсона (R) указаны. (C) Transcriptional и поступательные изменения в hbs1Δ мутант. Значительно регулируется вверх и вниз регулируется генов в hbs1Δ сгруппированы в соответствии с ли они затрагиваются изменением в мРНК транскрипции, эффективность перевода, или комбинированный эффект. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Праймеры | Последовательность | Индекс | ||||
| 3' адаптер (100 нг/мкл) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC / | |||||
| Грунтовка RT | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Форвард праймера PCR | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Индекс грунтовка 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Грунтовка индекс 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Индекс грунт 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Индекс грунтовка 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Индекс грунтовка 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Индекс праймера 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Таблица 1: 3' адаптер и грунтовка последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рибо-Seq подход стал мощной технологии для анализа мРНК перевод в естественных условиях в геноме общесистемного уровня 3. Исследования с использованием этого подхода, который позволяет следить за перевод с одного кодон резолюции, способствовала нашего понимания трансляционная регулирования. Несмотря на свои преимущества Рибо-Seq имеет ряд ограничений. Фрагменты рибосомная РНК (рРНК) всегда совместной очищенную во время изоляции рибосомы защищенный следы, снижение урожайности считывает полезные последовательности, которые могут быть получены в Рибо-Seq эксперименты 9,25. Наши данные показывают, что загрязнение рРНК может способствовать как 40-50% всех операций чтения (рис. 8). Один из путей преодоления этого ограничения является увеличение глубины последовательности. Дополнительные раунды последовательности должны быть выполнены, пока не будет достигнуто требуемое количество последовательности чтения для каждого из анализируемых образцов. Анализ последовательности библиотек, подготовленный с помощью нашего протокола показывает, что более чем 5 миллионов след читает могут быть получены для каждой библиотеки, след, когда 12 образцы являются мультиплексированных вместе в стандартной 50-bp сингл конце на платформе Illumina HiSeq 2000. Однако если наблюдается значительное загрязнение с рРНК, необязательный шаг удаления рРНК могут выполняться.
Одна из стратегий для удаления рРНК загрязнять фрагменты из след библиотек является использование субтрактивный гибридизации с биотинилированным олигонуклеотиды, как описано ранее, 8,26,27. Кроме того рРНК загрязнять читает могут быть удалены с помощью коммерчески доступные наборы истощения рРНК. Для этого, исследователи могут выполнять рРНК истощения на очищенной 3'-адаптер лигируют след фрагментов из шага 5.4. Следующие рРНК истощение, след образцы могут быть химически осажденный и используется непосредственно для обратной транскрипции (шаг 6), как описано в протоколе.
Помимо очистки monosomes, используя сахарозу градиента фракционирования, описанных в нашем протокол были разработаны несколько методов, которые используют на основе столбцов очистки 28 и ultracentrifugation через подушку сахароза 8 ,29. Хотя эти методы могут ускорить процесс подготовки библиотека след и менее технически сложной по сравнению с сахарозой градиента фракционирования, они не позволяют качественный анализ очищенный monosomes и эффективности Нуклеаза пищеварение шаг. Недавно было показано выбор нуклеиназы влияют на эффективность очистки рибосомы защищенные фрагменты РНК в 30различных видов. Хотя было показано, что РНКазы в lysates клетки дрожжей, ее деятельность надежной деятельности влияют на целостность рибосомы в мыши тканей, а также плодовых мушек. Таким образом выбор и концентрации нуклеиназы должна быть оптимизирована при принятии этого протокола для других видов.
Еще одним важным соображением является использование ингибиторов перевода. Большинство протоколов для профилирования рибосома обычно включают лечение клетки с удлинением ингибиторы, такие как циклогексимида или harringtonine, с целью предотвращения стока рибосомы во время сбора урожая 3ячейки. Одним из ограничений использования ингибиторов перевода является, что наркотики диффузного постепенно в клетку, вызывая прогрессивного ингибирование рибосомы 31. Кроме того препараты не препятствовали перевод начала или прекращения. Как следствие рибосомы непропорционально накапливаться на начало кодон и истощаются в стоп-кодон- 8,27,31. Для того, чтобы ограничить этот артефакт, мы решили флэш-заморозить клетки в жидком азоте и лечения с циклогексимида во время извлечения литического буфера только.
Несмотря на относительно большое количество докладов, которые использовали Рибо-Seq в различных видов отсутствуют стандартизированные протоколы для проведения анализа Рибо-Seq. Как следствие нельзя напрямую сравнивать Рибо-Seq данные, полученные в различных лабораториях. Например сравнение опубликованных рибосомы, Профилирование данных показало значительные расхождения в результатах среди исследований 32. Это отчасти из-за непрерывного улучшения, которые были сделаны как протокол, эволюционировали за последние несколько лет. Кроме того многие исследователи изменение рибосомы, профилирование протокол ее адаптации к конкретным потребностям их учебы или модель системы 9,25. Дальнейшей стандартизации рибосомы, профилирование протокола, а также анализ данных и нормализации, позволит предотвращения некоторых из экспериментальной предубеждения и обеспечить точные и воспроизводимые количественная оценка перевода в естественных условиях .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов AG040191 и AG054566 в VML. Это исследование было проведено в то время как VML — Кавалер Афар исследовательский грант от американской Федерации за старение научных исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
