Summary
Protokolle für die Europäischen Aals Reifung und Sperma Kryokonservierung wurden in den letzten Jahren verbessert. Dieser Artikel beschreibt die beste Protokoll über humanes Choriongonadotropin (hCG) zur Induktion Reifung und Methanol als Kryoprotektivum verfügbar.
Abstract
In den letzten Jahren haben mehrere Forschungsgruppen an der Entwicklung und Verbesserung neuer Protokolle für den europäischen Aal Umgang und Reifung gearbeitet. Als der noch, erwiesen wöchentliche Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) sich Männchen nur 5-6 Wochen nach Behandlungsbeginn, produzieren große Mengen an qualitativ hochwertigen Spermien während mehrerer Wochen argumentativ. Darüber hinaus wurden Sperma Kryokonservierung Protokolle mit verschiedenen Extendern, Kryoprotektanten und Kühlung und Auftauen Mal zuvor für europäische Aal beschrieben. Hier zeigen wir, dass Tanaka´s Extender Lösung direkt verwendet werden kann, für die Befruchtung oder für die Kryokonservierung, wodurch erübrigt die Verwendung von verschiedenen Arten von Lösungen und Verdünnungen. Die Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum macht dieses Protokoll darüber hinaus einfach zu bedienen wie Methanol hat eine geringe Toxizität und die Spermien nicht aktivieren. Das Sperma muss nicht sofort nach der Zugabe der Kryoprotektivum kryokonserviert werden, und es kann verwendet werden, lange nach aufgetaut werden. Darüber hinaus ist Beweglichkeit der Spermien nach dem Auftauen zwar geringer als die von frischem Sperma nach wie vor hoch. Das Ziel dieser Arbeit soll das verfügbare Protokoll für europäische Aal Handling, Reifung und Kryokonservierung von Spermien zeigen.
Introduction
In den letzten 25 Jahren haben die Anzahl der europäische Aal (Anguilla Anguilla) an der europäischen Küste ankommen um 90 % 1,2,3stetig abgenommen. Es gibt mehrere Faktoren, die diese drastischen einschließlich Infektionen, Verschmutzung, Überfischung und Zerstörung von Lebensräumen zu erklären. All dies hatte einen profunden Effekt auf dieser Art, führt die Einbeziehung des Europäischen Aals auf der International Union for Conservation of Nature (IUCN) Liste als kritisch gefährdet 4. Die Entwicklung der Techniken und Protokolle für die Fortpflanzung in Gefangenschaft sind daher notwendig.
Die Reifung des Europäischen Aals in Gefangenschaft wird durch hormonelle Behandlung 5,6,7 erreicht, aber die Produktion von Gameten bei beiden Geschlechtern ist schwierig, 8synchronisieren. Obwohl die Entwicklung neuer Androgen Implantate zeigt Oogenese in Aalen 9,zu beschleunigen ist10, das Timing der endgültige Reifung bei Frauen immer noch höchst variabel und schwierig zu steuern, 11. Daher sind kurzfristiger Lagerung von Samenzellen 12,13,14 und Kryokonservierung Techniken für Reproduktionsmanagement machen Gamete Synchronisation unnötige 8notwendig.
Kryokonservierung von Spermien des Europäischen Aals wurde seit 2003 15,16entwickelt. Mehrere Forscher entwickelt erfolgreiche Protokolle mit Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Methanol als Kryoprotektanten 16,17,18,19,20. Obwohl beide Protokolle erfolgreich im Einsatz sind, ist die erhaltene Zellviabilität aufgetauten Spermien kryokonserviert mit DMSO geringer als bei Methanol 20,21. Darüber hinaus Aal Sperma wird bei Kontakt mit DMSO aktiviert und erfordert mehr mühsam Sperma Manipulation 19, Methanol ist daher ein geeigneter Kryoprotektivum für europäische Aal Spermien als DMSO.
Hier wird das Protokoll für optimales Handling und hormonelle Behandlung des Europäischen Aals beschrieben werden. Darüber hinaus werden auch die besten Europäischen Aals Sperma Kryokonservierung Protokoll unter Verwendung von Methanol als einem Kryoprotektivum und ein Protokoll für die Beurteilung der Qualität der Spermien in dieser Spezies beschrieben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren für die Arbeit mit Europäischen Aals beschrieben in diesem Protokoll wurden genehmigt durch den Ausschuss der Ethik der Tier Experimente an der Universitat Politècnica de València, nach den spanischen Gesetzen und Vorschriften kontrollieren die Experimente und Verfahren an lebenden Tieren.
1. Fisch-Wartung
- Bringen Sie die Europäischen Aale in einer Forschungseinrichtung und steckte sie in ein 200 L-Aquarien mit einem Kreislaufsystem. Verwenden Sie Thermostate und Kühler, um eine Temperatur von konstant 20 ° C zu halten.
- Halten Sie den Fisch bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Stress22 und nichts zu essen während des Experiments.
- Halten Sie die Fische im Süßwasser in den ersten 3 Tagen. Dann 1/3 des Wassers ändern und füllen Sie mit Meerwasser täglich bis zu einem Salzgehalt von 37,0 ± 0,3 g/L.
2. hormonelle Behandlung
Hinweis: Die hormonelle Behandlung besteht aus wöchentlichen Injektionen von humanes Choriongonadotropin (hCG) während der gesamten Dauer des Experiments (9 Wochen).
- Bereiten Sie das hCG Hormon im Voraus in einer Konzentration von 1 IU/µL durch verdünnen das Hormon in Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
Hinweis: Das Hormon kann beibehalten werden verdünnt bei dieser Konzentration für über eine Woche bei-18 ° C. - Um die Fische zu betäuben, bereiten Sie einen 40 L flexibler Eimer mit 5 L Wasser.
- Verdünnen Sie in einem 250 mL-Kolben 300 mg Benzocain in 100 mL 70 % igem Ethanol.
- Gießen Sie die verdünnte Benzocain in den Eimer (Endkonzentration 0,36 mM) und gut mischen. Dies ist für eine endgültige Benzocain Konzentration von 60 mg/L.
- Übertragen Sie die Fische einzeln, mit Benzocain ins Wasser und warten Sie einige Sekunden, bis die Benzocain wirkt und die Fische richtig betäubt.
Hinweis: Um zu bestätigen, dass die Fische betäubt ist, legen Sie den Fisch in Rückenlage und überprüfen Sie, ob es noch in dieser Position bleibt.
- Verwalten das Hormon, wiegen die Fische und das hCG Hormon in einer Dosis von 1,5 IU/g Fisch in 1,5 mL Kunststoffhülse vorbereiten.
- Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit dem hCG-Hormon aus dem Kunststoffrohr.
- Legen Sie den betäubten Fisch in Rückenlage und mit der Hilfe oder der Spritze, injizieren Sie das Hormon sorgfältig im Bereich intraperitoneal zu.
- Die Aquarien die Fische wieder und überwachen sie bis vollständig erholt.
Hinweis: Die hormonelle Verwaltung muss wöchentlich in das Experiment durchgeführt werden. Normalerweise beginnen die Europäischen Aale Spermating nach 6-7 Wochen hormonelle Behandlung.
(3) Spermien Sampling
- Um die beste Qualitätsproben zu erhalten, extrahieren Sie Sperma 24 h nach der hormonellen Verwaltung6,23.
- Den Fisch mit Benzocain zu betäuben, wie unter Punkt 2.2 beschrieben.
- Legen Sie den betäubten Fisch in Rückenlage, reinigen Sie den Genitalbereich mit einem Spritzer von destilliertem Wasser und trocknen mit Papier, Kot Kontamination in den Genitalbereich oder versehentliche Sperma Aktivierung durch Kontakt mit Meerwasser aus dem Aquarien zu vermeiden.
- Platzieren die Finger auf beide Seiten des Fisches, massieren Sie vorsichtig drücken seitlich aus der Brustflossen im Genitalbereich, das Sperma heraus zu zwingen.
- Wiederholen Sie die Massage, bis keine mehr Sperma aus der Geschlechtsöffnung kommt.
- Sammeln Sie das Sperma in 15 mL-Kunststoff-Rohre mit Hilfe einer Vakuumpumpe.
- Verdünnen Sie die extrahierten Sperma 01:10 in veränderter Tanaka´s Extender Lösung24 (137 mM NaCl, 76,2 mM Nahco33, in destilliertem Wasser) bei 4 ° c.
Hinweis: Das Sperma in die Extender-Lösung bei 4 ° c aufzubewahren.
(4) Bewertung der Qualität der Spermien
- Bereiten Sie künstliche Meerwasser13 (in mM: NaCl 354.7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28,2, KCl 9.4, in destilliertem Wasser) mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) (W:v), pH-Wert, 8.2, Osmolalität auf 1100 mOsm/kg einstellen und pflegen es bei 4 ° c, um bakterielles Wachstum zu vermeiden.
- Öffnen Sie die Software für computergestützte Spermiogramm (CASA), und wählen Sie das Fisch-Sperma-Modul.
- Klicken Sie auf Eigenschaften , um das System-Setup der Software zu öffnen. Dort legen Sie die Capture-Optionen mit 60 Bildern pro Sekunde. Wählen Sie negative Phase Optik, Makler-Kammer und 10 X-Skalierung.
- Wählen Sie dann auf die Analysewerte Fisch als Spezies und Partikel Bereich größer als 2 µm2 und kleiner als 20 µm2.
- Auf die Parameter Geschwindigkeit festgelegt zu langsam , wenn Zellen bewegen sich zwischen 10 und 45 µm/s, auf Mittel , beim Wechsel zwischen 45 und 100 µm/s festgelegt und setzen Sie auf schnelle wenn schneller als 100 µm/s bewegen.
Hinweis: Spermien mit Geschwindigkeit langsamer als 10 µm/s unbewegten galten. - Wählen Sie die progressive Werte als 80 % der Geradheit (STR) und speichern Sie die Eigenschaften.
- Klicken Sie auf Feld zu erfassen (öffnet ein Fenster mit der live-Bilder von der Kamera werden).
Hinweis: Das EDV-gestützte Sperma-Analyse-System wird durch ein Mikroskop, eine Kamera und eine Bildanalyse-Software gebildet.
- Auf der Zählkammer 4 µL von künstlichem Meerwasser und fügen Sie 0,5 µL Lösung Spermien (Spermien mit Extender-Lösung verdünnt hinzu).
- Konzentrieren Sie das Bild mit der Lupe bei 10facher Vergrößerung in der negativen Phase. 15 s nach der Aktivierung, klicken Sie auf erfassen - Video in das EDV-gestützte Sperma-Analyse-Software.
- Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung und wählen Sie Proben mit einem Motilität höher als 70 % für die Kryokonservierung.
Hinweis: Es ist sehr wichtig, nur qualitativ hochwertige Spermien für den Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung auszuwählen.
(5) Sperma Einfrieren Methode
- Bereiten Sie vorab Flüssigstickstoff (ca. 2,5 L) in ein 34 x 34 cm x 30 cm und 5 cm dicken Styropor-Box.
Hinweis: Aufrechterhaltung eines flüssigen Stickstoff von 4-5 cm Höhe zu allen Zeiten.- Bauen Sie eine schwebende Struktur, um die Spermien vorher einfrieren. Verwenden Sie 2 Stück Styropor (20 x 5 cm) zu, mit 2 Kunststoff-Rohre zu binden Sie und legen Sie die Struktur auf dem flüssigen Stickstoff. Diese Struktur muss über den flüssigen Stickstoff in einer ungefähren Höhe von 3 cm über der Oberfläche (Abbildung 1) schweben.
Abbildung 1 . Schematische Zeichnung der schwimmenden Struktur zum vorab Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Die Struktur besteht aus zwei Stücken mit geringer Dichte Styropor 20 cm x 4 cm x 5 cm verbunden mit Kunststoff-Rohre von 14 cm. Die Halme sind über die Kunststoffrohre 3 cm über dem flüssigen Stickstoff gelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Bereiten Sie die Kryokonservierung Lösung durch Mischen von Spermien, Extender-Lösung und Methanol im Verhältnis 1:8:1 in 1,5 mL Kunststoff Rohre und vorsichtig umrühren.
- Mit Hilfe einer Pipette 480 µL der Kryokonservierung Lösung in 500 µL Strohhalme hinzufügen und bei Bedarf durch die Schließung ein Ende mit Modelliermasse markieren.
- Setzen Sie das Stroh auf dem schwimmenden Gerät in einer Höhe von 3 cm über dem flüssigen Stickstoff für 3 min. Dann setzen Sie das Stroh in den flüssigen Stickstoff.
- Übertragen Sie nach 10-15 min die Strohhalme in einen flüssigen Stickstoff Vorratstank mit lange Pinzette und halten sie jederzeit in flüssigen Stickstoff getaucht. Hier können die Spermien auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
(6) Auftauen Methode
- Vorbereiten einer Styropor-Box mit flüssigem Stickstoff, wie im Schritt 5.1 beschrieben, und bereiten ein Wasserbad mit ein 3 L Becherglas mit Leitungswasser bei 40 º c.
- Übertragen Sie die Strohhalme mit gefrorenen Spermien aus dem Speichertank in Styropor-Box mit flüssigem Stickstoff mit lange Pinzette.
- Setzen Sie jeden Strohhalm in einem Wasserbad bei 40 º c für 13 s.
- Gießen Sie das Sperma in ein Kunststoffrohr 1,5 mL durch die geschlossenen Enden des Strohs mit einer Schere schneiden.
- Analysieren Sie Samenzellenmotilität mit computergestützten Sperma-Analyse-System, wie im Schritt 4.1 erläutert.
- Halten Sie 100 µL der Spermien, die Lebensfähigkeit der Spermien mit einem Durchflusszytometer zu analysieren.
7. die Durchflusszytometrie
- Verwenden Sie eine fluoreszierende Kit mit Propidium Jodid (PI), das ist eine rote fluoreszierende Substanz, die Flecken die Kerne von abgestorbenen Zellen und eine Membran-permeationsfähigen nuklearen fluoreszierende Verbindung, dass grüne Flecken die Kerne von lebenden Zellen.
- Bereiten Sie das grün fluoreszierende Färbelösung durch Verdünnung aus der Stammlösung (1 mM) 01:10 in Tanaka´s Medium, eine funktionierende Lösung von 100 µM.
- Verdünnen Sie die PI-Lösung nicht. Die Stammlösung liegt bei 2,4 mM.
- Für jede Probe nehmen 50 µL der frischen oder aufgetauten Spermien und fügen Sie 0,5 µL grün fluoreszierende arbeiten Färbelösung (Endkonzentration 1 µM) und 2 µL der PI-Lösung (Endkonzentration 100 µM).
- Inkubieren Sie die Proben, die die Farbstoffe (PI und grüne fluoreszierende Färbung) in der Dunkelheit für 5 min.
- Die Proben in 500 µL Tanaka´s Extender Lösung verdünnen und mit dem Durchflusszytometer analysiert.
- Schalten Sie das Durchflusszytometer und erstellen Sie ein neues Protokoll mit mindestens 2 Grundstücke: SS melden Vs FS Log und FL1 Vs FL3.
Hinweis: Beide, grüne fluoreszierende Färbung und Propidium Jodid mit Wellenlänge sichtbaren Lichts angeregt werden kann. Wenn Sie an DNA gebunden, die maximale Fluoreszenzemission dieser Farbstoffe sind 516 nm und 617 nm, beziehungsweise.- Passen Sie die Spannungen der verschiedenen Laser: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Einrichten der Erwerb Einstellungen Accord auf maximale Ereignisse = 5000 oder 15 s (die Endkonzentration der Probe sollte etwa 1 Million Zellen/ml). Lesen Sie die Probe mit einem LOW -Flow.
- Wählen Sie den Lesemodus Single Tube Positions-Modus behoben.
- Legen Sie die Probe in die richtige Anzahl an das Karussell
- Lesen Sie die Probe (Drücken von F9) und speichern Sie die Daten in eine Excel-Datei (durch Drücken von F7) zur weiteren Analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperma aus 18 Aale mit einer Beweglichkeit der Spermien von 70 % oder höher, wurde für diese Studie ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion alle Qualitätsparameter nach dem Auftauen im Vergleich zu denen von frischem Sperma (Tabelle 1 und Abb. 2). Die Ergebnisse der Motilität (bedeuten ± S.E.M, n = 18) zeigten eine höhere Summe Motilität und eine progressive Motilität in frisches Sperma als die totale Motilität und progressive Motilität in der Post-Tauwetter Spermaproben gefunden.
Das gleiche Muster wurde in der Analyse der schnelle Spermien gefunden wo aufgetauten Proben ein niedrigeres Verhältnis von schnell Zellen als frische Proben vorgestellt. Die Samenzelle Geschwindigkeiten gemessen wurden darüber hinaus auch in den nach dem Auftauen Proben reduziert.
Auch Ergebnisse zeigten, dass Zellviabilität nach dem Auftauen eine Verringerung live Spermien von 23 ± 3,1 % vorgestellt (meine ± S.E.M, n = 18) aus frisch aufgetauten Proben (Tabelle 1 und Abb. 2).
Abbildung 2 . Motilität, krummlinigen Geschwindigkeits- und Lebensfähigkeit Zellendaten frisches Sperma und aufgetauten Spermien (nach Kryokonservierung). Das Sperma war für 24 h kryokonserviert, bevor Sie aufgetaut werden. Die dargestellten Werte sind Mittel ± S.E.M Sperma aus 18 Proben. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen aufgetaut und frische Proben (t-Test, p < 0,05). Die Parameter-Motilität angegeben Prozentsatz von total bewegliche Spermien, krummlinigen Geschwindigkeit die durchschnittliche Geschwindigkeit der Spermien entlang einer gekrümmten Flugbahn, und Zellviabilität gekennzeichnet den Anteil der Spermien lebendig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Schnell + mittlere Zellen1 (%) | 70,7 ± 2,8 | 27.5 ± 2.1* |
| Krummlinigen Geschwindigkeit (VCL; µm/s) | 118,8 ± 2,8 | 101,5 ± 1.8* |
| Geraden Linie Geschwindigkeit (VSL; µm/s) | 53.3 ± 1,9 | 45,6 ± 1.3* |
| Durchschnittliche Bahngeschwindigkeit (VAP; µm/s) | 73.3 ± 2,1 | 62,0 ± 1.3* |
| Sieg gegen cross-Frequenz (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0,6 |
| Zellviabilität (% lebendig Zellen) | 97,7 ± 0,3 | 73,8 ± 2.8* |
| 1 Zellen mit krummlinigen Geschwindigkeit über 40 µm/s. | ||
Tabelle 1. Zusammenfassung der Ergebnisse der verschiedenen Parameter mit computergestützten Sperma-Analyse-System aus frischen und aufgetauten Proben analysiert. Aufgetaute Proben wurden bisher für 24 h kryokonserviert. Alle Werte präsentiert, wie meine ± S.E.M (n = 18). Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen aufgetaut und frische Proben (t-Test, p < 0,05). Die analysierten Parameter waren: bewegliche Spermien definiert als der Anteil der gesamten bewegliche Zellen; Progressive Motilität definiert als Anteil der Spermien, die eine im Wesentlichen geradlinig nach vorne schwimmen; schnelle und mittleren Zellen definiert als Anteil der Spermien mit einer krummlinigen Durchschnittsgeschwindigkeit über 40 µm/s; krummlinigen Geschwindigkeit definiert als die durchschnittliche Geschwindigkeit eines Spermiums durch seine gekrümmte Flugbahn; geraden Linie Geschwindigkeit definiert als die durchschnittliche Geschwindigkeit eines Spermiums gemessen von der ersten gefundenen Position zu seiner letzten Position in einer geraden Linie; durchschnittliche Bahngeschwindigkeit als Durchschnittsgeschwindigkeit eines Spermiums entlang seiner räumlichen durchschnittliche Flugbahn definiert; schlagen Kreuz Frequenz definiert als der durchschnittliche Zinssatz, an dem der krummlinigen Sperma Kopf Flugbahn seine durchschnittliche Pfad Flugbahn kreuzt; Zellviabilität definiert als Anteil der Spermien lebendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Prozess für die Europäischen Aals Reifung, Handhabung und Sperma Kryokonservierung. Die hier beschriebenen Haltungsbedingungen sind optimal für schnelle Reifung und Produktion von großen Mengen von qualitativ hochwertigen Spermien in dieser Spezies 6,7,25. Der Erfolg dieses Protokolls Kryokonservierung und seine mögliche Verwendung für die Befruchtung nach dem Auftauen hängen stark von der Qualität von frischem Sperma 26. Daher ist die Auswahl an qualitativ hochwertigen Spermien von großer Bedeutung. Beachten Sie, dass die Bewertung der subjektiven Spermien-Qualität hängt davon ab, die Fähigkeiten, Wahrnehmung und Schulung des Forschers, wertet der Proben 5,27,28 und führen zu sehr unterschiedlichen Qualität Schätzungen je nach die Forscher 29. Daher empfiehlt die Verwendung der computerunterstützten Spermiogramm, die beste Qualitätsproben für die Kryokonservierung auszuwählen.
Ergebnisse nach dem Auftauen Spermienqualität präsentiert hier verzeichneten einen Rückgang in den Parametern der Motilität, Geschwindigkeit und Überleben der Zellen. Dies ist konsistent mit der verfügbaren Literatur, obwohl gibt es große Unterschiede zwischen den Arten 26,30. Zum Beispiel in einer Studie mit Atlantischem Lachs (Salmo salar), wurde frisches Sperma mit einem Motilität von 70-95 % mit verschiedenen Kryoprotektanten (DMSO und Methanol) eingefroren. Die Beweglichkeit der Spermien nach dem Auftauen war signifikant niedriger als in frische Proben mit Motilität Werte in das beste Protokoll von 8,2 %, doch mit aufgetauten Spermien Befruchtungsrate war so hoch wie 42,8 %, 95 % der Kontrolle (frisches Sperma) 31vertreten. In einer anderen Studie mit den Spermien des Atlantischen Heilbutt (Hippoglossus Hippoglossus), ergab keine signifikante Reduktion in der Beweglichkeit der Spermien nach Kryokonservierung und Befruchtungsrate mit aufgetauten Spermien lag bei über 95 % 32.
In europäischen Aal zeigten frühere Studien auch eine Reduktion Beweglichkeit der Spermien nach Kryokonservierung unabhängig von dem Kryoprotektivum 16,18verwendet. Darüber hinaus hat kryokonservierte Spermien aus europäischen Aal ähnlicher Qualität für Befruchtung 8erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie verwendeten Asturiano Et Al. DMSO als das Kryoprotektivum. Die Verwendung von DMSO hat einige Manipulation Nachteile, da diese Kryoprotektivum Spermien aktiviert und muss daher sofort nach Zugabe von DMSO eingefroren werden. Auch die Insemination mit aufgetauten Spermien muss sofort nach dem Auftauen durchgeführt werden. Die Abnahme des pH-Wertes Sperma teilweise dieses Problem 19lösen kann, aber das Protokoll ist empfindlicher als das Protokoll hier mit Methanol als Kryoprotektivum vorgestellt.
Mehrere Studien zeigten positive Ergebnisse unter Verwendung von Methanol als das Kryoprotektivum. Zum Beispiel in einer Studie mit japanischer Aal (Anguilla Japonica) mit einem sehr ähnlichen Protokoll mit dem hier vorgestellten, mit 10 % Methanol als Kryoprotektivum, befruchtet die Autoren erfolgreich Eiern mit frischen und kryokonservierten Spermien. In dieser Studie erhielten sie Befruchtung in Höhe von 17 % ohne signifikante Unterschiede zwischen frischen und kryokonservierten Samenzellen 33.
Die hier vorgestellten Protokoll erwies sich als erhalten ausreichende Qualität der Spermien nach dem Auftauen und zeigen ähnliche Eigenschaften wie Spermien nach dem Auftauen als Protokolle mit verschiedenen Extender und Kryoprotektanten, aber mit den Vorteilen der Pre-einfache Handhabung und Post-Kryokonservierung. Es ist sehr wichtig, genau zu folgen, die Kühlung und Auftauen Mal hier beschrieben, sowie mit qualitativ hochwertigen Spermien. In zukünftigen Studien werden unter Verwendung dieses Protokolls Befruchtung Studien getestet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Publikation wurde gefördert durch die Europäische Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter der Marie Sklodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung keine 642893 (IMPRESS), das Amt Kosten (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) und das Research Centre of Excellence- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
