Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Published: December 21, 2017 doi: 10.3791/56820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

Summary

Translationell förordning spelar en viktig roll i kontrollen av protein överflöd. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för kvantitativ analys av översättning i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Översättning av mRNA till proteiner är en komplex process som involverar flera lager av förordning. Det antas ofta att förändringar i mRNA transkription återspegla förändringar i proteinsyntesen, men många undantag har observerats. Nyligen, en teknik som kallas ribosomer profilering (eller Ribo-Seq) har vuxit fram som en kraftfull metod som möjliggör identifiering, med hög noggrannhet, vilka regioner av mRNA översätts till proteiner och kvantifiering av översättning på genome-wide nivå. Här presenterar vi en generaliserad protokoll för genome-wide kvantifiering av översättning med Ribo-Seq i spirande jäst. Dessutom tillåter kombinera Ribo-Seq data med mRNA överflöd mätningar oss att samtidigt kvantifiera översättning effektivitet av tusentals mRNA avskrifter i samma prov och jämföra förändringar av dessa parametrar som svar på experimentella manipulationer eller i olika fysiologiska tillstånd. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av Ribosomen fotspår med nuclease-nedbrytning, isolering av intakt Ribosomen-fotavtryck komplex via sackaros gradient fraktionering och beredning av DNA bibliotek för djupsekvensering tillsammans med lämpliga kvalitetskontroller som är nödvändiga för att säkerställa korrekt analys av in-vivo översättning.

Introduction

mRNA översättning är en av de grundläggande processerna i cellen, som spelar en viktig roll i regleringen av proteinuttryck. Därför kontrolleras tätt mRNA översättning svar till olika interna och externa fysiologiska stimuli 1,2. Mekanismerna för translationell förordning dock understudied. Här beskriver vi protokollet för genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering. Det övergripande målet med Ribosomen profilering tekniken är att studera och kvantifiera översättningen av specifika mRNA under olika cellulära förhållanden. Denna teknik använder nästa generations sekvensering att kvantitativt analysera Ribosomen beläggning i hela genomet och tillåter övervakning av proteinsyntes i vivo på enda kodon resolution 3,4. För närvarande, denna metod ger de mest avancerade metoder för att mäta nivåerna av protein översättning, och har visat sig vara en användbar upptäckt verktyg som ger information som inte kan avslöjas genom andra tillgängliga tekniker, e.g. microarrays eller Översättning staten array analys (TSAA) 5. Som Ribosomen profilering rapporter på de sammanslagna förändringarna i avskrift nivåer och translationell utgång, ger det också mycket större känslighet jämfört med andra metoder.

Denna strategi är baserad på djupsekvensering av Ribosomen-skyddade mRNA fragment 3. Under protein översättning, ribosomer skydda ~ 28 nt delar av mRNA (kallas fotspår) 6. Genom att bestämma sekvensen av Ribosomen-skyddade fragment, kan Ribo-Seq kartlägga placeringen av ribosomer på översatta mRNA och identifiera vilka områden i mRNA sannolikt översättas aktivt till protein 3,7. Dessutom kan vi kvantitativt mäta översättningen av mRNA genom att räkna antalet fotspår som anpassas till en viss mRNA-avskrift.

För att isolera de ribosom-skyddade fragment, behandlas cell lysates initialt med en översättning-hämmare till stall ribosomerna följt av ribonunkleas matsmältningen. Medan gratis mRNA och delar av översatta mRNA inte skyddas av ribosomer är förstörd av ribonunkleas, kan ribosom-skyddade mRNA fragment återvinnas genom att rena intakt Ribosomen-fotavtryck komplex. Dessa mRNA fotspår är sedan omvandlas till cDNA bibliotek och analyseras genom djupsekvensering (figur 1). Parallellt till Ribosomen profilering, intakt mRNA extraheras från samma prov och sekvenserade. Genom att jämföra nivån på översättning identifieras av Ribo-Seq med mRNA överflöd mätningar, kan vi identifiera gener som är specifikt upp - eller ner-reglerade i nivå med översättning och beräkna effektivitet i mRNA på genome-wide nivå. Protokollet beskrivs i denna artikel är specifika för jäst, bör det också vara användbar för forskare som försöker upprätta protokollet Ribo-Seq i andra system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. extrahera förberedelse

  1. Strimma jäststammar från fryst lager för enstaka kolonier på YPD plattor (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos och 2% agar). Inkubera plattorna vid 30 ° C i 2 dagar.
  2. Inokulera jäst från ett YPD plattan (Använd en enda koloni) till 15 mL YPD medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) i en 50 mL konisk centrifugrör och växa över natten med skakningar (200-250 rpm) vid 30 ° C.
  3. Späd kultur i 500 mL YPD medium i en 2 L sterila mätkolv, så att den OD600 < 0,1. Växa jästceller med skakningar vid 30 ° C för 3-5 h tills OD600 = 0,5 (mitten av log fas).
  4. Samla celler genom filtrering genom 0,45 μm membranfilter med en glas innehavaren filterenhet. Skrapa pelleten med en spatel, flash frysa i flytande kväve, och lagra vid-80 ° C. Den förväntade storleken av den frysta pelleten är ~ 0,2 - 0,5 g.
    Varning: Flytande kväve är extremt låga temperatur; bär lämpligt skydd.
  5. Förbereda en färsk lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, Kungliga Automobilklubben 100 μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Triton x-100) omedelbart före användning, hålla på is.
  6. Sätta 3 kromstål pärlor (3,2 mm) till en 1,8 mL rostfritt stålrör. Pre chill i flytande kväve och Lägg frysta pellets, täck med badmössa silikon gummi. Homogenisera provet genom cryogrinding för 10 s vid 4200 rpm; Upprepa 10 gånger. Chill röret i flytande kväve för minst 10 s mellan varje omgång.
    Obs: Det är viktigt att alltid hålla provet fryst.
  7. Tillsätt 1 mL lyseringsbuffert, blanda väl genom pipettering. Överför till en ny 1,5 mL tub.
  8. Centrifugera vid 20 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Medan du arbetar på is, över supernatanten till en ny 1,5 mL tub. Överför 100 μL av lysat till en ny 1,5 mL tub för poly(A) mRNA isolering. Fortsätt direkt till RNA isolering eller flash frysa röret i flytande kväve. Åtgärd OD260 i resten av den lysate, som kommer att användas för extraktion av fotavtryck, och flash frysa rören i flytande kväve. Lagra lysates vid-80 ° C.

2. fotavtryck utvinning

  1. Beredning av sackaros övertoningar
    1. Förbereda lösningar för 50%, 40%, 30%, 20% och 10% sackaros i Gradient buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, Kungliga Automobilklubben 100 μg/mL, 0,5 mM DTT).
    2. Pipettera 2.2 mL beredd 50% sackaros bufferten längst ned på 13,2 mL tunnväggiga polyallomer röret och frysa lösningen för 10 min vid-80 ° C (figur 2). Sedan lager 2.2 mL av 40% sackaros buffert ovanpå frysta 50% sackaros bufferten och frysa i 10 min vid-80 ° C. Efter samma instruktioner, lager 30%, och sedan 20%, och slutligen 10% sackaros buffrar ovanpå varandra. Undvik att göra luftbubblor medan skiktning. Hålla lutningarna vid-80 ° C fram till användning. Sackaros Övertoningarna görs minst en dag innan experimentet och lagras vid-80 ° C.
  2. Nuclease-nedbrytning
    1. Tina sackaros lutningarna kvällen innan experiment vid 4 ° C.
    2. Tina cell lysate (Footprint prov) på is. Överför en alikvot av cell lysate innehållande 50 OD260 enheter till en ny 1,5 mL tub och tillsätt färsk lyseringsbuffert till 1 mL. Lagra de återstående lysate vid-80 ° C. Tillsätt 10 μL RNase jag (100 U/μL) och inkubera 1 h i rumstemperatur med varsam rotering på en head-over-heels rotator.
    3. (Valfritt) Klargöra proverna vid 20 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C och återställa supernatanten till en ny 1,5 mL tub.
  3. Ultracentrifugering
    1. Försiktigt lager lysate prover till toppen av en 10-50% sackaros övertoning.
    2. Ultracentrifugen polyallomer rör vid 210 000 x g (35.000 rpm) vid 4 ° C för 3 h med SW-41 Ti rotor.
  4. Gradient fraktionering systeminställning
    1. Slå på komponenterna och tillåter UV monitorn att värma upp i minst 30 min.
    2. Om använder en digital inspelare programvara, starta programvaran på datorn, ange diagrammets skalning gränser -0,01 och 1.
    3. Fyll sprutan med Chase lösning (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% sackaros), avlägsna eventuella luftbubblor inuti sprutan och kanylen.
    4. Installera en ultracentrifugen tube fylld med RNase-gratis vatten. Pierce röret med kanylen tills två svarta märken kan ses. Starta sprutpumpen vid 1 mL/min.
    5. När vattnet passerar cellen flöde, tryck ”Auto Zero” knappen på UV bildskärmen för att justera baslinjen till 0. Ställa in känsligheten av UV bildskärmen för att ”2.0 AU”. Efter en stabil baslinje har ställts in, Stoppa sprutpumpen. Återställa Chase lösningen och ta bort ultracentrifugen röret.
  5. Monosome isolering
    1. Installera och genomborra ultracentrifugen röret som innehåller sackaros övertoningen. Starta sprutpumpen vid 1 mL/min, samla 1 mL fraktioner övervakning ett254 -värden. Pool fraktioner som representerar 80S monosome topp i en tub, hålla på is (figur 3).
    2. När Chase lösning når cellen flöde, Stoppa sprutpumpen. Återställa Chase lösning och ta bort ultracentrifugen röret. Upprepa fraktionering för resten av proverna början vid steg 2.5.1.
      Obs: När du är klar, ren fraktionering systemet med minst 30 mL RNase-gratis vatten. Tvätta slangar, spruta och alla borttagbara komponenter med varmt vatten.
    3. Filtrera fraktioner genom 0,5 mL centrifugal filter (100 kDa MWCO) på 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och kassera genomströmmande, upprepa tills volymen är < 100 μL. Tillsätt 400 μL av Release buffert (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase inhibitor). Mix av pipettering, inkubera på is 10 min och överföra enheten till en ny samling tub. Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och samla genomflöde.
  6. Fotavtryck fragment rening
    1. Överföra de genomströmmande innehållande fotavtryck RNA fragment till en ny 1,5 mL tub, tillsätt 20 μL av 20% SDS (till en slutlig koncentration av 1%), blanda genom pipettering.
    2. Lägg till 1 volymdel syra-fenol: kloroform (pH 4,5), virvel för 10 s.
      Försiktighet: Syra-fenol: kloroform är giftigt, Undvik kontakt med hud och inandning.
    3. Värm på 65 ° C i 5 min, på is för 1 min. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, överföra den vattenhaltiga fasen (överst) till en ny 1,5 mL tub.
    4. Fällningen fotavtryck RNA fragment genom att lägga till 1/10 volym av NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol.
Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.

3. Poly(A) mRNA utvinning

  1. Total RNA-extraktion
    1. Tina en 100 μl alikvot av cell lysate (Total RNA -prov) på is, tillsätt 300 μL av 20 mM Tris-HCl pH 7,0 och 20 μL av 20% SDS (till en slutlig koncentration av 1%), blanda genom pipettering.
    2. Tillsätt 1 volym (400 μL) av syra-fenol: kloroform (pH 4,5) och virvel för 10 s.
    3. Värm på 65 ° C i 5 min, på is för 1 min. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, överföra den vattenhaltiga fasen (överst) till en ny 1,5 mL tub.
    4. Utföra en andra fenol-extraktion. Lägg till 1 volymdel syra-fenol: kloroform (pH 4,5), virvel för 10 s. värme vid 65 ° C i 5 min, sätta på is för 1 min. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, överföra vattenfasen till en ny 1,5 mL tub.
    5. Fällningen RNA. Lägg till 1/10 volym 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol för detta. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.
  2. Poly(A) mRNA isolering
    1. Centrifugera de RNA-proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning spets, och luften torr pelleten i 5 min.
    2. Lös pelleten i 300 μL av Lys/bindande buffert från poly(A) mRNA isolering kit. Gå vidare till poly(A) mRNA extraktion enligt poly(A) mRNA isolering kit tillverkarens protokollet.
    3. Fällningen mRNA proverna genom att lägga till 1/10 volym 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.
  3. mRNA fragmentering
    1. Centrifugera mRNA proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 SEK, ta bort resten av etanol med en gel-lastning tip och torka pelleten i 5 min.
    2. Återsuspendera mRNA i 18 μL RNase-gratis vatten, tillsätt 2 μL 10 x RNA fragmentering buffert. Inkubera i 5 min vid 94° C. Överföra röret till is.
    3. Fällningen genom att lägga till 1/10 volym 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.

4. Defosforylering

  1. Behandla fotavtryck och fragmenterade mRNA prover med T4 polynucleotide tyrosinkinashämmare. För detta, Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel som laddar tip. Luften torr pelleten i 5 min.
  2. Återsuspendera pelleten i 7.75 µL av vatten, tillsätt 1 µL 10 x T4 polynucleotide kinase buffert, 1 µL T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL) och 0,25 µL av RNase inhibitor (20 U/µL). Inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
  3. (Valfritt) Pre köra en 15% TBE-karbamid gel vid 180 V för 15 min med 1 x TBE buffert.
  4. Tillsätt 10 µL av 2 X TBE-urea prov buffert till 10 µL av varje fotavtryck och mRNA prov. Förbereda ett kontrollprov innehållande 1 µL 10 µM övre storlek markör oligonukleotiden (32 nt), 1 µL 10 µM lägre storlek markör oligonukleotiden (28 nt), 8 µL vatten och 10 µL 2 x TBE-urea prov buffert för fotavtryck prover. Förbereda ett kontrollprov innehållande 1 µL 10 µM RNA markör oligonukleotiden (63 nt), 9 µL vatten och 10 µL 2 x TBE-urea prov buffert för mRNA prover.
  5. Inkubera de prover och kontroller 3 min vid 75 ° C, snurra ner, lägga på is för 1 min. Fyll varje prov i 2 brunnar av 15% TBE-karbamid gel, separat RNA fragment med gelelektrofores på 180 V för 1 h.
  6. Fläcken gelen för 5 min med en nukleinsyra gel fläck (utspädd 10.000 x i vatten), skyddas från ljus.
  7. Använda en blå ljus transilluminator, skär rätt bandet mellan 28 och 32 nt markörer för fotavtryck prover (figur 4A) och cirka prover 50-70 nt för mRNA (figur 4B) med en ren rakblad. Frysa Polyakrylamidgelen bitar vid-80 ° C i minst 10 min.
  8. Extrahera RNA från Polyakrylamidgelen enligt följande. Värm gelen bitar vid 70 ° C i 2 min, slipa gelen med disponibla pellet mortlar. Eluera RNA med 300 µL eluering buffert (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), Lägg till 1 µL RNase inhibitor (20 U/µL) och inkubera vid 37 ° C i 3 h.
  9. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, samla supernatanten och fällningen volymprocent lägga 1/10 av NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.

5. 3'-adapter ligatur

  1. Centrifugera fotavtryck och mRNA proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning-spets. Luften torr pelleten i 10 min.
  2. Återsuspendera pelleten i 4,75 µL nuclease-gratis vatten, 2 µL av 50% PEG8000, 1 µL 10 X T4 RNA ligase buffert, 1 µL 3'-adapter (100 ng/µL), 0,25 µL av RNase inhibitor (20 U/µL), 1 µL T4 RNA ligase 2 trunkeras KQ (200.000 U/mL). Inkubera över natten vid 16 ° C.
  3. Nästa morgon, ta bort överskottet av adapter lägga till 0,5 µL 5'-deadenylase (10 U/µL) och 0,5 µL av Rec J exonuclease (10 U/µL) direkt till ligatur reaktionen. Inkubera i 30 min vid 30 ° C.
  4. Fällningen proverna. För detta, lägga till 30 µL nuclease-gratis vatten, 1 µL glykogen (10 mg/mL), 1/10 volym av NaOAc (pH 5,5) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.

6. omvänd Transkription

  1. Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning-spets. Luften torr pelleten i 10 min.
  2. Återsuspendera pelleten i 11,5 µL nuclease-gratis vatten, tillsätt 0,5 µL av 8 µM omvänd Transkription primer (RT primer) och 1 µL dNTP mix (10 mM). Inkubera i 5 min vid 65 ° C, plats på is.
  3. Tillsätt 4 µL av 5 X första strand buffert, 2 µL 0,1 M DTT, 0,5 µL av RNase inhibitor (20 U/µL), 0,5 µL av omvänt transkriptas (200 U/µL). Inkubera i 30 minuter vid 48 ° C, 1 min vid 65 ° C, 5 min vid 80 ° C.
  4. Inte fällningen och omedelbart gå vidare till hydrolys av RNA, genom att lägga till 0.8 µL av 2 M NaOH, inkubera 30 min vid 98 ° C. Tillsätt 0,8 µL 2M HCl för att neutralisera reaktion.
  5. Fällningen proverna.
För detta, tillsätt 20 µL av nuclease-gratis vatten, 1 µL glykogen (10 mg/mL), 1/10 volym av NaOAc (pH 5,5) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.
  • Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning-spets. Luften torr pelleten i 10 min.
  • Återsuspendera pelleten i 5 µL nuclease-gratis vatten, tillsätt 5 µL 2 X TBE-urea prov buffert. Inkubera 3 min vid 75 ° C, snurra ner, sätta på is för 1 min.
  • (Valfritt) Förväg kör en 10% TBE-karbamid gel på 180 V för 15 min använder 1 X TBE-buffert.
  • Fyll provet på 1 väl av 10% TBE-karbamid gel. Separata produkter av omvänd Transkription reaktionen med gelelektrofores på 180 V för 50 min. Som en kontroll, förbereda ett prov innehållande 1 µL 2,5 µM RT primer, 1 µL 2,5 µM 128 nt markör oligonukleotiden, 3 µL vatten, och 5 µL 2 X TBE-urea prova buffert och kör på en separat körfält av gelen.
  • Fläcken gelen för 5 min med en nukleinsyra gel fläck (utspädd 10.000 x i vatten), skyddas från ljus. Med hjälp av en blå ljus transilluminator, skär bandet runt 128 nt och högre (figur 5) med en ren rakblad. Frysa Polyakrylamidgelen bitar vid-80 ° C i minst 10 min.
  • Värm gelen bitar vid 70 ° C i 2min, slipa gelen med disponibla pellet mortlar. Eluera DNA med 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,0 och inkubera vid 37 ° C i 3 h.
  • Centrifugera provet vid 12 000 x g, i 5 minuter vid 4 ° C, samla supernatanten och fällningen volymprocent lägga 1/10 av NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.

    • 7. circularization

    1. Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning spets, och luften torr pelleten i 10 min.
    2. Återsuspendera pelleten i 16.75 µL nuclease-gratis vatten. Tillsätt 2 µL 10 x enkelsträngat DNA (ssDNA) ligase buffert, 1 µL 50 mM MnCl2, 0,25 µL ssDNA Ligase (100 U/µL). Inkubera i 1 h vid 60 ° C, 10 min vid 80 ° C. Inte fällningen och lagra ssDNA ligering reaktionsprodukten vid-20 ° C.

    8. PCR-bibliotek amplifiering

    1. Medan arbetar på is, blanda följande i en PCR-röret: 146 µL nuclease-gratis vatten, 2 µL 20 µM Forward primer, 2 µL 20 µM indexerade Reverse primer, 40 µL av 5 x HiFi-DNA plymerase buffert, 4 µL av dNTP (10 mM), 4 µL av ssDNA ligering reaktionsprodukt , och 2 µL av HiFi-DNA-polymeras. Välj en olika indexerade Reverse primer för varje prov som kommer att vara multiplexed för sekvensering. Över en 50 µL alikvot av PCR-blandningen in 4 nya PCR-rören.
    2. Utföra den PCR-amplifieringen med varierande antal cykler (8, 10, 12, 14) använder följande inställningar:
      1 min på 98 ° C inledande denaturering
      8 till 14 cykler:
      15 s vid 94 ° C
      5 s vid 55 ° C
      10 s vid 65 ° C
      2 min vid 65 ° C sista förlängning
    3. Fällningen PCR-produkten genom att lägga till 1/10 volym 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.
    4. Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning spets, och luften torr pelleten.
    5. Återsuspendera pelleten i 8 µL nuclease-gratis vatten, tillsätt 2 µL av icke-denatureringen 5 x nukleinsyra prov buffert. Fyll provet på 1 väl av en icke-denatureringen 8% TBE gel. Separata DNA produkter med gelelektrofores på 150 V för 35 min. Som en kontroll, ett prov som innehåller 0,5 µL 10 bp DNA stege (1 µg/µL), 7,5 µL vatten och 2 µL av icke-denatureringen 5 x nukleinsyra prov buffert, och kör på en separat körfält av gelen.
    6. Fläcken gelen för 5 min med en nukleinsyra gel fläck (utspädd 10.000 x i vatten), skyddas från ljus. Med hjälp av en blå ljus transilluminator, skär bandet runt 150 bp för fotavtryck prover och cirka 180 bp för mRNA prover (figur 6) med en ren rakblad. Lagra gel bitar vid-80 ° C i minst 10 min.
    7. Värm gelen bitar vid 70 ° C i 2 min, slipa gelen med disponibla pellet mortlar. Eluera DNA med 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,0 och inkubera vid 37 ° C i 3 h.
    8. Centrifugera provet vid 12 000 x g, i 5 minuter vid 4 ° C, samla supernatanten och fällningen volymprocent lägga 1/10 av NaOAc (pH 5,5), 1/100 volym av glykogen (10 mg/mL) och 2,5 volymer av 100% etanol. Inkubera vid-20 ° C under minst 1 h.
    9. Centrifugera proverna vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 ° C, ta bort etanol. Snurra ner 30 s vid max hastighet, ta bort resten av etanol med en gel-lastning spets, och luften torr pelleten. Slutligen Omsuspendera biblioteken i 20 µL av nuclease-gratis vatten och fortsätt att kvantifiering, kvalitetskontroll och sekvensering.

    9. bibliotek kvantifiering och hög genomströmning sekvensering

    1. Innan du skickar proverna för sekvensering, bestämma avkastningen och kvaliteten på PCR-förstärkta bibliotek. Representativa profiler för fotavtryck och mRNA sekvensering bibliotek visas i figur 7. Den förväntade storleken på PCR-förstärkta biblioteket är 148-152 bp för fotavtryck prover och 170-190 bp för mRNA prover.
    2. Om flera prover med olika streckkoder kommer att slås samman för sekvensering, utföra exakt kvantifiering av biblioteken med en qPCR-baserade sekvensering bibliotek kvantifiering analys.
    3. Pool, biblioteken i equimolar nyckeltal. Beräkna den totala volymen av poolen som 3 µL x totala antalet prov som slås samman. Bestäm volymen av varje bibliotek som behöver läggas så att biblioteken är blandade i de equimolar nyckeltal att uppnå 10 nM slutliga koncentration av poolen. Lägg de beräkna volymerna av varje bibliotek till en ny 1,5 mL tub, blanda genom pipettering. Tillsätt vatten för att uppnå den beräknade totala volymen. Lagra poolade bibliotek vid-20 ° C.
    4. Skicka en alikvot av poolade biblioteket till sekvenseras med 50 bp single-end sekvensering körs på en plattform för sekvensering av Illumina. Vi rutinmässigt multiplex 12 prover i en enda sekvensering kör, vilken avkastning ~ 200 miljoner läser per sekvensering körfält.
      Obs: Det slutliga antalet fotavtryck läsningar samlas in per varje prov beror på mängden tillskottsmaterial och av rRNA kontaminering.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Detaljerade rörledningar för bioinformatiska analyser av Ribosomen profilering data har tidigare beskrivits 8,9. Dessutom har flera forskargrupper utvecklat bioinformatiska verktyg för differentiell gen uttryck analys och bearbetning av sekvensering data som är specifika för Ribosomen profilering metod 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. Det första steget i analysen av Ribo-Seq data är demultiplexning och putsning 3' adapter sekvensen AGATCGGAAGAGCACACGTCT använder Cutadapt programvara 19. Sedan den sekvensering läser justeras mot icke-kodande RNAs, såsom rRNA och tRNA, med Bowtie 20 ta bort kontaminerande sekvenser, och läser att inte att rikta in mappas sedan till jäst genomet. Läs antal per gen kan då bedömas genom HTseq-räkna programvara 21och Differentiellt uttryckta gener identifieras genom DESeq2 22.

    Figur 8 visar representativa resultat av kvantitativ analys av översättning i hbs1Δ 23,24 jäst radering mutant som erhölls med våra protokoll. Först, bedömde vi antalet och andelen läsningar som motsvarar icke-kodande RNA (e.g. rRNAs) erhålls efter sekvensering fotavtryck och mRNA bibliotek genereras för vildtyp celler och hbs1Δ mutant. Vi fann att, även utan rRNA utarmning steg (diskuteras nedan), från 50 till 60% av alla sekvenserade läser i vårt fotavtryck bibliotek motsvarar Ribosomen-skyddade fotavtryck fragment (figur 8A). Däremot observerades endast 3% av rRNA-derived fragment i mRNA bibliotek visar att poly(A) mRNA isolering tillåter effektiv eliminering av rRNA läser. Tillsammans, vi kunde få mer än 10 miljoner fotavtryck läsningar för varje fotavtryck prov av sekvensering 2 replikat. För att bedöma variabilityen av bibliotek generation och reproducerbarhet av data, analyserar vi vanligtvis minst två oberoende biologiska replikat per varje experimentella villkor. Både fotavtryck och mRNA prov bibliotek visar bra reproducerbarhet med korrelationskoefficienten till Pearsons R ~ 0,99 mellan matchade prover (figur 8B).

    Förutom bedömningen av protein översättning på nivån genome-wide, kan ribosom profilering mäta förändringar i effektivitet mellan experimentella villkor 3. För detta används en alikvot av cellen lysate (inte behandlas med ribonunkleas) för poly(A) mRNA isolering och förberedelse av ett RNA-Seq bibliotek. Eftersom både fotavtryck och RNA-Seq biblioteket är beredda på samma kontrollerade villkor och kan spåras till varje enskild replikat, kan Ribo-Seq och RNA-Seq datamängder jämföras direkt för att identifiera gener som regleras av förändringarna i mRNA transkription, effektivitet eller genom en kombinerad effekt. För att identifiera gener som är upp - eller ner-regleras särskilt i nivå med protein översättning i hbs1Δ mutant, beräknade vi ändringar i översättning effektivitet genom att dividera fotavtryck rpkm värden med mRNA rpkm för var och en av generna (figur 8 c).

    Figure 1
    Figur 1: översikt över protokollet Ribo-Seq. Hela protokollet kan utföras i ungefär 11 dagar. Beräknad tid för varje steg visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2: beredning av sackaros övertoningar Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: representativa sackaros gradient profiler. (A) sackaros gradient profil erhålls för kontroll (inte behandlats med RNase jag) provet. (B) för att extrahera Ribosomen-skyddade RNA fragment, cell lysates behandlas med RNase jag för 1 h i rumstemperatur (RT). Fraktioner som motsvarar monosomal toppen samlas sedan för fotavtryck extraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: representativa bilder av de 15% polyakrylamidgeler erhålls efter T4 polynucleotide Kinas behandling. (A) storleken på exciderad gel skiva runt 28 och 32 nt visas för fotavtryck prover. (B) skär den gel bit om 50-70 nt för mRNA prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5: representativa bilder av de 10% polyakrylamidgeler erhålls efter omvänd Transkription. (A) skär övre bandet ~ 128 nt för fotavtryck prover, motsvarar produkten av omvänd Transkription. (B) klippa bandet runt 150-170 nt för de mRNA proverna (övre band). De lägsta banden motsvarar RT primer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 6
    Figur 6: Polyakrylamidgelen rening av PCR-förstärkta bibliotek. PCR-produkter som erhållits efter 8, 10, 12 och 14 cykler av bibliotek förstärkning har lösts på ett icke-denatureringen 8% TBE gel.Storleken på fullängds fotavtryck biblioteken är ~ 150 bp, medan storleken på mRNA bibliotek är ~ 170-190 bp. undvika det lägre bandet som inte innehåller infoga.

    Figure 7
    Figur 7: Bioanalyzer analys. (A) representant Bioanalyzer profiler av PCR-förstärkta fotavtryck biblioteket. Den genomsnittliga storleken på fotavtryck biblioteket är väntat till vara från 148 till 152 nt. (B) representant Bioanalyzer profiler av sekvensering biblioteket erhålls mRNA proverna. Den förväntade storleken på mRNA biblioteket är 170-190 nt. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

    Figure 8
    Figur 8: representativa resultat. (A) antalet mRNA, fotavtryck och rRNA läsningar som erhållits för vildtyp prov och hbs1Δ mutant. Kombinerade antalet läsningar som genereras av sekvensering två biologiska replikerar visas för vildtyp celler och hbs1Δ mutant. (B) reproducerbarhet fotavtryck och mRNA-överflöd mätningar mellan två replikerar. Pearson korrelationskoefficienten (R) indikeras. (C) Transcriptional och translationell förändringar i hbs1Δ mutant. Betydligt grupperas uppreglerat och down-reglerade gener i hbs1Δ i enlighet med om de påverkas av en förändring i mRNA transkription, effektivitet eller en kombinerad effekt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Grundfärger Sekvens Index
    3' adapter (100 ng/µL) / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC /
    RT primer pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    Framåt PCR-primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG
    Indexera primer 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ATCACG
    Indexera primer 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT CGATGT
    Indexera primer 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TTAGGC
    Indexera primer 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TGACCA
    Indexera primer 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ACAGTG
    Indexera primer 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT GCCAAT

    Tabell 1: 3' Adapter och primer sekvenser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Metoden med Ribo-Seq har vuxit fram som en kraftfull teknik för analys av mRNA översättning i vivo på genome-wide nivå 3. Studier med hjälp av denna metod, som tillåter övervakning översättning med singel-kodon upplösning, har bidragit till vår förståelse för translationell förordning. Trots sina fördelar har Ribo-Seq flera begränsningar. Ribosomalt RNA (rRNA) fragment är alltid Co renat under isolering av Ribosomen-skyddade fotspår minskar avkastningen av användbar sekvensering läsningar som kan erhållas i Ribo-Seq experiment 9,25. Våra data visar att rRNA kontaminering kan bidra till så många som 40-50% av alla läser (figur 8). Ett sätt att övervinna denna begränsning är att öka sekvensering djupet. Ytterligare rundor av sekvensering bör utföras tills antalet krävs för sekvensering läsningar uppnås för var och en av de analyserade proverna. Analys av sekvensering biblioteken tillagas med vårt protokoll visar att mer än 5 miljoner fotavtryck läsningar kan erhållas för varje fotavtryck bibliotek, när 12 prover är multiplexed tillsammans i en standard 50-bp single-end körs på Illumina HiSeq 2000-plattformen. Men om betydande förorening med rRNA observeras, kan ett valfritt rRNA borttagning steg utföras.

    En av strategierna att ta bort rRNA kontaminerande fragment från fotavtryck bibliotek är att använda subtraktiv hybridisering med de biotinylerade oligonukleotider som tidigare beskrivits 8,26,27. Alternativt, rRNA kontaminerande läsningar kan tas bort med hjälp av kommersiellt tillgängliga rRNA utarmning kit. För detta, kan forskare utföra rRNA utarmning på renat 3'-adapter-sammanskrivna fotavtryck fragment från steg 5.4. Följande rRNA utarmning, fotavtryck prover kan fällas ut och användas direkt för omvänd Transkription (steg 6) som beskrivs i protokollet.

    Förutom att rening av monosomes som använder sackaros gradient fraktionering beskrivs i våra protokoll, flera metoder har utvecklats som utnyttjar en kolumnbaserade rening 28 och ultracentrifugering genom en sackaros kudde 8 ,29. Medan dessa metoder kan påskynda processen av fotavtryck bibliotek förberedelser och är mindre tekniskt utmanande jämfört med sackaros gradient fraktionering, tillåter de inte kvalitativ analys av de renade monosomes och effektiviteten i nuclease matsmältningen steg. Valet av nuclease har nyligen visat sig påverka effektivitet rening av Ribosomen-skyddade RNA fragment i olika arter 30. Medan RNase har robust aktivitet i jäst cell lysates, dess aktivitet har visat sig påverka integriteten för ribosomer i mus vävnader samt som bananflugor. Val och koncentrationen av nuclease bör därför optimeras vid antagandet av detta protokoll till andra arter.

    Ett annat viktigt övervägande är användningen av de översättning-hämmare. De flesta protokoll för Ribosomen profilering omfattar vanligtvis behandling av celler med töjning-hämmare, såsom Kungliga Automobilklubben eller harringtonine, för att förhindra avrinningen av ribosomer under cellen skörd 3. En av begränsningarna av användningen av översättning-hämmare är att droger diffusa successivt i cellen, inducera en progressiv hämning av ribosomer 31. Dessutom hämmar droger inte översättningen inledandet eller uppsägning. Följaktligen, ribosomer oproportionerligt samlas på den start-kodon och är uttömda på stop kodon 8,27,31. För att begränsa denna artefakt, valde vi att flash frysa cellerna i flytande kväve och behandla med Kungliga Automobilklubben vid tidpunkten för utvinning i lyseringsbuffert endast.

    Trots ett relativt stort antal rapporter som har använt Ribo-Seq i olika arter, saknas standardiserade protokoll för att utföra Ribo-Seq analys. Följaktligen kan inte direkt jämföras Ribo-Seq data som genereras av olika labs. Exempelvis avslöjat jämförelse av publicerade Ribosomen profilering datamängder betydande skillnader i resultat mellan studierna 32. Detta beror delvis på kontinuerliga förbättringar som har gjorts som protokoll utvecklats under de senaste åren. Dessutom modified många forskare Ribosomen profilering protokoll för att anta det särskilda behov av deras studie eller modell system 9,25. Ytterligare standardisera Ribosomen profilering protokoll samt skulle som dataanalys och normalisering, tillåta att förhindra några av de experimentella fördomar och garantera exakt och reproducerbar kvantifiering av i vivo översättning.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

    Acknowledgments

    Detta arbete stöds av de National institutionerna of Health bidrag AG040191 och AG054566 att VML. Denna forskning utfördes medan VML var en AFAR forskningsbidrag mottagaren från det amerikanska förbundet för åldrande forskning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
    0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
    0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
    10X TBE buffer Invitrogen AM9863
    10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
    15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
    2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
    2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
    3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
    5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
    8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
    Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
    Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
    Cryogrinder Biospec product 3110BX
    Cycloheximide RPI C81040-5.0
    Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
    Glycogen Invitrogen AM9510
    Gradient fractionation system Brandel BR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
    Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
    Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
    Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
    RNA fragmentation buffer NEB E6186A
    RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
    Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
    ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
    Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
    Sucrose RPI S24060-5000.0
    SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
    Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
    T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
    Thermal cycler Bio-Rad 1851148
    Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
    Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
    UV monitor Bio-Rad 7318160
    Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

    Tags

    Fråga 130 översättning RNA biokemi ribosom profilering nästa generations sekvensering RNA-sekvensering Saccharomyces cerevisiae
    Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi,… More

    Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter